河南科技大學(xué)微生物工程學(xué)第二章菌種2、3節(jié)課件

1、第二節(jié) 菌種來源Chapter 1 continued一、分離與篩選的設(shè)計(jì)要求1.在篩選所需菌株時(shí)應(yīng)考慮以下一些重要指標(biāo)：1、菌的營(yíng)養(yǎng)特征一般要求采用廉價(jià)的培養(yǎng)基或使用來源豐富的原料2、菌的生長(zhǎng)溫度(較高溫)3、菌的穩(wěn)定性(連續(xù)幾代)4、菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度5、菌對(duì)所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性6、容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物3-6是用來衡量菌種的生產(chǎn)性能，如能滿足這幾條，便有希望成為效益高的生產(chǎn)菌株1.菌種分離的一般過程(引入選擇壓力)樣品的采取 預(yù)處理 富集培養(yǎng) 菌落的選擇 產(chǎn)品的鑒定目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物二、菌種分離與篩選工作程序2.培養(yǎng)分離中要解決的問題“分離

2、什么和從哪里分離出?” 必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力、生長(zhǎng)速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費(fèi)用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測(cè)方法。三、含微生物樣品的采集較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐富、 5-25cm、土質(zhì)、酸堿度、植被狀況、地理?xiàng)l件、季節(jié)）食品 、海水、動(dòng)物、植物、極端環(huán)境 根據(jù)微生物的營(yíng)養(yǎng)類型采樣森林土中有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的木頭，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)。肉類加工廠附近、飯店排污溝，易分離到蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌。面粉加工廠等場(chǎng)所易分離到產(chǎn)淀粉酶、糖化酶的菌根據(jù)微生物的生理特性采樣篩選

3、高溫酶產(chǎn)生菌通常從溫泉、火山爆發(fā)處、堆肥等采樣；篩選產(chǎn)低溫酶的微生物，可從冰窖、南極、深海等采樣分離耐高滲透壓酵母菌，可到甜果、蜜餞、甘蔗渣堆積處采樣側(cè)柏毛蟲四、含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集(enrichment)培養(yǎng) 是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長(zhǎng)繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利分離到所需的菌株。 其要領(lǐng)是提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌型生長(zhǎng)的條件，例如，供給特殊的基質(zhì)或加入某些抑制劑?？刂蒲蹩蓪⒑醚跷⑸锖蛥捬跷⑸锓珠_；高溫下培養(yǎng)可將嗜熱微生物和非嗜

4、熱微生物分開；控制pH可分離嗜酸或嗜堿微生物；高糖或高鹽培養(yǎng)基可分離耐高滲透壓微生物；在分離培養(yǎng)中加入抗生素或某試劑可增加選擇性 如分離真菌可在土豆培養(yǎng)基中加入鏈霉素； 分離細(xì)菌或放線菌可在培養(yǎng)基中加入制霉菌素等 重復(fù)移植幾次后接種少量已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基上。 移植時(shí)間是關(guān)鍵，應(yīng)在所需菌種確已占優(yōu)勢(shì)的情況下進(jìn)行。 分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法初篩 在選擇培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈2、變色圈法 對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使目的微生物菌落周圍呈現(xiàn)變色圈，從而能被快速鑒別出

5、來； 用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對(duì)含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長(zhǎng)成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會(huì)出現(xiàn)絳紅色水解圈。如 篩選果膠酶產(chǎn)生菌甘油三丁酸酯為底物羅丹明B為指示劑熒光圈又如 分離解脂微生物豆油作底物中性紅（紅黃. 6.88.0. ）指示菌落周圍呈紅色圈 透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因?yàn)樵谏顚优囵B(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。 但作為初篩的手段是有意義的第三節(jié) 菌種選育菌種選育 應(yīng)用微生物遺傳和變異理論，用人工方法(或自然)造成變異，再經(jīng)過篩選以得到人們所需菌種的過程 。 菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)

6、產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加新產(chǎn)品和適應(yīng)工藝改革的要求。 菌種選育的方向是選育“吃粗糧”、耐高溫、生長(zhǎng)快、代謝旺、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、無(wú)毒性的優(yōu)良菌株。自然選育誘變育種雜交育種 (有性、準(zhǔn)性)原生質(zhì)體融合育種基因工程育種一、自然選育 在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程叫自然選育。 自發(fā)突變(spontaneous mutation)，也稱自然突變，指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變，但這決不意味著這種突變是沒有原因的。 一般認(rèn)為引起自然突變有兩個(gè)原因：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。 多因素低劑量的誘變效應(yīng)是指自然突變實(shí)際上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變

7、因素引起的長(zhǎng)期綜合效應(yīng)，例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)（基站、地板磚）自身代謝活動(dòng)中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)（如過氧化氫等）自然突變兩種情況： 生產(chǎn)上所不希望的：菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量下 降 對(duì)生產(chǎn)有益的： 生產(chǎn)性能提高制備單孢子（單細(xì)胞）懸液 適當(dāng)稀釋在固體平板上分離挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定經(jīng)反復(fù)篩選以確定生產(chǎn)能力更高的菌株替代原來的菌株自然選育的一般程序： 自然選育簡(jiǎn)單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。（逆水行舟，不進(jìn)則退） 自然選育的最大缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高。 二、 誘變育種誘變育種就是人為地利

8、用物理或化學(xué)等因素，使誘變對(duì)象細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，引起突變，并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。 誘變育種不僅可以提高菌種的生產(chǎn)能力，且可改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝。 目前發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的生產(chǎn)菌株大部分是誘變育種得來的。以青霉素為例，1943年開始生產(chǎn)時(shí)的效價(jià)僅為20U/ml，通過多次誘變育種現(xiàn)已達(dá)50000-100000U/ml。 雖然遺傳工程等新的育種方法迅速發(fā)展，但誘變育種仍是目前廣泛使用的育種手段。2、單細(xì)胞（或單孢子）懸液制備一般均采用生理狀態(tài)一致的單細(xì)胞或單孢子懸液進(jìn)行誘變處理。因?yàn)?1）分散狀態(tài)的細(xì)胞可均勻地接觸誘變劑 2）可避免長(zhǎng)出不純的菌落。 霉菌

9、的菌絲一般是多核的，所以對(duì)霉菌的處理一般應(yīng)采用孢子懸浮液。3、誘變劑及使用劑量的選擇凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的因素，統(tǒng)稱誘變劑。如紫外線、X-射線、Co60、-射線、快中子、超聲波，等離子等 硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍 (NTG)、亞硝酸(NA)、氮芥(NM)、羥胺、ICR類等誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑紫外線 (Uv) 使用歷史較久、廉價(jià)、危險(xiǎn)性小、效果好，應(yīng)用較廣 對(duì)誘變最有效的波長(zhǎng)是260nm左右( 253-265nm) 作用機(jī)制主要是形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性,造成菌體變異甚至死亡.快中子 中子是不帶電荷的粒子，可由回旋加速器、靜電減速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生。 中子不直

10、接產(chǎn)生電離，但能使吸收中子的物質(zhì)的原子核射出質(zhì)子，因而快中子的生物學(xué)效應(yīng)幾乎完全是由質(zhì)子造成的。 中子分為快中子和慢中子?？熘凶拥哪芰繛?.2-10百萬(wàn)電子伏特，慢中子能量為1/4至100電子伏特。 慢中子的效應(yīng)同射線、射線和電子等照射時(shí)引起的基本相同，快中子較X射線、 射線具有較大的電離密度，因而能更多地引起點(diǎn)突變和染色體畸變。氮 芥 氮芥為極易揮發(fā)的油狀物，它的鹽酸鹽是白色粉末，一般使用的是其鹽酸鹽。 應(yīng)用時(shí)先使氮芥鹽酸鹽與碳酸氫鈉其作用，釋放出氮芥子氣，再與細(xì)胞起作用而造成變異。 氮芥的誘變機(jī)制是它能引起染色體畸變。是被使用得最早的一種誘變劑。亞硝酸 常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫

11、去堿基中的氨基。 亞硝酸A H （次黃嘌呤）C UG X （黃嘌呤） 亞硝酸很不穩(wěn)定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐繼續(xù)分解放出NO和NO2。所以，可在臨用前將亞硝酸鈉放在pH4.5的醋酸緩沖液中，使先生成亞硝酸然后再使用。亞硝基胍 (NTG) 是亞硝基烷基類化合物，可誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變，不經(jīng)淘汰便可直接得到12%至80%的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，有超級(jí)誘變劑之稱。 在緩沖液中較難溶解，而在甲酰胺中溶解度較大，因此用甲酰胺溶解，可以提高處理濃度。 通常在濃度為30ug/ml、溫度為28C和時(shí)間為60min的條件下進(jìn)行處理，容易得到高產(chǎn)菌株 。 劑 量確定誘變劑后，誘變劑劑量的選擇也是育種工作的一個(gè)關(guān)鍵問

12、題。 對(duì)一般微生物而言，誘變率往往隨誘變劑劑量的增高而增高，但達(dá)到一定程度后，再提高劑量，反而會(huì)使誘變率下降。 目前的處理劑量已從以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的劑量，特別是對(duì)于經(jīng)過一再誘變的高產(chǎn)菌株。 凡既能增加變異幅度，又能促使變異向正變范圍移動(dòng)的劑量就是合適劑量。 處 理 方 法單一誘變劑處理復(fù)合處理1）兩種或多種誘變劑先后使用2）同一誘變劑重復(fù)處理3）兩種或多種誘變劑同時(shí)使用 菌種 單獨(dú)處理 誘變劑 突變率（%） 復(fù)合處理 誘變劑 突變率（%）土曲霉紫外線X-射線21.319.7紫外線+X-射線42.8土曲霉氮芥（0.1%）紫外線不明顯4.7氮芥+紫外線1

13、1.0鏈霉菌紫外線-射線31.035.0紫外線+-射線43.6金色鏈霉菌二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外線6.061.7812.5二乙烯三胺+紫外線硫酸二乙酯+紫外線26.635.9 誘變劑的復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)4、誘變處理后的后培養(yǎng)表型遲延現(xiàn)象 生理性 分離性 遺傳物質(zhì)經(jīng)誘變處理后發(fā)生的突變，必須經(jīng)復(fù)制才能表現(xiàn)出來。 研究表明，誘變后的一小時(shí)內(nèi)必須進(jìn)行新的蛋白質(zhì)合成，這個(gè)變異才有效。 因此必須在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)才能穩(wěn)定變異，使菌株表現(xiàn)出高的突變頻率。5、變異菌株的篩選由于經(jīng)誘變處理后提高產(chǎn)量的變異株仍屬少數(shù)，所以必須經(jīng)過大量的篩選工作，才能得到需要的菌株。 初篩 和 復(fù)篩 在初篩過程中，一般采用觀察初篩菌落在平板上的生理效應(yīng)所呈現(xiàn)的變色圈、透明圈、生長(zhǎng)圈或抑菌圈的大小來進(jìn)行初步測(cè)定。初 篩 要求迅速地從大量菌株中挑選出較好的一些菌，主要應(yīng)著眼于盡量擴(kuò)大挑選范圍。 部分微生物菌株經(jīng)過誘變處理后，變異菌株的菌落形態(tài)與生理特性、生產(chǎn)性能變化有一定的相關(guān)性，可在初篩時(shí)加以利用（男性謝頂）。赤霉素產(chǎn)生菌 色素 暗紅加深，產(chǎn)量上升紅霉素產(chǎn)生菌 有顏色 產(chǎn)量下降灰黃霉素產(chǎn)生菌野生菌株高產(chǎn)菌