齲病病因及其免疫預(yù)防課件

1、齲病病因及其免疫預(yù)防課件齲病病因及其免疫預(yù)防課件 根據(jù)WHO 2004年報(bào)告齲病仍是人類最常見的疾病之一 根據(jù)WHO 2004年報(bào)告齲病仍是人類最常見齲病嚴(yán)重威脅人群的口腔健康第三次全國口腔健康流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果齲病嚴(yán)重威脅人群的口腔健康第三次全國口腔健康流行病學(xué)抽樣調(diào)查齲病的病因?qū)W四聯(lián)因素理論齲病預(yù)防控制致齲微生物增強(qiáng)宿主抵抗力控制高糖飲食齲病的病因?qū)W四聯(lián)因素理論齲病預(yù)防控制致齲微生物增強(qiáng)宿主抵齲病發(fā)病理論非特異性菌斑學(xué)說特異性菌斑學(xué)說齲病發(fā)病理論非特異性菌斑學(xué)說非特異性菌斑假說廣義齲病生態(tài)學(xué)假說非特異性菌斑假說廣義齲病生態(tài)學(xué)假說齲病發(fā)生并非少數(shù)幾種致齲菌作用的結(jié)果，菌斑生物膜的影響是一個(gè)

2、動(dòng)態(tài)過程，最終導(dǎo)致齲病發(fā)生。齲病發(fā)生并非少數(shù)幾種致齲菌作用的結(jié)果，菌斑生物膜的影響是一個(gè)I、動(dòng)態(tài)穩(wěn)定階段產(chǎn)酸脫礦再礦化、自穩(wěn)機(jī)制平衡該過程以非變異鏈球菌群和放線菌為主導(dǎo)I、動(dòng)態(tài)穩(wěn)定階段II、產(chǎn)酸階段糖類頻繁攝入，唾液量，無法中和酸菌斑pH下降并持續(xù)非變異鏈球菌群的產(chǎn)酸菌和耐酸適應(yīng)性增強(qiáng)放線菌、血鏈、口腔鏈球菌、戈登鏈球菌、輕鏈等產(chǎn)酸性，自適應(yīng)耐酸性菌群產(chǎn)酸潛力改變齲病發(fā)生II、產(chǎn)酸階段III、耐酸階段變異鏈球菌、乳桿菌在極端酸性條件上更具競(jìng)爭(zhēng)力pH4.0后，部分非變異鏈球菌和放線菌失去生存能力代之以變鏈菌、乳桿菌、雙岐桿菌III、耐酸階段特異性菌斑學(xué)說特異性菌斑學(xué)說口腔中各菌種在不同部位的檢出

3、水平口腔中各菌種在不同部位的檢出水平S. sanguis和 Mutans. S是在菌斑和齲病病損中最常檢出的菌種，兩者都能夠產(chǎn)酸，但只有Mutans. S能夠單獨(dú)在無菌動(dòng)物模型上產(chǎn)生齲齒。乳桿菌致齲始動(dòng)作用不明顯，促進(jìn)齲病進(jìn)展放線菌與根面齲發(fā)病有關(guān)S. mutans大鼠磨牙齲齒模型S. sanguis和 Mutans. S是在菌斑和齲病病損S. mutans作為主要致齲菌的流行病學(xué)證據(jù)S. mutans幾乎總是能從菌斑中被檢出。大多數(shù)齲損部位有10的S. mutans。大多未感染S. mutans的區(qū)域無齲病發(fā)生?？v向研究發(fā)現(xiàn) S. mutans促進(jìn)齲病的進(jìn)展。有研究顯示，如果兒童3歲前沒有感

4、染S. mutans，則趨向于保持未感染狀態(tài)幾年時(shí)間，直到第二牙列萌出時(shí)新的定植機(jī)會(huì)出現(xiàn)。S. mutans作為主要致齲菌的流行病學(xué)證據(jù)S. mutaS.Sobrinus 另一重要致齲菌隨著檢測(cè)手段的改進(jìn)， S.sobrinus在菌斑和齲損部位的檢出率明顯提高；與S.mutans相比 ，S.sobrinus的產(chǎn)酸性和耐酸性更強(qiáng)，S.sobrinus感染與高度齲活性的關(guān)系更為密切；研究發(fā)現(xiàn)口腔中同時(shí)感染S.mutans和S.sobrinus的兒童，其齲活性顯著高于單一菌種感染者。 S.Sobrinus 另一重要致齲菌隨著檢測(cè)手段的改進(jìn)，S.Sobrinus的表面蛋白抗原SpaA和葡糖基轉(zhuǎn)移酶GT

5、F與S.mutans的PAc和GTF之間具有較高的同源性，兩菌之間具有交叉反應(yīng)性。S.mutansS.Sobrinus免疫電鏡顯示，抗S.Sobrinus的多克隆抗體也可以和S.mutans反應(yīng)S.Sobrinus的表面蛋白抗原SpaA和葡糖基轉(zhuǎn)移酶GT細(xì)菌粘附和聚集致齲過程的初始致齲菌主要依靠蔗糖非依賴性和蔗糖依賴性機(jī)制粘附聚集在牙面，代謝糖類產(chǎn)生乳酸，造成牙齒脫礦，齲病開始。細(xì)菌的粘附聚集機(jī)制包括：蔗糖非依賴性粘附表面蛋白抗原（PAc）蔗糖依賴性粘附葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTF）葡聚糖結(jié)合蛋白（GBP）細(xì)菌粘附和聚集致齲過程的初始致齲菌主要依靠蔗糖非依賴性和ToothPellicleS. muta

6、nsS. mutansS. mutansS. mutansS. mutans= GBP= Glucan= GTF=PAc致齲菌粘附和聚集模式圖ToothPellicleS. mutansS. mutan致齲菌的重要毒力因子信號(hào)肽富含丙氨酸富含脯氨酸錨 基唾液結(jié)合區(qū)段，粘附功能區(qū)（A區(qū)，SBR） 免疫活性區(qū)（P區(qū)）0 500aa 1000aa 1500aaPAc S. mutans: PAc, Ag I/II or P1；S.sobrinus: SpaA or PAg 兩者之間存在明顯的序列同源性(66%) PAc 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 位于氨基端1/3富含丙氨酸的重復(fù)序列唾液結(jié)合區(qū) 位于中部富含脯氨酸的

7、重復(fù)序列免疫活性區(qū)致齲菌的重要毒力因子信號(hào)肽富含丙氨酸富含脯氨酸錨 基唾液結(jié)合針對(duì)完整的PAc 蛋白或其唾液結(jié)合區(qū)的抗體能夠阻斷S.mutans的粘附對(duì)大鼠免疫S.sobrinus的SpaA 蛋白能夠保護(hù)大鼠抵抗S.sobrinus感染 (Redman et al., 1995)針對(duì)完整的PAc 蛋白或其唾液結(jié)合區(qū)的抗體能夠阻斷S.mut0 500aa 1000aa 1500aa催化區(qū)段（CAT區(qū)）葡聚糖結(jié)合區(qū)段（GLU區(qū)）信號(hào)肽GTF S.mutans 和 S. sobrinus 都能合成幾種 GTFs，其中 GTF-I在兩種細(xì)菌之間具有56.7%的序列同源性 GTF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 位于氨基端

8、1/3催化活性區(qū)：催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖 靠近羧基端的重復(fù)序列葡聚糖結(jié)合區(qū)0 S.mutans 至少分泌三種具有葡聚糖結(jié)合活性的蛋白: GbpA, GbpB, GbpC GpbB已經(jīng)被證明能夠在實(shí)驗(yàn)性齲齒動(dòng)物上誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫反應(yīng) (Smith and Taubman, 1996, 1997) 通過唾液腺區(qū)皮下注射GpbB(Smith and Taubman, 1996) 或者通過鼻腔粘膜免疫 (Smith et al., 1997)都可以達(dá)到保護(hù)效果 相對(duì)于PAc和GTFs，研究較少GBP S.mutans 至少分泌三種具有葡聚糖結(jié)合活性的蛋白: 機(jī)體粘膜免疫共同粘膜免疫系統(tǒng)（CMIS）

9、抗原通過接觸腸、鼻腔、支氣管或泌尿生殖道等部位的粘膜相關(guān)淋巴組織，不僅可以在誘導(dǎo)部位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，而且能夠在遠(yuǎn)離誘導(dǎo)部位的局部粘膜產(chǎn)生免疫反應(yīng)。機(jī)體不同部位的粘膜構(gòu)成一個(gè)相互聯(lián)系的免疫網(wǎng)絡(luò)，稱為共同粘膜免疫系統(tǒng)。機(jī)體粘膜免疫共同粘膜免疫系統(tǒng)（CMIS）抗原通過接觸腸、鼻腔DomePeyers Patch (GALT)Antigens MLNTDBloodMucosalHomingGastrointestinal tractUpper respiratory tract ?Genitourinary tract ?Lamina PropriaMammarySalivaryLachrymalSwe

10、at ?GlandssIgA+B cellsCD4+T cellsMALTTonsils / Adenoids(NALT)T Cell Zone (35 - 40 %)B Cell Zone (45 - 50 %)CD4+ T Cells - naiveCD4+ T Cells - activatedCD4+ T Cells - memoryCD8+ CTLsgd T CellsSurface IgA+ActivatedResting5 - 8 % 40 % 60 %MHC Class II+ APCsDendritic and B Cells, MBloodMucosal Effector

11、SitesMucosal Inductive Sites Are MALTM CellLymphoepitheliumEpithelial CellsPlasma CellJ chainmIgAdIgAS-IgASCpIgA TransportAg UptakeDomePeyers Patch (GALT)Antige唾液分泌性IgA (sIgA)是唾液中的主要免疫球蛋白，其功能包括：抑制微生物在粘膜上皮和牙齒表面的黏附中和毒素和酶類（如GTF）中和病毒抗原捕獲和抗原清除與非特異性防御機(jī)制相互作用（如黏液素、乳鐵蛋白、溶菌酶等）唾液分泌性IgA (sIgA)是唾液中的主要免疫球蛋白，其功免疫防

12、齲的理論基礎(chǔ)致齲菌明確： S.mutans和S.sobrinus被認(rèn)為是主要致齲菌抗原清楚： 表面蛋白抗原PAc、SpaA 葡糖基轉(zhuǎn)移酶（GTFs） 葡聚糖結(jié)合蛋白（Gbp）免疫系統(tǒng)的作用成分已知： 唾液中的sIgA抗體對(duì)防齲起主要作用免疫防齲的理論基礎(chǔ)致齲菌明確：抗原清楚：免疫系統(tǒng)的作用成分已S.mutans和S.sobrinus在幼兒18-24個(gè)月的時(shí)候開始穩(wěn)定定植于口腔，這段時(shí)間稱為“感染窗口”。致齲菌一旦穩(wěn)定定植，則很難再徹底清除。因此最佳的免疫時(shí)段應(yīng)該在致齲菌穩(wěn)定定植前，大約幼兒1歲左右。免疫時(shí)機(jī)S.mutans和S.sobrinus在幼兒18-24個(gè)月的盡管剛出生的嬰兒唾液中不含分

13、泌性IgA，嬰兒1個(gè)月時(shí)成熟的IgA已經(jīng)是唾液中主要的免疫球蛋白了;69個(gè)月時(shí)，大多數(shù)嬰兒已具有了類似成人的IgA1和IgA2亞型分布（Smith and Taubman, 1993）;提示嬰兒接近1歲的時(shí)候，粘膜免疫反應(yīng)開始出 現(xiàn)明顯的成熟.？粘膜免疫系統(tǒng)是否足夠成熟盡管剛出生的嬰兒唾液中不含分泌性IgA，嬰兒1個(gè)月時(shí)成熟的I免疫途徑口腔免疫通過誘導(dǎo)腸相關(guān)淋巴組織產(chǎn)生粘膜IgA反應(yīng)，可采用口服、灌胃等方法;缺點(diǎn)是胃酸和各種酶會(huì)對(duì)抗原產(chǎn)生破壞作用，并且誘導(dǎo)位點(diǎn)（腸）和效應(yīng)位點(diǎn)（口腔）距離遠(yuǎn);通過口腔免疫可以改變變形鏈球菌的感染和齲病發(fā)生進(jìn)程; 動(dòng)物模型（ Smith et al., 1979)

14、 ; 人體實(shí)驗(yàn)（Smith and Taubman, 1987).免疫途徑口腔免疫通過誘導(dǎo)腸相關(guān)淋巴組織產(chǎn)生粘膜IgA反應(yīng)，可鼻腔免疫較新使用的免疫途徑，通過誘導(dǎo)鼻相關(guān)淋巴組織產(chǎn)生粘膜IgA反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)是鼻腔環(huán)境對(duì)抗原的降解作用小，因此需要的抗原劑量?。灰子诓僮?；誘導(dǎo)位點(diǎn)（鼻腔）和效應(yīng)位點(diǎn)（口腔）距離近；同時(shí)誘導(dǎo)粘膜和系統(tǒng)免疫通過鼻腔免疫可以獲得明顯的防齲保護(hù)效果 （Kats et al., 1993；Fan et al., 2002）鼻腔免疫較新使用的免疫途徑，通過誘導(dǎo)鼻相關(guān)淋巴組織產(chǎn)生粘膜I扁桃體免疫通過刺激腭扁桃體誘導(dǎo)免疫反應(yīng)兔扁桃體局部給予福爾馬林滅活的 S.sobrinus 細(xì)胞能夠誘導(dǎo)

15、唾液免疫反應(yīng)，明顯降低S.sobrinus的感染（Fukuizumi et al.,1999）重復(fù)扁桃體免疫能夠誘導(dǎo)兔大小唾液腺中產(chǎn)生IgA抗體分泌細(xì)胞（Inoue et al., 1999）扁桃體免疫通過刺激腭扁桃體誘導(dǎo)免疫反應(yīng)小唾液腺免疫唇、頰、軟腭小唾液腺，它們具有與淋巴組織緊密相連的分泌導(dǎo)管S.sobrinus GTF 局部用于年輕成人的下唇粘膜表面，與安慰劑組相比，免疫組在隨后6周的時(shí)間里全唾液中的總鏈球菌比例明顯降低（Smith and Taubman,1990）小唾液腺免疫唇、頰、軟腭小唾液腺，它們具有與淋巴組織緊密相連直腸免疫一個(gè)遠(yuǎn)端的粘膜免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)，分布著高密度的淋巴濾泡

16、初步研究表明這一途徑也能誘導(dǎo)針對(duì)GTF的唾液IgA反應(yīng).（Lam et al., 2001）使用肛栓可作為幼兒使用鼻腔免疫的替代直腸免疫一個(gè)遠(yuǎn)端的粘膜免疫誘導(dǎo)位點(diǎn)，分布著高密度的淋巴濾泡 皮下和其它系統(tǒng)免疫最初使用 S.mutans 全細(xì)胞作為免疫原;為了避免產(chǎn)生心臟交叉反應(yīng)性抗體，亞單位疫苗和多肽疫苗被用于系統(tǒng)免疫以控制齲齒;大鼠唾液腺周圍皮下注射GTF或合成肽誘導(dǎo)了高水平的血清和唾液IgA反應(yīng)，抑制了致齲菌口腔定植和齲病發(fā)生（Taubman et al.）。 皮下和其它系統(tǒng)免疫最初使用 S.mutans 全細(xì)胞作為免疫免疫效果評(píng)價(jià)體內(nèi)研究：唾液中特異性的sIgA抗體水平（ELISA）是否干

17、擾致齲菌在牙面的定植（細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)）齲齒動(dòng)物模型的患齲水平（Keyes記分）體外研究：免疫血清/唾液引起致齲菌的凝集抑制致齲菌在羥磷灰石表面的黏附影響生物膜的形成和結(jié)構(gòu)免疫效果評(píng)價(jià)體內(nèi)研究：體外研究：免疫防齲研究方向主動(dòng)免疫防齲（防齲疫苗）亞單位疫苗合成肽疫苗細(xì)菌活載體疫苗DNA疫苗被動(dòng)免疫防齲在牛奶或雞蛋黃中產(chǎn)生針對(duì)變形鏈球菌的抗體鼠單克隆抗體免疫防齲研究方向主動(dòng)免疫防齲（防齲疫苗）亞單位疫苗被動(dòng)免疫防 牛奶多克隆抗體 雞蛋黃IgY抗體被 動(dòng) 免 疫 牛奶多克隆抗體 被 動(dòng) 免 疫 construction of GTase-I overexpressing strain B29-33 in

18、tramuscular immunization specific cow milk antibodies mouth rinsing colonization level of S.mutan on teeth surface Effect of specific bovine milk antibodies against dental caries Effect of specific bovine mil齲病病因及其免疫預(yù)防課件killed S.mutans, S.sobrinus whole cellsegg yolk IgYeffect of specific IgY on car

19、iesprevention in animal modelsintramuscularimmunizationEffect of specific IgY on prevention of dental carieskilled S.mutans, S.sobrinus wh（江千舟，樊明文等，2001）（江千舟，樊明文等，2001）主 動(dòng) 免 疫主 動(dòng) 免 疫亞單位疫苗以生物化學(xué)和物理方法提取純化PAc、GTFs等特異性抗原，或利用基因重組技術(shù)將PAc、GTFs等抗原的基因片段克隆到原核高效表達(dá)載體中，使之大量表達(dá)，再將其提取純化制成的疫苗。 代表性研究Childers等提取了GTF蛋白用于

20、臨床研究（2002, 2003, 2006）Michalek等制備了融合PAc SBR區(qū)和GTF GLU區(qū)的重組蛋白（2002）亞單位疫苗以生物化學(xué)和物理方法提取純化PAc、GTFs等特異合成肽疫苗合成肽疫苗是根據(jù)致齲菌毒力因子的重要免疫原性和功能區(qū)的氨基酸序列，人工合成的十到數(shù)十個(gè)氨基酸殘基的短肽疫苗。 Taubman，Smith等合成了對(duì)應(yīng)GTF的CAT區(qū)和GLU區(qū)的多肽（2005，2007）代表性研究合成肽疫苗合成肽疫苗是根據(jù)致齲菌毒力因子的重要免疫原性和功能將PAc和GTFs等抗原的基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒中，然后將質(zhì)?？寺〉捷d體菌中，由載體菌在體內(nèi)攜帶和表達(dá)。常用的載體菌有減毒沙門氏菌

21、和乳鏈球菌。 細(xì)菌活載體疫苗 代表性研究Redman等構(gòu)建了表達(dá)S.sobrinus表面蛋白SpaA的重組沙門氏菌（1994）凌均棨等研究了基因重組乳鏈球菌防齲疫苗（1999） 將PAc和GTFs等抗原的基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒中，然后將質(zhì)DNA疫苗將攜帶抗原基因的真核表達(dá)載體直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)對(duì)抗原基因所表達(dá)的蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。 代表性研究樊明文等分別以pCI和pVAX1為載體研制了針對(duì)PAc和GTF的防齲DNA疫苗（口腔醫(yī)學(xué)縱橫, 2000；J Dent Res, 2002；Vaccine, 2006）劉天佳等以pcDNA3.1為載體，研制了分別針對(duì)PAc和GTF的防齲DN

22、A疫苗 （華西口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2001）Han等構(gòu)建了編碼變鏈菌壁相關(guān)蛋白WapA的DNA疫苗（DNA Cell Biol, 2005 ）DNA疫苗將攜帶抗原基因的真核表達(dá)載體直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，誘防 齲 DNA 疫 苗防 齲 DNA 疫 苗防齲DNA疫苗pCIA-P融合防齲DNA疫苗pGLUA-P防齲DNA疫苗pCIA-P融合防齲DNA疫苗pGLUA-P靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P人用靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P/VAX靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P人用靶向融合防齲DNA疫苗復(fù)合防齲DNA疫苗pGJGAC/VAX復(fù)合防齲DNA疫苗pGJGAC/VAXcy3-SABC法，抗PA

23、c 抗體cy3-SABC法，抗GTF 抗體陰性對(duì)照防齲質(zhì)粒DNA在體外真核細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白cy3-SABC法，抗PAc 抗體cy3-SABC法，抗GT在大鼠股四頭肌中的表達(dá)陰性對(duì)照防齲質(zhì)粒DNA在肌肉組織中表達(dá)抗原蛋白在大鼠股四頭肌中的表達(dá)陰性對(duì)照防齲質(zhì)粒DNA在肌肉組織中表達(dá)在大鼠頜下腺導(dǎo)管中的表達(dá)陰性對(duì)照防齲質(zhì)粒DNA在頜下腺組織中表達(dá)抗原蛋白 在大鼠頜下腺導(dǎo)管中的表達(dá)陰性對(duì)照防齲質(zhì)粒DNA在頜下腺組織中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 BALB/c小鼠 疫苗防齲保護(hù)實(shí)驗(yàn)（大鼠齲病模型） 日本大耳白兔 金黃毛地鼠 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 通過粘膜途徑免疫，靶向防齲DNA疫苗能夠在小鼠、大鼠、金黃毛地鼠、兔等多種動(dòng)物體

24、內(nèi)誘導(dǎo)特異性的唾液IgA和血清IgG抗體齲齒模型研究顯示靶向防齲DNA疫苗能夠顯著降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的齲齒水平 肌肉注射免疫 鼻腔粘膜免疫 E DS DM E DS DM 49% 43% 52% 57% 63% 70%靶向防齲DNA疫苗免疫金黃毛地鼠后的齲齒降低率通過粘膜途徑免疫，靶向防齲DNA疫苗能夠在小鼠、大鼠、金黃毛正常大鼠磨牙縱切面齲壞防齲質(zhì)粒DNA免疫定菌鼠磨牙縱切面患齲情況正常大鼠磨牙縱切面齲壞防齲質(zhì)粒DNA免疫定菌鼠磨牙縱切面患齲未免疫大鼠磨牙縱切面患齲情況未免疫大鼠磨牙縱切面患齲情況靶向疫苗pGJA-P/VAX免疫獼猴實(shí)驗(yàn)研究 采集鼻腔分泌物樣本采集唾液樣本采集血液樣本靶向疫苗pGJ

25、A-P/VAX免疫獼猴實(shí)驗(yàn)研究 采集鼻腔分泌物A組（2只，1和2）經(jīng)三角肌注射pGJA-P/VAXB組（2只，3和4）經(jīng)鼻滴注pGJA-P/VAX/bupivacaine復(fù)合物C組（1只，5）經(jīng)三角肌注射pVAX1D組（1只，6）經(jīng)鼻滴注pVAX1/bupivacaine復(fù)合物唾液抗PAc特異性SIgA抗體中，2、3和4號(hào)猴免疫后2月和3月時(shí)較免疫前顯著升高，并以2、4號(hào)猴水平最高。1號(hào)和對(duì)照猴（5和6號(hào)）沒有顯著變化。唾液抗GTF特異性SIgA抗體中，2、3和4號(hào)猴免疫后2月和3月時(shí)較免疫前顯著升高，并以2、4號(hào)猴水平最高。1號(hào)和對(duì)照猴（5和6號(hào)）沒有顯著變化 A組（2只，1和2）經(jīng)三角肌注

26、射pGJA-P/VAX唾液鼻腔分泌物抗PAc特異性SIgA抗體中，2、3和4號(hào)猴免疫后2月和3月時(shí)較免疫前顯著升高，并以2、4號(hào)猴水平最高；1號(hào)和對(duì)照猴（5和6號(hào)）沒有顯著變化。鼻腔分泌物抗GTF特異性SIgA抗體中，2、3和4號(hào)猴免疫后2月和3月時(shí)較免疫前顯著升高，并以2、4號(hào)猴水平最高；1號(hào)和對(duì)照猴（5和6號(hào)）沒有顯著變化。 鼻腔分泌物抗PAc特異性SIgA抗體中，2、3和4號(hào)猴免疫后 1號(hào)猴， 2號(hào)猴，3號(hào)猴， 4號(hào)猴， 5號(hào)猴， 6號(hào)猴 1號(hào)和2號(hào)猴免疫后一個(gè)月時(shí)血清抗PAc IgG抗體水平就比免疫前高16倍；3號(hào)猴免疫后3個(gè)月時(shí)血清抗PAc IgG抗體水平也達(dá)到比免疫前高16倍；4號(hào)

27、猴免疫后3個(gè)月時(shí)血清抗PAc IgG抗體水平達(dá)到比免疫前高8倍；5號(hào)和6號(hào)免疫前后血清抗PAc IgG抗體水平無顯著變化。 1號(hào)和2號(hào)猴免疫后一個(gè)月時(shí)血清抗GTF IgG抗體水平就比免疫前高16倍，2個(gè)月時(shí)達(dá)32倍；3號(hào)猴免疫后2個(gè)月時(shí)血清抗PAc IgG抗體水平也達(dá)到比免疫前高8倍；4號(hào)猴免疫后1個(gè)月時(shí)血清抗PAc IgG抗體水平達(dá)到比免疫前高16倍，3個(gè)月時(shí)達(dá)32倍；5號(hào)和6號(hào)免疫前后血清抗PAc IgG抗體水平無顯著變化。 1號(hào)猴， 2號(hào)猴，3號(hào)猴， 4號(hào)猴， 5號(hào)猴， 防齲DNA疫苗現(xiàn)狀 研制融合疫苗從實(shí)驗(yàn)室研究到中試生產(chǎn) DNA疫苗的免疫機(jī)制 防齲DNA疫苗現(xiàn)狀齲病病因及其免疫預(yù)防課

28、件 與武漢生物制品研究所合作正在進(jìn)行防齲DNA疫苗的中試研究，小規(guī)模中試產(chǎn)品質(zhì)量已達(dá)到預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則的要求。 1. 發(fā)酵工藝用14升罐發(fā)酵，獲得濕菌67克 用50升發(fā)酵罐發(fā)酵，獲得濕菌450克 2. 質(zhì)粒純化工藝研究 （1）質(zhì)粒的粗提:堿裂解法 防齲DNA疫苗的中試生產(chǎn) 與武漢生物制品研究所合作正在進(jìn)行防齲DNA疫（2）號(hào)柱層析：去除RNA、細(xì)菌蛋白、宿主菌基因組DNA （3）號(hào)柱層析：捕獲超螺旋質(zhì)粒 0D260/OD280大于1.75 細(xì)菌殘余蛋白含量小于0.001ug/ug質(zhì)粒 瓊脂糖電泳后RNA肉眼不可見 超螺旋質(zhì)粒含量80% （2）號(hào)柱層析：去除RNA、細(xì)菌蛋白

29、、宿主菌基因組DNA （4）號(hào)柱層析：去除內(nèi)毒素 內(nèi)毒素降至0.01EU/ug 3. 建立了產(chǎn)品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)： 細(xì)菌蛋白定量檢測(cè)方法 RNA殘留檢測(cè)方法 細(xì)菌殘余DNA檢測(cè)方法 內(nèi)毒素檢測(cè)方法 （4）號(hào)柱層析：去除內(nèi)毒素 小規(guī)模中試產(chǎn)品小規(guī)模中試產(chǎn)品樹突狀細(xì)胞在靶向防齲DNA疫苗免疫中的作用機(jī)制研究靶向防齲DNA疫苗編碼的蛋白能否與樹突狀細(xì)胞特異結(jié)合？靶向疫苗對(duì)樹突狀細(xì)胞的免疫相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生的影響。粘膜免疫誘導(dǎo)部位和系統(tǒng)免疫部位的樹突狀細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異。樹突狀細(xì)胞在靶向防齲DNA疫苗免疫中的作用機(jī)制研究靶向防齲D靶向防齲DNA疫苗編碼的蛋白能否與樹突狀細(xì)胞（DC）特異結(jié)合？問題1靶向防齲

30、DNA疫苗編碼的蛋白能否與樹突狀細(xì)胞（DC）特異結(jié)合靶向融合蛋白與DC的靶向結(jié)合能力研究 1. 人外周血來源的DC的培養(yǎng)和鑒定 淋巴細(xì)胞分離液離心 400g 30min外周血單個(gè)核細(xì)胞單核細(xì)胞磁珠分選樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)MorphologySurface marker Function稀釋外周血靶向融合蛋白與DC的靶向結(jié)合能力研究 1. 人外周血來源的D典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)（40）典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)（40）典型的表面分子標(biāo)志低表達(dá) CD14、CD83，高表達(dá)CD1a、CD80、CD86 、CD40典型的表面分子標(biāo)志低表達(dá) CD14、CD83，高表達(dá)CD1a明顯的刺激T細(xì)胞增殖功能明顯的刺激T細(xì)

31、胞增殖功能2. 靶向融合蛋白與DC的靶向結(jié)合作用研究1）靶向質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清，制備靶向融合蛋白2）分組： A: 單純DC B: DC與靶向融合蛋白共孵育 C: 封閉B7分子的DC與靶向融合蛋白共孵育3）流式細(xì)胞術(shù)比較三組DC結(jié)合靶向融合蛋白的量2. 靶向融合蛋白與DC的靶向結(jié)合作用研究1）靶向質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C齲病病因及其免疫預(yù)防課件三組之間平均熒光強(qiáng)度比較分組 平均熒光強(qiáng)度單位* p0.05，單因素方差分析和 LSD 檢驗(yàn)A 3.797.814.49B* 7.3410.868.95C 4.936.687.77三組之間平均熒光強(qiáng)度比較分組 平均熒光強(qiáng)度單位* p0.0問題2 靶向防

32、齲DNA疫苗與樹突狀細(xì)胞相互作用后，樹突狀細(xì)胞有哪些特異的基因表達(dá)變化？問題2 靶向防齲DNA疫苗與樹突狀細(xì)胞相互作用后，樹突靶向防齲DNA疫苗和非靶向防齲DNA疫苗分別轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞3天后收集樹突狀細(xì)胞分離RNA合成探針與樹突狀細(xì)胞/抗原提呈細(xì)胞芯片雜交芯片掃描及數(shù)據(jù)分析靶向防齲DNA疫苗和非靶向防齲DNA疫苗分別轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞Targeted groupnon-targeted groupTargeted groupnon-targeted gro與非靶向組相比，靶向DNA疫苗轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞有27個(gè)免疫相關(guān)基因上調(diào)，7個(gè)免疫相關(guān)基因下調(diào)。差異表達(dá)基因按功能分為5類： 1）細(xì)胞因子、趨化因

33、子及其受體 2）抗原攝取 3）抗原提呈 4）細(xì)胞表面受體 5）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與非靶向組相比，靶向DNA疫苗轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞有27個(gè)免疫相熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果gene nameprimersannealing Temperature()Pouduct length (bp)GAPDHF: 5AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC 3R : 5TCCACCACCCTGTTGCTGTA 357203Ccl17F: 5TGCTGCCTGGATTACTTCAA 3R: 5CCCTGGACAGTCAGAAACAC 358110Ccl19F: 5AGCCTTCCGCTACCTTCTTA 3R: 5GCTG

34、TTGCCTTTGTTCTTGG 358160CD207F: 5CTACAAGGCAGCAGATGGAA 3R: 5GACACCCTGATATTGGCACA 358177cd209aF: 5GAGATGACGGCTGGAATGAC 3R: 5GAGATGGTGGAGGGAGTTGG 358109Cst7F: 5CTTGCCCTCTGCTGCCTAA 3R: 5GCACTCCTGGGTTATTGGTC 359127IFNF: 5AGCAACAACATAAGCGTCAT 3R: 5CCTCAAACTTGGCAATACTC 358100IL-4F: 5CATCCTGCTCTTCTTTCTCG 3R:

35、 5CCTTCTCCTGTGACCTCGTT 358105熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果gene nameprimersaGene namesTargeted groupNon-targeted groupRatioCCL172.14E-022.27E-039.43CCL191.56E-011.24E-0212.58CD2073.71E-021.13E-023.28CD209a1.43E-012.63E-025.44CST72.37E-021.11E-022.14IFN r2.33E-021.16E-022.00IL-43.04E-021.07E-022.84Gene namesTargeted groupNon-ta結(jié)論： 一組免疫相關(guān)基因在靶向DNA疫苗增強(qiáng)免疫反應(yīng)的過程中發(fā)揮作用，其中CCL17 和 CCL19可能更為關(guān)鍵。結(jié)論： 一組免疫相關(guān)基因在靶向DNA疫苗增強(qiáng)免疫反應(yīng)問題3 DNA疫苗通過粘膜途徑和系統(tǒng)途徑免疫后誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)具有明顯的差異。 是否粘膜免疫誘導(dǎo)部位的樹突狀細(xì)胞和系統(tǒng)免疫部位不同？問題3 DNA疫苗通過粘膜途徑和系統(tǒng)途徑免疫后誘導(dǎo)的抗免疫磁珠法從小鼠派伊爾結(jié)分離粘膜樹突狀細(xì)胞 單細(xì)胞懸液與抗小鼠CD11c抗體包被的磁珠共孵