DB11-T 819-2011-錦鯉皰疹病毒病診斷技術(shù)規(guī)范-（高清有效）

1、ICS 11.220B 41備案號(hào)：31304-2011DB11B 41北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T 8192011錦鯉皰疹病毒病診斷技術(shù)規(guī)范Technical protocol for diagnosis of Koi Herpesvirus Disease20112011080920111201北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā) 布DB11/T 8192011DB11/T 8192011前言GB/T 1.12009本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)業(yè)局組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王姝、徐立蒲、張振國(guó)、王靜波、曹歡、賈麗、殷守仁。IIDB11/T

2、 8192011DB11/T 8192011DB11/T 8192011采集的樣品不得腐敗。4.5 信息采集需采集鯉或錦鯉發(fā)病情況、混養(yǎng)其它魚(yú)類發(fā)病情況、采樣水溫等信息。DB11/T 8192011采集的樣品不得腐敗。4.5 信息采集需采集鯉或錦鯉發(fā)病情況、混養(yǎng)其它魚(yú)類發(fā)病情況、采樣水溫等信息。錦鯉皰疹病毒病診斷技術(shù)規(guī)范范圍PCR定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于錦鯉皰疹病毒病的診斷。（）GB/T 66822008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SC/T 7103 水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。下列縮略語(yǔ)適用于本文件。KHV：錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus）KHVD：錦鯉

3、皰疹病毒?。↘oi herpesvirus disease） PCR: 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction） DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）Taq酶：Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate）樣品要求水溫采集樣品時(shí)的水溫應(yīng)在1632。品種采樣品種為錦鯉或鯉。數(shù)量按照SC/T 7103執(zhí)行。狀態(tài)1KHVD最顯著的特征為爛鰓, 鰓出血并產(chǎn)生大量黏液,鰓絲潰爛；體表出現(xiàn)蒼白的塊斑和水泡；鰭條和尾鰭充血；鱗片上出現(xiàn)血絲；

4、眼球凹陷；口腔和腹部充血和出血。KHVD混養(yǎng)池塘中,只有鯉或錦鯉（且不論大?。┥『退劳?而其它種類，如金魚(yú)、草魚(yú)等無(wú)此現(xiàn)象；水溫在1830時(shí),特別是在2528時(shí), 鯉或錦鯉大量死亡,當(dāng)水溫升高或降低時(shí),死亡現(xiàn)象下降或停止；死亡極快，一條健康魚(yú)從出現(xiàn)臨床癥狀到死只有24h48h；死亡率極高，疾病發(fā)生后在10天內(nèi),PCR試劑和材料PCR試劑和材料GB/T 66822008KHVTaq：20dNTP：10 mmoL/L。：25mmoL/L。KHV409bp100pmoL/LKHV-TK-F: 5-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3；KHV-TK-R: 5-CAC-CCA-GTA-GAT

5、-TAT-GC-3。KHVSph292bp100pmoL/LKHV-Sph-R：5-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GCT-CGC-3。DEPC（DEPC）器材和設(shè)備2PCR樣品處理體長(zhǎng)小于4m4m6cm包括腎6cm取腎、脾、鰓；無(wú)臨床癥狀的魚(yú)，另外需加取腸和腦組織。：10（A.1450L1.5mL450LCTAB（A.2），25作用 2 小時(shí)。DNA600L（A.3），12000r/min5min， 約700L參見(jiàn)附錄12000r/min取上層水相（600L）1.5（900L）離心管于20下，至少后取出。12000r/min30min，11L DEPCPCRDNAKHV-TK100L

6、0.2mL10L2.5L dNTP、10L 0L10倍Taq（A.5、HV-TK-R和 KHV-K-F各L、2.U TaqDEPC100LPCR：945min；951min、501min、721min，40；7210min；4保溫。KHV-Sph100L0.2mL10L2LdNTP、L10L10TaqKHV-Sph-RKHV-Sph-F0.5L、2.5UTaqDEPC 100LPCR30s6330s72 30s，40；727min；4設(shè)立對(duì)照6.3KHV瓊脂糖電泳用TBE（A.6），配制1.5%（含1L/mL EB，參見(jiàn)附錄A.7）6L樣品和2L（5V/cm0.5h3DB11/T 819201

7、1結(jié)果判定PCRKHV-TK409bpDNAKHV-Sph，PCR292bpDNAPCR409bp/292bpDNAKHVD。，PCR409bp/292bpDNAKHV的樣品可經(jīng)基因測(cè)序確定是 KHV 后，判定為 KHV 陽(yáng)性。PCR409bp292bpDNAKHV44DB11/T 8192011DB11/T 8192011附 錄 A（資料性附錄）試劑配制A.1 磷酸鹽緩沖液稱取氯化鈉（NaCl）7.9g，氯化鉀（KCl）0.2g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.24g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.8g，溶于800mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至7.4，最后加蒸餾水定容至1L。CTAB溶液按C

8、TAB（hexadecyl trimethy ammonium bromide）2%，氯化鈉（NaCl）1.4moL/L（Tris-HCl）20mmoL/L7.5，巰基乙醇至終濃度為0.25%。抽提液1 mmoL/L 三羥基氨基甲烷飽和酚（Tris-飽和酚）、三氯甲烷（CHCl3）、異戊醇（C5H12O）按25：24：1的比例混合，密閉避光保存。抽提液抽提液三氯甲烷（CHCl3）、異戊醇（C5H12O）按24：1的比例混合，密閉避光保存。10Taq按三羥基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl，酸堿度8.8）500mmoL/L，氯化鉀（KCl）500mmoL/L，聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）1%配制。TBE（5）稱取三羥基氨基甲烷（Tris）54g，硼酸（HBO3）27.5g，乙二胺四乙酸（EDTA）2.9g，加水至1000mL，用稀鹽酸（HCl）調(diào)節(jié)酸堿度到8.0。EB （Ethi