《食品生物化學(xué)》課件

1、第五章蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)最早在1983年由伯齊利厄斯首先提出英文“Protein”這一術(shù)語(yǔ)，來(lái)自希臘文，它的意思是“最原初的”或“第一重要的”，中文譯為“蛋白質(zhì)”形容它像雞蛋白那樣的物質(zhì)。有些學(xué)者曾根據(jù)Protein原義建議設(shè)新字“朊”表示，但因蛋白質(zhì)一詞沿用己久，“朊”字一直未被廣泛使用。 生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學(xué)組成部分的不斷自我更新。 恩格斯反杜林論1878第一節(jié) 蛋白質(zhì)的概述一、蛋白質(zhì)定義及生物學(xué)意義定義蛋白質(zhì)是由許多不同的-氨基酸按一定的序列通過(guò)酰胺鍵鉚（蛋白質(zhì)化學(xué)中專(zhuān)稱(chēng)為肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象并且具有一定生物功能的生物大分子。5、參

2、與機(jī)體的防御： 如抗體或稱(chēng)免疫球蛋白6、接受傳遞信息： 如味覺(jué)蛋白、視覺(jué)蛋白7、調(diào)節(jié)或控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遺傳信息的表達(dá)8、其它： 如雞蛋清蛋白、牛奶中的酪蛋白是營(yíng)養(yǎng)和儲(chǔ)存蛋白； 膠原蛋白、纖維蛋白等屬于結(jié)構(gòu)蛋白； 甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特異的生物學(xué)功能所以說(shuō) “ 沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命 ”二、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)是除水以外，機(jī)體組織中最多的組分，占人體干重的45%，占細(xì)胞干重的5070% 。含氮量與蛋白質(zhì)含量換算：N 是蛋白質(zhì)中特征元素，且含量恒定，約為16% ，即16 克氮相當(dāng)于100 克蛋白質(zhì)，故可以用定氮法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量，通常采用微量凱

3、氏定氮法先測(cè)定樣品含氮量，再按下式計(jì)算蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)含量（g）樣品含氮量6.25（g）6.25即為 1/16%蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì)可以被酸、堿和酶催化而完全水解，水解的最終物是氨基酸的混合物。而氨基酸是不能再水解的最小單位，因此，氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。在自然界，氨基酸多以結(jié)合形式存在于蛋白質(zhì)中，以自由形式存在者很少。根據(jù)分子形狀球狀蛋白質(zhì)（分子對(duì)稱(chēng)性佳，外形接近球狀或橢球狀，溶解度較好，能結(jié)晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類(lèi) ）纖維狀蛋白質(zhì)（對(duì)稱(chēng)性差，分子類(lèi)似細(xì)棒或纖維。又可分成可溶性纖維狀蛋白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì) ）根據(jù)組分簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)：完全由-氨基酸組成結(jié)合蛋白質(zhì)除蛋白外還有非蛋白成

4、分（輔基）根據(jù)功能分活性蛋白質(zhì)（如酶蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、保護(hù)和防御蛋白和受體蛋白）非活性蛋白（如硬蛋白、角蛋白）三、蛋白質(zhì)的分類(lèi)四、蛋白質(zhì)的大小與相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)是由20種基本AA組成的多聚物，AA數(shù)目由幾個(gè)到成百上千個(gè)，分子量從幾千到幾千萬(wàn)。一般情況下，少于50個(gè)AA的低分子量的多聚物稱(chēng)為肽、寡肽或生物活性肽，有時(shí)也稱(chēng)多肽。多于50個(gè)AA的稱(chēng)為蛋白質(zhì)。但有時(shí)也把含有一條肽鏈的蛋白質(zhì)不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)胤Q(chēng)為多肽。多肽一詞著重于結(jié)構(gòu)意義，而蛋白質(zhì)原則強(qiáng)調(diào)了其功能意義。第三節(jié) 蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)-氨基酸 蛋白質(zhì)是一類(lèi)含氮的生物大分子，相對(duì)分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但如用酸或蛋白酶處理使其徹底水解，最后可以得

5、到各種氨基酸。實(shí)驗(yàn)證明氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。氨基酸是指含有氨基的羧酸。自然界發(fā)現(xiàn)的氨基酸有200余種，但組成蛋白質(zhì)的氨基酸只有20種，這20種氨基酸也稱(chēng)為蛋白質(zhì)氨基酸或稱(chēng)基本氨基酸。蛋白質(zhì)和多肽的肽鍵可被催化水解酸/堿能將蛋白完全水解 酶水解一般是部分水解得到各種AA的混合物得到多肽片段和AA的混合物氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元 一、蛋白質(zhì)的水解 蛋白質(zhì)朊胨多肽二肽AA 1*104 5*103 2*103 1000 200-500 100 氨基酸的分類(lèi)1、按氨基酸分子中羧基與氨基的數(shù)目分： 酸性氨基酸： 一氨基二羧基氨基酸 天冬氨酸、谷氨酸堿性氨基酸： 二氨基一羧基氨基酸 賴(lài)氨酸、精氨

6、酸、組氨酸中性氨基酸： 一氨基一羧基氨基酸甘氨酸 丙氨酸 纈氨酸 亮氨酸 異亮氨酸 甲硫氨酸 半胱氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 酪氨酸 脯氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺 絲氨酸 蘇氨酸2、按側(cè)基R基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分： 脂肪族氨基酸： 甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、 天冬氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸 雜環(huán)氨基酸： 脯氨酸、組氨酸 芳香族氨基酸： 苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸4、按氨基酸是否能在人體內(nèi)合成分： 必需氨基酸：指人體內(nèi)不能合成的氨基酸， 必須從食物中攝取。有八種：賴(lài)氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸。

7、（纈異苯蛋亮色蘇賴(lài)） 非必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成的氨基酸。有十種： 甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 天冬酰氨、谷氨酰氨、脯氨酸、酪氨酸、胱氨酸 半必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成但合成量不能滿足 人體需要（特別是嬰幼兒時(shí)期）的氨基酸。有兩種：組氨酸、精氨酸構(gòu)成蛋白質(zhì)的二十種氨基酸二十種氨基酸的名稱(chēng)和結(jié)構(gòu)如圖所示:吲哚基 含-氨基的氨基酸：賴(lài)氨酸 含吲哚基的氨基酸：色氨酸 含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺 亞氨基酸：脯氨酸 含咪唑基的氨基酸：組氨酸 含胍基的氨基酸：精氨酸 含苯環(huán)的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巰基）、甲硫氨酸（含硫甲基） 含羥基的氨基

8、酸：絲氨酸、蘇氨酸 支鏈氨基酸：纈氨酸、亮氨酸，異亮氨酸二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)形態(tài)均為白色結(jié)晶或粉末，不同氨基酸的晶型結(jié)構(gòu)不同。有六角、四角 、菱狀、柱狀等。如： L-Glu（四角柱） D-Glu（菱狀）溶解性一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮、乙醚 ，在稀酸和稀堿中溶解性好。胱氨酸、半胱氨酸不溶于水酪氨酸微溶于冷水而溶于熱水脯氨酸極易溶于水熔點(diǎn)氨基酸的熔點(diǎn)一般都比較高，一般都大于 200，超過(guò)熔點(diǎn)以上氨基酸分解產(chǎn)生胺和二氧化碳。味感氨基酸都有一定味感，主要表現(xiàn)酸、甜、苦、鮮四種味感。旋光性除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。有的有多個(gè)旋光異構(gòu)體，如蘇氨酸、異亮氨酸、胱氨酸。從氨基酸的結(jié)構(gòu)通式

9、可以看出：除 R 為H（甘氨酸）外， 所有-碳原子為不對(duì)稱(chēng)碳原子 。氨基酸均具有旋光性。左旋（-），右旋（+）每一種氨基酸都有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均為 L-氨基酸。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)基 R 基上。注 ：脯氨酸（Pro）為亞氨基酸，不適用上面的結(jié)構(gòu)通式。亞氨基+-氨基酸的構(gòu)型構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸除甘氨酸外，含有的-碳原子為手性碳原子，在空間該原子上的原子或基團(tuán)有兩種排列方式，L-構(gòu)型與D-構(gòu)型（以甘油醛為參照物）：L-氨基酸與D-氨基酸的關(guān)系互為鏡像關(guān)系，象左右手的關(guān)系，以丙氨酸為例，如右圖 Ala光吸收：氨基酸在可見(jiàn)光范圍內(nèi)無(wú)光吸收，在近紫外區(qū)含苯環(huán)氨基酸有光的吸

10、收。 max ：Tyr：275 Phe: 258 Trp：279氨基酸的兩性電離及等電點(diǎn)兩性離解：從氨基酸的結(jié)構(gòu)通式分析可以看出：氨基酸分子在溶液中其氨基-NH2和-COOH均可發(fā)生電離。使氨基酸分子-NH3+ 帶正電，羧基-COO-帶負(fù)電。兩性離子是指在同一個(gè)氨基酸分子上帶有能放出質(zhì)子的NH3+正離子和能接受質(zhì)子的COO-負(fù)離子。這種特性叫兩性離解。 氨基酸在水中的兩性離子既能像酸一樣放出質(zhì)子，也能像堿一樣接受質(zhì)子，氨基酸具有酸堿性質(zhì)，是一類(lèi)兩性電解質(zhì)。As an acid（proton donor）：As a base（proton acceptor）：不同pH時(shí)氨基酸以不同的離子化形式存

11、在： 氨基酸所帶靜電荷為“零”時(shí)，溶液的pH值稱(chēng)為該氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectric point），以pI表示。氨基酸的等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)證明在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸主要以兩性離子形式存在，但也有少量的而且數(shù)量相等的正、負(fù)離子形式，還有極少量的中性分子。 當(dāng)溶液的pH=pI時(shí)，氨基酸主要從兩性離子形式存在。 pHpI時(shí)，氨基酸主要以負(fù)離子形式存在。 由于靜電作用，在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀。利用這一性質(zhì)可以分離制備某些氨基酸。例：谷氨酸的生產(chǎn)，就是將微生物發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)到3.22(谷氨酸的等電點(diǎn))而使谷氨酸沉淀析出。利用各種氨基酸的等電點(diǎn)不同，可以通過(guò)電泳法、離子交換法等在實(shí)驗(yàn)室或工

12、業(yè)生產(chǎn)上進(jìn)行混合氨基酸的分離或制備。氨基酸的等電點(diǎn)可由其分子上解離基團(tuán)的解離常數(shù)來(lái)確定。各種氨基酸的解離常數(shù)pK和等電點(diǎn)pI的近似值可參考下頁(yè)圖表或其它教材。20種氨基酸的 pK，及pI氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算：各種氨基酸的等電點(diǎn)，一般通過(guò)實(shí)驗(yàn)在一定的緩沖溶液中測(cè)定，也可以從氨基酸的PK值求得。 氨基酸的水溶液既可被酸滴定，又可被堿滴定，因此具有兩性電離的性質(zhì)，現(xiàn)以甘氨酸為例來(lái)說(shuō)明氨基酸兩性電離的特點(diǎn)。 左圖是甘氨酸的電離酸堿滴定曲線，從左向右是用NaOH滴定的曲線，溶液的pH由小到大逐漸升高；從右向左是用鹽酸滴定的曲線，溶液的pH由大到小逐漸降低。曲線中從左向右第一個(gè)拐點(diǎn)是氨基酸羧基解離50%的狀

13、態(tài)，第二個(gè)拐點(diǎn)是氨基酸的等電點(diǎn)，第三個(gè)拐點(diǎn)是氨基酸氨基解離50%的狀態(tài)。 氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算：中性氨基酸： pK1 為-羧基的解 離常數(shù)pK2 為-氨基的解 離常數(shù)pI=(pK1 + pK2)/2+H3N-CH2-COO H2N-CH2-COO + H+ K2Gly +GlyK1=GlyH+Gly+ +H3N-CH2-COOH +H3N-CH2-COO + H+K1K2=Gly GlyGlyH+Gly 得：K1K2GlyH+2Gly+氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算公式推導(dǎo)：以甘氨酸為例：式 兩邊取負(fù)對(duì)數(shù)，得：pK1+ pK2 2pH+ lgGly+Gly 當(dāng) Gly+ Gly 時(shí)，甘氨酸所帶正、負(fù)電荷相等

14、，即處于兼性離子狀態(tài)，溶液的pH即為等電點(diǎn)pI： 即氨基酸的等電點(diǎn)與離子濃度無(wú)關(guān)，只取決于兩性離子兩側(cè)可解離基團(tuán)的pK值。甘氨酸的等電點(diǎn)為： pK1為-羧基的解離常數(shù)pK2為-氨基解離常數(shù)pI = ( pK1 + pK2 ) / 2氨基酸在等電點(diǎn)處溶解度最小，可沉淀析出。中性氨基酸：以Gly為例 K1=Gly H+Gly+K2=Gly- H+GlypI時(shí)，Gly+ = Gly- Gly H+K1=Gly K2H+H+2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI =（2.34+9.60）/2=5.97Gly等電點(diǎn)的計(jì)算酸性氨基酸以Asp為例：以Lys為例：堿性氨基酸通

15、過(guò)上述實(shí)例可知，由于羧基解離度大于氨基的解離度，所以含有一個(gè)氨基和一個(gè)羧基的中性氨基酸的等電點(diǎn)都在pH 6.0左右，如甘氨酸為5.97、絲氨酸為5.68、纈氨酸為5.96、異亮氨酸為6.02。至于堿性氨基酸（二氨基一羧基）的等電點(diǎn)值就較大，而酸性氨基酸(一氨基二羧基)的等電點(diǎn)值就較小。氨基酸的化學(xué)性質(zhì)-氨基酸分子中有許多功能基團(tuán)，-氨基，-酸基，側(cè)鏈R基，按其化學(xué)反應(yīng)分四個(gè)方面：-氨基參加的反應(yīng)：與甲醛反應(yīng)，與HNO2 反應(yīng)- 具一級(jí)胱的性質(zhì)；-羧基參加的反應(yīng)：成鹽、成酯、成酰胺、胱酸、酰氯化等-具羧酸的性質(zhì)；-氨基，-羧基共同參加的反應(yīng)：成肽、茚三酮反應(yīng)；側(cè)鏈R參加的反應(yīng)：米倫反應(yīng)、黃色反應(yīng)

16、、分試劑反應(yīng)、硫酸鉛反應(yīng)、坂口反應(yīng)。由-氨基參與的反應(yīng)： 與 HNO2 反應(yīng)：放出 N2 ，N2 中的一原子 N 來(lái)自于 -NH2 ,另一原子 N 來(lái)自于 HNO2 用途：通過(guò)測(cè)定生成的氮?dú)獾捏w積量可計(jì)算氨基氮的量，此反應(yīng)也可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度。特殊： Pro、Hpr 不與 HNO2 放氮 Trp、Arg、His 的側(cè)鏈不與 HNO2 放氮 Lys 的側(cè)鏈與 HNO2 反應(yīng)慢RCHCOOH + HNO2 NH2RCHCOOH + N2 + H2OOH與甲醛的反應(yīng)：用過(guò)量的中性甲醛與氨基酸反應(yīng)，可游離出氫離子，然后用 NaOH 滴定，從消耗的堿量可以計(jì)算出氨基酸的含量。此法稱(chēng)為間接滴定法。

17、 用途：此法用于快速測(cè)定氨基酸的含量，也常用于蛋白質(zhì)水解程度的測(cè)定。CH2COONH3+H+ +CH2COONH2CH2COONHCH2OHCH2COON(CH2OH)2pK2HCHOHCHO與2,4-二硝基氟苯（2,4-DNFB）的反應(yīng)（Sanger反應(yīng)）： 生成黃色的二硝基苯-氨基酸衍生物與苯異硫氰酸酯（PITC）反應(yīng)（Edman反應(yīng)）： 生成苯乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸與丹磺酰氯（DNSCl）的反應(yīng)： 生成熒光物質(zhì) DNS氨基酸、反應(yīng)用于多肽的N-末端的測(cè)定-羧基參與的反應(yīng)：與堿反應(yīng)成鹽 與醇反應(yīng)成酯 與?；噭┓磻?yīng)成酰氯R1CHCOO + R2OHNH3+R1CHCOOR2 + H2ONH3成

18、酯反應(yīng)： （是合成氨基酸?；苌锏闹匾虚g體）RCHCOONHPGRCHCOClNHPGPCl3，PCl5 or SOCl2成酰氯反應(yīng)： （是使氨基酸羧基活化的一個(gè)重要反應(yīng)）-氨基與-羧基共同參與的反應(yīng) 與茚三酮的反應(yīng)： 氨基酸與水合茚三酮生成藍(lán)紫色化合物（max570nm）用途：用于氨基酸的定性定量分析 靈敏度極高，微克數(shù)量級(jí)就可觀察到顏色 紙電泳、層析等分離氨基酸的顯色劑，也是定量氨基酸的依據(jù) 多肽、蛋白質(zhì)均有此反應(yīng)，肽鍵越長(zhǎng)，靈敏度越差注：氨基酸與茚三酮的反應(yīng)： 氨基酸與水合茚三酮反應(yīng)的藍(lán)紫色化合物其max=570nm， 該反應(yīng)受到氨化合物干擾。脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng) 不釋放 N

19、H3 而直接生成黃色化合物 (max440nm )。離子交換反應(yīng)樹(shù)脂SO3- H（Na） + NH3+-CH-COOHR樹(shù)脂SO3- NH3+-CH-COOH + H+(Na)R陽(yáng)離子交換反應(yīng)離子交換劑： 支持物 功能基 反離子COOSO3PO3NH3+NR2H+H+ ( Na )OH(Cl)陽(yáng)離子交換劑：陰離子交換劑： 上樣：條件 pH 中性氨基酸(Aa+) 酸性氨基酸(Aa)溶液的離子強(qiáng)度: 越大 , 氨基酸結(jié)合越不牢固用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離混合氨基酸的步驟：Millon反應(yīng)：檢測(cè) Tyr 或含 Tyr 的蛋白質(zhì)的反應(yīng) Millon試劑：汞的硝酸鹽與亞硝酸鹽溶液 產(chǎn)物：紅色的化合物側(cè)鏈反應(yīng)（

20、顏色反應(yīng)）坂口反應(yīng)：檢測(cè) Arg 或含 Arg 的蛋白質(zhì)的反應(yīng) 坂口試劑：-萘酚的堿性次溴酸鈉溶液 產(chǎn)物：磚紅色的沉淀Folin反應(yīng)：檢測(cè) Tyr 或含 Tyr 的蛋白質(zhì)的反應(yīng) Folin試劑：磷鉬酸、磷鎢酸混合溶液 產(chǎn)物：藍(lán)色的鉬藍(lán)、鎢藍(lán)Pauly反應(yīng)：檢測(cè)His、Tyr及含His、Tyr蛋白質(zhì)的反應(yīng) 試劑：對(duì)氨基苯磺酸鹽酸溶液、亞硝酸鈉、碳酸鈉混合溶液 產(chǎn)物：橘紅色的化合物Cys的反應(yīng)：Cys或含Cys蛋白質(zhì)與亞硝基亞鐵氰酸鈉在稀氨 的溶液中，產(chǎn)生一種紅色的化合物。乙醛酸的反應(yīng)：檢測(cè)Trp或含Trp蛋白質(zhì)的反應(yīng)。 當(dāng)Trp與乙醛酸和濃硫酸在試管中疊加時(shí)，產(chǎn)生分層 現(xiàn)象，界面出現(xiàn)紫色環(huán)。四、

21、氨基酸的分離與分析為了測(cè)定蛋白質(zhì)中氨基酸的含量、組成或從蛋白質(zhì)水解液中制取氨基酸，都需要對(duì)氨基酸混合物進(jìn)行分析和分離工作。其方法較多，而目前使用較多的是層析法。分配層析的一般原理所有的層析系統(tǒng)都有兩個(gè)相組成，一個(gè)為固定相或靜相（stationary phase），一個(gè)為流動(dòng)相或動(dòng)相（mobile phase）?；旌衔镌趦上嘀械姆蛛x決定于混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)（ partition or distribution coefficient）來(lái)描述：當(dāng)一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中進(jìn)行分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)，即分配系數(shù)（Kd）。用下式

22、表示： CA 表示某一物質(zhì)在動(dòng)相中的濃度 Kd= CB 表示某一物質(zhì)在靜相中的濃度 物質(zhì)分配不僅可以在互不相溶的兩種溶劑即液相-液相系統(tǒng)中進(jìn)行，也可以在固相-液相或氣相-液相間發(fā)生。其系統(tǒng)中的靜相可以是固相、液相或固-液混合相（半液體相）；動(dòng)相可以是液相或氣相，它充滿于靜相的空隙中，并能流過(guò)靜相。在實(shí)際層析時(shí)，層析行為一般并不直接決定于它的分配系數(shù)，而是取決于有效分配系數(shù)Keffo： 某一物質(zhì)在A相中的總量 Keffo= 某一物質(zhì)在B相中的總量(2)分配柱層析層析柱中的填充劑或支持劑都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。支持劑表面附著一層不會(huì)流動(dòng)的結(jié)合水作為固定相，沿固定相流過(guò)

23、的與它互不相溶的溶劑（如苯酚、正丁醇等）是流動(dòng)相。由填充劑構(gòu)成的柱床可以設(shè)想為由無(wú)數(shù)的連續(xù)的板層組成，每一板層起著微觀的“分溶管”作用。當(dāng)用洗脫劑洗脫時(shí)，在柱上端的氨基酸混合物在兩相之間按不同的分配系數(shù)進(jìn)行連續(xù)不斷的進(jìn)行分配移動(dòng)。分部收集層析柱下端的洗脫液，然后分別用茚三酮顯色定量，以氨基酸量對(duì)洗脫液體積作圖得洗脫曲線，曲線中的每個(gè)峰相當(dāng)于某一種氨基酸。加洗脫劑氨基酸樣品支持劑層析柱分部收集1.00.50.1光吸收值 20 40 60 80 100 120 流出液（毫升）（3）濾紙層析濾紙層析也是分配層析的一種。這里的濾紙纖維素吸附水作為固定相，展層用的溶劑是流動(dòng)相。層析時(shí)，混合氨基酸在這兩相

24、中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上。層析時(shí)，將樣品點(diǎn)在濾紙的一個(gè)角上，稱(chēng)為原點(diǎn)。然后將其放入一個(gè)密閉的容器中，用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行展層，層析后烘干濾紙，再將其旋轉(zhuǎn)90度采用第二種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行第二相展層。由于各種氨基酸在兩個(gè)不同的溶劑系統(tǒng)中具有不同的遷移率（ Rf ），因此它們就會(huì)彼此分開(kāi)，當(dāng)用茚三酮顯色時(shí)，就會(huì)在濾紙上面出現(xiàn)各種氨基酸的斑點(diǎn)。當(dāng)然，若氨基酸種類(lèi)較少或一相就能分開(kāi)，進(jìn)行一相層析即可。 溶劑前沿氨基酸顯色點(diǎn)濾紙?jiān)c(diǎn)XY濾紙層析中的Rf值，Rf =X/Y丁醇-醋酸酚-甲酚-水氨基酸的雙向?yàn)V紙層析圖譜（4）薄層層析（thin-layer chromatography)：該層析分辨率

25、高，需量極少，層析速度快，可使用的支持劑種類(lèi)多，如纖維素粉、硅膠、氧化鋁等。其步驟大體如下：把支持物涂布在玻璃板上使其成為一個(gè)均勻的薄層，把要分析的樣品滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑在密閉的容器中進(jìn)行展層，使樣品中各個(gè)成分分開(kāi)，最后進(jìn)行鑒定和定量分析。蓋子層析缸溶劑薄層板（側(cè)面）薄層層析裝置（5）離子交換層析（ion-exchange column chromatography) 這是一種用離子交換樹(shù)脂作支持劑的層析法。離子交換樹(shù)脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（單體）和苯二乙烯（交聯(lián)劑）進(jìn)行聚合和交聯(lián)反應(yīng)生成的具有網(wǎng)

26、狀結(jié)構(gòu)的高聚物。它是離子交換樹(shù)脂的基質(zhì)，帶電基團(tuán)是通過(guò)后來(lái)的反應(yīng)引入基質(zhì)的，樹(shù)脂一般都制成球形顆粒。 CH2CH2CHCH2CH2CHSO3 CH CH2CH2CH苯環(huán)SO3有氫型和鈉型H+或Na+H+或Na+樹(shù)脂分陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂含有的酸性基團(tuán)如SO3H（強(qiáng)酸型）或COOH（弱酸型）可解離出H+離子，當(dāng)溶液中含有其它陽(yáng)離子時(shí)，例如酸性環(huán)境中的氨基酸陽(yáng)離子，它們可以和H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。同樣地陰離子交換樹(shù)脂含有的堿性基團(tuán)如N（CH3）3OH（強(qiáng)堿型）或NH3OH（弱堿型）可解離出OH-，它能和溶液中的陰離子如堿型環(huán)境中的氨基酸陰離子發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。

27、氨基酸在樹(shù)脂上結(jié)合的牢固程度即氨基酸與樹(shù)脂的親和力，主要決定于：它們之間的靜電引力；氨基酸側(cè)鏈與樹(shù)脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水相互作用。在PH為3左右的氨基酸與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂之間的靜電引力的大小次序是堿性氨基酸（R2+）大于中性氨基酸（R+），后者又大于酸型氨基酸（R0）。因此，氨基酸的洗脫順序大體上是酸性氨基酸、中性氨基酸和堿性氨基酸。但有時(shí)并不是這樣，這是因?yàn)槟承┌被岷蜆?shù)脂之間還存在著疏水作用。為了使氨基酸從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，需要降低它們之間的親和力，有效的方法是逐步提高洗脫劑的PH和鹽濃度（離子強(qiáng)度），這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來(lái)。（6）氣相色譜 當(dāng)層析系統(tǒng)的流動(dòng)相為氣體，固定相為

28、涂漬在固體顆粒表面的液體時(shí)，此層析技術(shù)稱(chēng)為氣-液色譜（gas-liquid chromatography）或簡(jiǎn)稱(chēng)為氣相色譜。它是利用樣品組分在流動(dòng)的氣相和固定在顆粒表面的液相中的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離組分的目的。 氣相色譜需要?dú)庀嗌V儀進(jìn)行。 氣相色譜具有微量快速的優(yōu)點(diǎn)。（7）高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC）：這是近十幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速、靈敏、高效的分離技術(shù)。 HPLC的特點(diǎn)是：使用的固定相支持劑顆粒很細(xì)，因而表面積很大；溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。因此多種類(lèi)型的柱層析都可用HPLC來(lái)代替，例如分配層析、離

29、子交換層析、吸附層析以及凝膠過(guò)濾等。第三節(jié) 肽（Peptide）由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸，由一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基脫水縮合形成新鍵-C-N-即酰胺鍵也叫肽鍵，所形成的這個(gè)化合物叫肽。一、肽和肽鍵由兩個(gè)AA組成的肽稱(chēng)為二肽。由多個(gè)AA組成的肽則稱(chēng)為多肽。組成多肽的AA單元稱(chēng)為氨基酸殘基。多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離-氨基的一端：氨基端或N-端含游離-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序是從N-端開(kāi)始以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn) 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln二、肽的理化性質(zhì)1、兩性解離與等電點(diǎn)肽與氨基酸一樣具有酸、堿性質(zhì)，它的解離主要取決于肽鏈的末

30、端氨基、末端羧基和側(cè)鏈R基。由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之間的距離比氨基酸中的大，因此它們之間的靜電引力較弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1。N端-NH3+的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2。R基的pK變化不大。肽的等電點(diǎn)：肽所帶凈電荷為“零”時(shí)，溶液的pH值。 例：已知末端-COOH，pK3.6，末端-NH3+pK8.0 -NH+3pK10.6。 計(jì)算Ala-Ala-Lys-Ala的等電點(diǎn)。 pI=(8.010.6) /2 =9.32、肽的化學(xué)性質(zhì) 雙縮脲反應(yīng) 肽鍵的紫外吸收210230nm 雙縮脲 堿性CuSO4溶液 紫色三、天然存在的某些活性肽 肌肽和鵝肌

31、肽 肌肽（carnosine）:-Ala-His 鵝肌肽（anserine）：-Ala-1-Me-His 2、谷胱甘肽(glutathione,GSH) 3、多肽抗菌素 4、多肽激素 5、神經(jīng)肽甲硫氨酸腦啡肽TyrGlyGlyphe- Met 亮氨酸腦啡肽Tyr-Gly-Gly-phe-Leu 功能：鎮(zhèn)痛 如腦啡肽 (enkephalin) 第四節(jié) 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明蛋白質(zhì)是由各種氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成的多肽鏈，再內(nèi)一條或一條以上的多肽鏈按各自特殊方式組合成具有完整生物活性的分子。隨著肽鏈數(shù)目、氨基釀酸組成及其排列順序的不同，就有不同的三度空間結(jié)構(gòu)也就形成了不同的蛋白質(zhì)。目前已經(jīng)知

32、道的蛋白質(zhì)種類(lèi)有100億之多，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的氨基酸組成和排列順序不同而引起。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，人們?yōu)榱搜芯糠奖闫鹨?jiàn)，把蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)分為以下幾個(gè)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)：初級(jí)結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary structure） 國(guó)際化學(xué)會(huì)規(guī)定1、概念指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈上氨基酸殘基的排列順序（序列）就是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。連接方式：主要是肽鍵，還有二硫鍵。排列順序：指從N-末端開(kāi)始，到C-末端結(jié)束，各氨基酸的排列次序。多肽鏈的數(shù)目,二硫鍵的數(shù)目位置氨基酸的組成氨基酸間的連接方式氨基酸的排列順序一級(jí)結(jié)

33、構(gòu)的實(shí)質(zhì) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（Primary structure）又稱(chēng)為共價(jià)結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu)。它是指蛋白質(zhì)中的氨基酸按照特定的排列順序通過(guò)肽鍵連接起來(lái)的多肽鏈結(jié)構(gòu)。 2、肽鍵與肽鏈肽鍵：一個(gè)氨基酸的-COOH 和相鄰的另一個(gè)氨基酸的-NH2 脫水形成共價(jià)鍵。如右圖：肽鏈：氨基酸借肽鍵連成長(zhǎng)鏈，稱(chēng)為肽鏈，肽鏈兩端有自由 -NH2和 -COOH，自由-NH2 端稱(chēng)為N-末端（氨基末端），自由 -COOH端稱(chēng)為C-末端（羧基末端）。構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺，稱(chēng)為氨基酸殘基。肽鏈中的氨基酸的排列順序，一般-NH2 端開(kāi)始，由N指向C，即多肽鏈有方向性，N端為頭，C端為尾。兩個(gè)不同氨基酸組成的二肽有2種; 三

34、個(gè)不同氨基酸組成的三肽有6種；四個(gè)不同氨基酸組成的四肽有24種；n個(gè)不同的氨基酸組成的多肽有 n! 種多肽。該肽命名：從 N 端C 端依次讀出各氨基酸殘基為氨基酰絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸（五肽）二硫鍵：肽鏈有的成環(huán)狀，有的是由一條以上肽鏈組成。肽鏈中除肽鍵外還有二硫鍵，它是由肽鏈中相應(yīng)部位上兩個(gè)半胱氨酸殘基脫氫連接而成的，是連接肽鏈內(nèi)或肽鏈間的主要橋鍵。二硫鍵在蛋白質(zhì)分子中起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用，往往與生物活力有關(guān)。當(dāng)二硫鍵破壞后，蛋白質(zhì)或多肽的生物活力就消失，例如胰島素分子中的二硫鍵受到破壞，活力就喪失，說(shuō)明它們的生物活力與二硫鍵有關(guān)。一般二硫鍵數(shù)目愈多，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性就愈強(qiáng)。

35、生物體內(nèi)起保護(hù)作用的皮、角、毛、發(fā)的蛋白質(zhì)中二硫鍵最多。3、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)確定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是最基本的，它包含著決定蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的因素。確定的要點(diǎn)測(cè)定蛋白質(zhì)中氨基酸組成；蛋白質(zhì)的N端和C端的測(cè)定；應(yīng)用兩種或兩種以上不同的水解方法將所要測(cè)定的蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，各自得到一系列大小不同的肽段；分離提純所產(chǎn)生的肽，并測(cè)定出它們的序列；從有重疊結(jié)構(gòu)的各個(gè)肽的序列中推斷出蛋白質(zhì)中全部氨基酸排列順序。（片段重疊法）確定的原則（片段重疊法）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的原則是將大化小，逐段分析、先后果用不同方法制成兩套肽片段。并對(duì)照兩套肽段，找出重疊片段，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質(zhì)的完整序列。下面的數(shù)據(jù)是從一個(gè)

36、八肽降解和分析得到的，其組成是：Ala、Gly2、Lys、Met、Ser，Thr、Tyr。該八肽 用CNBr 處理，得到：Ala、Gly、Lys、Thr Gly、Met、Ser、Tyr ；用胰蛋白酶處理，得到：Ala、Gly； Gly、Lys、Met、Ser、Thr、Tyr ；用糜蛋白酶處理，得到：Gly、Tyr Ala、Gly、Lys、Met、Ser、Thr 。經(jīng)分析，N-末端殘基是：Gly ，C-末端殘基是：Gly 。請(qǐng)確定該肽的氨基酸順序。 GlyTyrSerMetThrLysAlaGly一級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)順序舉例：二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（Space Structure）蛋白質(zhì)的多肽鏈在一級(jí)結(jié)構(gòu)

37、的基礎(chǔ)上，按照一定的方式有規(guī)律的旋轉(zhuǎn)或折疊形成的空間構(gòu)象（又稱(chēng)高級(jí)結(jié)構(gòu)）。其實(shí)質(zhì)是多肽鏈在空間的排列方式的肽鏈的走向。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)Linus Pauling 和 Robert Corey 于 20 世紀(jì) 40 年代末至50 年代初，根據(jù)X-射線衍射法技術(shù)對(duì)-角蛋白等研究結(jié)果，提出了蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的立體化學(xué)原則。 蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的立體化學(xué)原則的要點(diǎn)肽鏈空間構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位為肽平面。所謂的肽平面是指肽鏈中從一個(gè)C原子到另一個(gè)C原子之間的結(jié)構(gòu)，共包含 6 個(gè)原子（C、C、O、N、H、C），它們?cè)诳臻g共處于同一個(gè)平面。如下圖所示：肽鍵上的原子呈反式構(gòu)型。肽鍵 C-N鍵長(zhǎng)為 0.132nm ，比一

38、般的 C-N單鍵 (0.147nm)短，比 C=N雙鍵(0.128nm)要長(zhǎng)，具有部分雙鍵的性質(zhì)(partial double-Bond character)，不能旋轉(zhuǎn)。而 C-C、C-N為真正單鍵（pure single bond），可以旋轉(zhuǎn)。相鄰肽平面構(gòu)成二面角。一個(gè)C原子相連的兩個(gè)肽平面，由于 N-C 和 C-C(羧基碳)兩個(gè)鍵為單鍵，肽平面可以分別圍繞這兩個(gè)鍵旋轉(zhuǎn)，一個(gè)肽平面圍繞 N-C(氮原子與-碳原子)旋轉(zhuǎn)的角度，用表示。另 一個(gè)肽平面圍繞 C-C(-碳原子與羧基碳)旋轉(zhuǎn)的角度，用表示。這兩個(gè)旋轉(zhuǎn)角度叫二面角（dihedral angle)。二面角角：肽平面圍繞 N-C 旋轉(zhuǎn)的角度

39、角：肽平面圍繞 C-C 旋轉(zhuǎn)的角度二面角(,)確定后，一個(gè)多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)就確定了。規(guī)定0，當(dāng) CC 兩側(cè)的 N1C1 和 C-C2 呈 順式排列時(shí)0，當(dāng) CC2 兩側(cè)的 CN1 和 C2N2 呈 順式排列時(shí): 0180 從 C 向 N1 看，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，為正，反時(shí)針旋轉(zhuǎn)，為負(fù)；： 0180 從 C 向 C2 看，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，為正，反時(shí)針旋轉(zhuǎn)，為負(fù)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要類(lèi)型（1）-螺旋（2）-折疊（3）-轉(zhuǎn)角（4）自由回轉(zhuǎn) -螺旋（-Helix）: 又稱(chēng)為 3.613 螺旋，= -57，= -47。結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：多肽鏈繞一條固定軸旋轉(zhuǎn)形成右手螺旋。每 3.6 個(gè)氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于0.54nm

40、 ，相鄰兩個(gè)氨基酸殘基間的距離為 0.15nm 。相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中 CO 和 N-H 形成許多鏈內(nèi)氫健，即每一個(gè)氨基酸殘基中的 NH 和前面相隔三個(gè)殘基的 CO 之間形成氫鍵，這是穩(wěn)定-螺旋的主要鍵。肽鏈中氨基酸側(cè)鏈 R ，分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響-螺旋的形成。-螺旋表示為：3.613-螺旋在許多蛋白中存在，如-角蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白等，主要由-螺旋結(jié)構(gòu)組成。螺旋的結(jié)構(gòu)通常用“ ns ” 來(lái)表示，n 表示螺旋每旋轉(zhuǎn)一圈所含的殘基數(shù)，s 表示形成氫鍵的 C=O 與 H-N 原子之間在主鏈上包含的原子數(shù)。 螺旋的其他形式310螺旋和螺旋：不穩(wěn)定的螺旋影響-螺旋穩(wěn)定的因素：

41、 酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，有相同電荷相斥作用，不利于-螺旋形成； 較大的 R （如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸）集中的區(qū)域，也妨礙-螺旋形成； 脯氨酸是-螺旋的最大破壞者，因其-碳原子位于 五元環(huán)上，不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，不易形成氫鍵，遇 Pro，-螺旋中斷； 甘氨酸的R 基為 H ，空間占位很小，也 會(huì)影響螺旋的穩(wěn)定，也是-螺旋的破壞者。-折疊(-pleated sheets)又稱(chēng)-片層、-結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：有平行式和反平行式兩種，平行式的折疊其= -119，= +113。反平行折疊其= -139，=+135。這種片層在絲心蛋白里大量存在。相鄰兩個(gè)氨基酸殘基的軸心距離為0.35nm或0

42、.325nm，側(cè)鏈R基團(tuán)交替地分布在片層平面的上下方，片層間有氫鍵相連；多肽鏈呈鋸齒狀（或扇面狀）排列成比較伸展的結(jié)構(gòu)；-折疊片層的兩種形式： 1、平行式 2、反平行式反平行的-折疊片氫鍵2側(cè)面觀頂面觀R-基團(tuán)突出于片層兩端多肽鏈幾乎完全伸展-139 +135 平行的-折疊片氫鍵頂面觀側(cè)面觀5蛋白質(zhì)中平行與反平行的混合結(jié)構(gòu) 幾乎所有的-結(jié)構(gòu)都傾向于右旋，因?yàn)閱捂溈偸勤呄蛴谙蛴遗まD(zhuǎn)，與之對(duì)應(yīng)的是鏈內(nèi)氫鍵。-轉(zhuǎn)角 : 又稱(chēng)-彎曲，-回折或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。指蛋白質(zhì)的多肽鏈在形成空間構(gòu)象時(shí)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)180的回折，回折處的結(jié)構(gòu)就稱(chēng)為-轉(zhuǎn)角。一般由四個(gè)連續(xù)的氨基酸組成，第一個(gè)氨基酸的羧基與第四個(gè)氨基酸的氨基形成

43、氫鍵。也有一些是由第一個(gè)氨基酸的羧基與第三個(gè)氨基酸的氨基形成氫鍵。 -轉(zhuǎn)角180甘氨酸和脯氨酸最易引起180轉(zhuǎn)角氨基酸2和3之肽鍵可自由的與水形成氫鍵自由回轉(zhuǎn)(又稱(chēng)無(wú)規(guī)卷曲、自由繞曲)是指沒(méi)有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)。酶的功能部位常常處于這種構(gòu)象區(qū)域里，所以受到人們的重視。小結(jié)：不同蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)不同，有的相差很大，例如肌紅蛋白分子中肽鏈中約有75是-螺旋結(jié)構(gòu)。 -角蛋白幾乎全是-螺旋結(jié)構(gòu)，而蠶絲絲心蛋白卻又幾乎全是-折疊結(jié)構(gòu)。超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域近年來(lái)在研究蛋白質(zhì)構(gòu)象、功能和進(jìn)化中的變化時(shí)，常常引入超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)層次，作為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)至二級(jí)結(jié)構(gòu)層次的一種過(guò)渡態(tài)構(gòu)象層次。 超二級(jí)結(jié)構(gòu)

44、（Super-secondary structure）超二級(jí)結(jié)構(gòu)是指若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈在三維折疊中往往形成有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集體，在球蛋白中充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。常見(jiàn)的有：、等。：由兩股或三般右手-螺旋彼此纏繞而成左手超螺旋的構(gòu)象。：由二段平行的-折疊和一段連接鏈組合在一起的超二級(jí)結(jié)構(gòu)。：兩段-折疊之間通過(guò)一段-螺旋片段連接組合在一起形成。-轉(zhuǎn)角：若一條多肽鏈上連續(xù)而又相鄰的3條反平行-折疊鏈由緊湊的-轉(zhuǎn)角連接在一起可形成-轉(zhuǎn)角。希臘式鑰匙構(gòu)象：在反平行-折疊片中還可出現(xiàn)希臘式鑰匙花紋相似的回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

45、超二級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有聚集成具合功能的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域（structural domain）結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。多肽鏈在超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球狀的結(jié)構(gòu)。在空間上彼此分隔，各自具有部分生物功能的結(jié)構(gòu)。對(duì)于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基，結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)往往是一個(gè)意思，即這些蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域的。對(duì)于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上的相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域締合而成三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域通常含有100200個(gè)氨基酸殘基，一般少則40個(gè)殘基，多則40個(gè)以上。一條長(zhǎng)的多肽鏈?zhǔn)紫日郫B成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域再締合成三級(jí)結(jié)構(gòu)。很多多結(jié)構(gòu)域的酶分子，活性部位往往分布

46、在結(jié)構(gòu)域之間的一段連接肽鏈上（該連接鏈通常稱(chēng)為“鉸鏈區(qū)”)，有利于結(jié)構(gòu)域發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，使活性部體利于結(jié)合底物和給予底物施加壓力，也有利于別構(gòu)酶充分發(fā)揮別構(gòu)調(diào)節(jié)效應(yīng)。結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)層次介于超二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間。如圖所示：蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)的定義：多肽鏈中所有原子在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)，乃至結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上進(jìn)一步沿多個(gè)方向卷曲、折疊形成的緊密的近似球狀的結(jié)構(gòu)稱(chēng)為蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)大多數(shù)的親水的R 側(cè)基分布于球形結(jié)構(gòu)的表面；疏水的R 側(cè)基分布于球形結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，形成疏水的核心；表面有一空穴（裂隙、凹槽、口袋），是蛋白質(zhì)的活力部位，結(jié)合底物或配體。二級(jí)結(jié)構(gòu)向三級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的主要?jiǎng)恿κ鞘?/p>

47、水相互作用。肌紅蛋白（Mb）的三級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鏈的走向圖哺乳動(dòng)物肌肉中的儲(chǔ)氧蛋白質(zhì)含153Aa殘基、Mw：17800、一個(gè)血紅素輔基 八段螺旋： A1-16、B1-16、 C1-7、D1-7、 E1-20、F1-9、 G1-19、H1-14、遠(yuǎn)端His64（E7）近端His93（F8）肌紅蛋白（Mb）的三級(jí)結(jié)構(gòu)（原子填充圖）一般來(lái)說(shuō)，具有相似的一級(jí)結(jié)構(gòu)通常具有相似的三維結(jié)構(gòu)。但有時(shí)非常不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)（同源相似序列小于20）能形成非常相似的三維結(jié)構(gòu)。血紅蛋白亞基哺乳動(dòng)物昆蟲(chóng)植物蛋白質(zhì)的功能取決于它的三維結(jié)構(gòu)，而三維結(jié)構(gòu)是由其一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的。蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)定義： 二個(gè)或二個(gè)以上具有獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)的多

48、肽 鏈（亞基），彼此借次級(jí)鍵相連，形成一定的空間結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為四級(jí)結(jié)構(gòu)。亞基：具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位，稱(chēng)為亞基或亞單位(subunit)。亞基聚合的驅(qū)動(dòng)力：亞基間的疏水作用其它驅(qū)動(dòng)力：離子鍵、氫鍵四級(jí)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)實(shí)質(zhì)是亞基在空間排列的方式。由相同亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)稱(chēng)為同聚蛋白質(zhì)；由不同亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)稱(chēng)為雜聚蛋白質(zhì)。由幾個(gè)亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)稱(chēng)為寡聚蛋白質(zhì)；由多個(gè)亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)稱(chēng)為多聚蛋白質(zhì)亞基聚合的驅(qū)動(dòng)力：亞基間的疏水作用其它驅(qū)動(dòng)力：離子鍵、氫鍵四個(gè)亞基構(gòu)成的雜聚蛋白質(zhì)含2、2四個(gè)亞基血紅蛋白血紅蛋白結(jié)構(gòu)寡聚蛋白質(zhì)與多聚蛋白質(zhì)的對(duì)稱(chēng)性多聚蛋白：病毒外殼多聚蛋白：病毒外殼多聚蛋白：病毒外殼小結(jié)：蛋

49、白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次從低到高可表示為：一級(jí)結(jié)構(gòu)（肽鏈結(jié)構(gòu)，指多肽鏈中的氨基酸排列順序）二級(jí)結(jié)構(gòu)（多肽鏈主鏈骨架盤(pán)繞折疊形成的有規(guī)律性的結(jié)構(gòu)）超二級(jí)結(jié)構(gòu)（相鄰二級(jí)結(jié)構(gòu)的聚集體）結(jié)構(gòu)域（在空間上可明顯區(qū)分的、相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域性結(jié)構(gòu)）三級(jí)結(jié)構(gòu)（球狀蛋白質(zhì)中所有原子在空間中的相對(duì)位置）四級(jí)結(jié)構(gòu)（亞基聚合體）三、蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級(jí)鍵：立體構(gòu)象的維持主要依靠次級(jí)鍵氫鍵離子鍵（鹽鍵）疏水的相互作用（疏水鍵）配位鍵范德華力肽鍵和二硫鍵屬于共價(jià)鍵第五節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與功能 蛋白質(zhì)分子具有多種多樣的生物功能是以其化學(xué)組成和極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。這不僅需要一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且還需要一定的空間構(gòu)象。研究蛋白質(zhì)的空

50、間構(gòu)象與生物功能的關(guān)系，已成為當(dāng)前分子生物學(xué)的一個(gè)重要方面。但是蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象歸根到底還是決定于其一級(jí)結(jié)構(gòu)和周?chē)h(huán)境的影響，因此研究一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系是十分重要的。一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能之間有密切關(guān)系。 1、種屬差異目前對(duì)不同機(jī)體中表現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序進(jìn)行較詳細(xì)的比較研究，發(fā)現(xiàn)種屬差異是十分明顯的。例如：分析、比較各種哺乳動(dòng)物、烏類(lèi)和魚(yú)類(lèi)等胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)是由51個(gè)氨基酸組成的，其排列順序大體相同，僅有細(xì)微差異。但是氨基酸殘基的細(xì)微改變并不影響胰島素的生物活性，或者說(shuō)這些變化的氨基酸殘基對(duì)胰島素的生物活性并不起決定的作用。據(jù)研究，起決定作

51、用的是其一級(jí)結(jié)構(gòu)中的相同部分，特別是二硫鍵對(duì)維持高級(jí)結(jié)構(gòu)起著重要的作用，非極性氨基酸對(duì)維持蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)也起著穩(wěn)定的作用。同源蛋白質(zhì)：不同生物體中執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì)。順序同源現(xiàn)象：同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序的相似性。種屬差異：是生物進(jìn)化的結(jié)果，不同種屬間的同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸差別越大，其親緣關(guān)系愈遠(yuǎn)，反之，其親緣關(guān)系愈近。細(xì)胞色素c（Cytc）：脊椎動(dòng)物104個(gè)氨基酸殘基，昆蟲(chóng) 108 氨基酸殘基，植物114個(gè)氨基酸殘基，與人的Cytc的差異見(jiàn)右表，其中 28個(gè)位置上的氨基酸殘基不隨種屬發(fā)生改變。一些生物與人的細(xì)胞色素C相差的氨基酸殘基數(shù)目2、分子病現(xiàn)在知道，幾乎所有遺傳病都與蛋白質(zhì)分

52、子結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，統(tǒng)稱(chēng)之為分子病。例如鐮刀型貧血癥，它是由于血紅蛋白的-亞基上的第六位氨基酸由谷氨酸變成了纈氨酸，導(dǎo)致血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的改變，其運(yùn)輸氧氣的能力大大地降低，并且紅細(xì)胞呈鐮刀狀。分子病：由于遺傳基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變某種蛋白質(zhì)的缺失所引起的疾病。鐮刀型貧血癥：HbA（鏈）: ValHisLeuThrProGluGluLysHbS（ 鏈）: ValHisLeuThrProValGluLys一級(jí)結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的喪失正常血紅細(xì)胞鐮刀狀紅細(xì)胞貧血僅僅由于這一點(diǎn)微細(xì)的差別，就使患者的紅細(xì)胞在氧氣缺乏時(shí)呈鐮刀狀，易脹破發(fā)生溶血，運(yùn)氧機(jī)能降低，引起頭昏、胸悶等貧血癥狀。

53、上述這些實(shí)例都說(shuō)明，每種蛋白質(zhì)分子都具有其特定的結(jié)構(gòu)來(lái)完成它特定的功能。甚至只有個(gè)別氨基酸的變化就能引起功能的改變或喪失，證實(shí)了蛋自質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的相適應(yīng)性，二者之間有高度統(tǒng)一性。小結(jié)：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)，而特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)又與蛋白質(zhì)的功能相適應(yīng)，當(dāng)一級(jí)結(jié)構(gòu)改變有時(shí)會(huì)影響其功能；同源蛋白質(zhì)的種屬差異另一方面又說(shuō)明有時(shí)一級(jí)結(jié)構(gòu)相差很大的蛋白質(zhì)又可能有相似的空間結(jié)構(gòu)，執(zhí)行相同的功能；而與功能相關(guān)的有關(guān)序列是高度保守的，當(dāng)它們改變時(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，功能也隨之喪失。二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的構(gòu)象并不是固定不變的。別構(gòu)現(xiàn)象：當(dāng)有些蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能時(shí)，其構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變了整個(gè)

54、分子的性質(zhì)，這種現(xiàn)象就稱(chēng)別構(gòu)現(xiàn)象。別構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能中的一種相當(dāng)普遍而又十分重要的現(xiàn)象。如血紅蛋白在表現(xiàn)其輸氧功能時(shí)的別構(gòu)現(xiàn)象。總之，各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象，而特定的空間構(gòu)象又與它們特定的生物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。第六節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)由氨基酸組成，因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)有些與氨基酸相似，但也有其特殊的性質(zhì)。一、蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)是相對(duì)分子質(zhì)量很大的生物大分子，相對(duì)分子質(zhì)量一般在100001000000之間或更大一些(表37)。測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的方法，除了根據(jù)蛋白質(zhì)的化學(xué)成分來(lái)測(cè)定外，主要還是利用蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)測(cè)定。主要方法有滲透壓

55、法、超離心法、凝膠過(guò)濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法。其中滲透壓法較簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求不高，但靈敏度較差。 最精確的方法是超離心法，但需要超速離心機(jī)。二、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)，但它的兩性電離比氨基酸復(fù)雜。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正、負(fù)電荷相等的時(shí)候，該溶液的pH就稱(chēng)為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處：電泳：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著所帶

56、電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。溶液最不穩(wěn)定溶解度最低，易沉淀粘度、滲透壓、膨脹性、導(dǎo)電性均最小三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑在1-100nm之間，且分子量大，具有膠體特征如布朗運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象，不能透過(guò)半透膜以及具有吸附能力等。1、利用Pr不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，可以通過(guò)透析法提取蛋白質(zhì)。2、蛋白質(zhì)是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，因?yàn)槠鋷в芯邩O性的電荷 ，故親水，且能形成一層水化膜，保持Pr分子。3、Pr分子在非等電狀態(tài)下帶有相同電荷易排斥，故不易沉淀。透析：利用大分子物質(zhì)不能透過(guò)半透膜來(lái)分離大小分子的過(guò)程。透析裝置天然生物膜：人工合成膜：如雞蛋膜、細(xì)胞膜常見(jiàn)的半透膜材料：玻璃紙、火棉紙、羊皮紙（由噻璐珞、噻璐玢制成）四、蛋白質(zhì)的沉淀作用使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱(chēng)為沉淀。1、鹽析2、有機(jī)溶劑沉淀法3、重金屬鹽沉淀4、生物堿試劑沉淀法5、弱酸或弱堿沉淀法1、鹽析在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱(chēng)為鹽溶。鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，