遺傳工程動(dòng)物模型PPT

1、關(guān)于遺傳工程動(dòng)物模型第一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 概述 人們經(jīng)過了長期不懈的努力，渴望揭開生命之謎，雖有進(jìn)展，但謎仍然是謎。然而，隨著2001年6月人類基因組草圖公布，生命科學(xué)也隨著進(jìn)入到一個(gè)新的紀(jì)元后基因組時(shí)代，即由結(jié)構(gòu)基因組轉(zhuǎn)向功能基因組的研究，大規(guī)模、系統(tǒng)地研究基因功能及其在生理和病理過程中的作用。因此，遺傳工程動(dòng)物模型是必不可少的研究工具。第二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一 、 定 義 運(yùn)用各種技術(shù)手段有目的地干預(yù)動(dòng)物的遺傳組成，導(dǎo)致動(dòng)物新的性狀的出現(xiàn)，并使其能有效地遺傳下去，形成新的可供生命科學(xué)研究和其他目的所用的動(dòng)物模型，這類動(dòng)物可被稱為遺傳工

2、程動(dòng)物模型。第三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二 、 技術(shù)手段 顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù) 基因定位突變技術(shù) 化學(xué)或放射誘變技術(shù)第四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月顯微注射法胚胎干細(xì)胞法 (embryonic stem cells，ES細(xì)胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法細(xì)胞核移植ENU誘變?nèi)?、基本方法第五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Gordon等人首次成功地將含有HSV和SV40DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，得到了帶有這種外源DNA順序TGM。1982年P(guān)almiter等運(yùn)用此法得到的所謂“超級巨鼠”,曾引起整個(gè)生

3、物學(xué)界的轟動(dòng)。第六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月到目前為止，人類已獲得轉(zhuǎn)基因魚、鼠、羊、豬、兔、牛等等大小動(dòng)物。從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所獲得的資料幾乎涉及醫(yī)學(xué)遺傳、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等的基因研究，還涉及生物藥物的研究，基因治療的開發(fā)研究等。第七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 一 、概 念 通過實(shí)驗(yàn)手段將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到動(dòng)物生殖細(xì)胞中，并能穩(wěn)定遺傳，由此獲得的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 遺傳改變： 外源DNA的插入使基因組中任何一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變； 外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排； 導(dǎo)入可以持久存在的遺傳實(shí)體。 第八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 二 、 基本原理目的基因

4、：顯微注射 受精卵或胚胎細(xì)胞 整合 植入輸卵管 外源基因：順式作用元件 結(jié)構(gòu)基因 報(bào)告基因(report gene) 融合基因第九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月顯微注射法胚胎干細(xì)胞法 (embryonic stem cells，ES細(xì)胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法細(xì)胞核移植三 、基本方法第十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 以單細(xì)胞受精卵為靶細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA直接注射入受精卵的原核，再將接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體。 目前應(yīng)用較廣泛，最早最經(jīng)典的方法。（一）雄原核顯微注射法第十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年

5、6月1. 程序準(zhǔn)備假孕母鼠受精卵的準(zhǔn)備基因?qū)肱咛ヒ浦矊τ资蟮蔫b定第十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月PMSG第十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月外源DNA大小基本不受限制（150kb）；導(dǎo)入過程直觀；整合率高2. 優(yōu) 點(diǎn)：第二十一張，PP

6、T共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多對操作人員有較高的技術(shù)要求低效率（尤其是大家畜）對卵子傷害大，胚胎存活率低基因整合隨機(jī)性轉(zhuǎn)基因沉默3. 缺 點(diǎn)：第二十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月基因特異表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)基因的新功能發(fā)現(xiàn)新基因建立基因表達(dá)、調(diào)控的動(dòng)物模型建立人類疾病的動(dòng)物模型等4. 應(yīng) 用第二十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）胚胎干細(xì)胞（ES）法 ES細(xì)胞是早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過體外培養(yǎng)建立起來的多潛能細(xì)胞系。 將攜帶有外源基因的ES細(xì)胞注入到動(dòng)

7、物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。第二十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 在ES細(xì)胞上的基因操作：可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔、磷酸鈣共沉淀等方法將外源基因?qū)隕S細(xì)胞。 因此，借用ES細(xì)胞系可將人們企望的某種不完整的、無功能基因直接引入到ES細(xì)胞中，通過細(xì)胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動(dòng)物后代。第二十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性外源目的基因打靶載體Neo（

8、新霉素）陽性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)1. 必備條件第二十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種2. 基本程序第三十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月Injection of ES cells into blas

9、tocysts第三十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月外源基因整合情況的可控性高?？深A(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便。3. 優(yōu) 點(diǎn)第三十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體 目前，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動(dòng)物上應(yīng)用較晚。4. 缺 點(diǎn)第三十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳病研究腫瘤的研究生物制藥5. 在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第三十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）反轉(zhuǎn)錄病毒法（

10、四）精子載體法第三十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞核移植法第三十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是在單細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。而許多基因的表達(dá)是無法通過轉(zhuǎn)染的方法來研究；基因表達(dá)有時(shí)空與組織的特異性；外源基因的表達(dá)受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；因此，只有通過轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物才有可能研究基因的表達(dá)、調(diào)控及基因之間的相互作用。四 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的意義第四十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月進(jìn)行功能基因組學(xué)的研究，研究外源基因在動(dòng)物整體水平的表現(xiàn)調(diào)控規(guī)律。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型可用來進(jìn)行疾病發(fā)病學(xué)和治

11、療性研究。也可改變動(dòng)物基因使其表現(xiàn)型更適合人類需要。還可以用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)一些人類所需的生物活性物質(zhì)。第四十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) ENU誘變小鼠 ENU致突變技術(shù)是高通量大規(guī)模篩選新基因及發(fā)育突變技術(shù)的化學(xué)方法：當(dāng)人們還不能獲得ES細(xì)胞時(shí)，小鼠遺傳學(xué)家最常用的方法是用乙烷基亞硝基脲（ENU)處理公鼠，然后在后代中篩選顯性或隱性突變的小鼠。隨著越來越多的基因和微衛(wèi)星標(biāo)記被定位，突變基因的定位也隨之變得容易；因此對小鼠進(jìn)行化學(xué)誘變將越來越變得低成本而高效益。 第四十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、ENU誘變的技術(shù)路線 1. ENU誘變的簡單流程 ENU

12、處理雄性C57BL/6小鼠，10周后與同品系母鼠配種，F(xiàn)l離乳時(shí)篩查，陽性突變小鼠留種，與同品系正常母鼠配種，F(xiàn)l有親代突變表型者留種(為顯性遺傳)，基因定位、培育新的模型、基因克隆、基因功能研究。隱性突變篩選需由Fl互交或F2回交Fl，發(fā)現(xiàn)突變表型者留種，進(jìn)行進(jìn)一步的研究。第四十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 2顯性突變的篩選 10周齡的雄性小鼠按150mg/kg體重的劑量腹腔注射ENU，60天后待處理公鼠恢復(fù)生殖能力后與野生型雌性配種，通過對F1代小鼠進(jìn)行形態(tài)學(xué)、行為學(xué)、血液學(xué)、生理生化等指標(biāo)的檢測，可篩選基因的顯性突變。 3隱性突變的篩選 基因隱性突變的篩選需將F1代的雄性

13、鼠與野生型雌性小鼠交配，再將F1代雌性小鼠與F1代雄性鼠回交或F2代雌、雄鼠交配，獲得F3代小鼠，并將F3代小鼠用于大規(guī)模篩選。第四十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 4基因驅(qū)動(dòng)法與表型驅(qū)動(dòng)法相結(jié)合的ENU誘變篩選 單基因剔除是典型的基因驅(qū)動(dòng)的研究。研究者必須針對靶位點(diǎn)在染色體組文庫中篩選相關(guān)的染色體組克隆，繪制相應(yīng)的物理圖譜，構(gòu)建特異性的打靶載體以及篩選中靶ES細(xì)胞等。通常一個(gè)基因剔除純合子小鼠的獲得需要1年或更長的時(shí)間。面對人類基因組計(jì)劃產(chǎn)生出來的巨大的功能未知的遺傳信息，傳統(tǒng)的基因剔除方法顯得力不從心，不符合現(xiàn)代生物學(xué)高通量、大規(guī)模篩選的要求。第四十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)

14、作于2022年6月 用放射線導(dǎo)致缺失和突變以及用各種化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)點(diǎn)突變等許多經(jīng)典的遺傳學(xué)研究屬于表型驅(qū)動(dòng)的研究。 早在20世紀(jì)90年代初，研究者就提出帶有第7號(hào)染色體缺失的小鼠可用來篩選ENU誘導(dǎo)的缺失區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)突變。基因打靶的研究進(jìn)展使得研制攜帶染色體組任意片段的缺失、倒位或者易位突變小鼠成為可能。Ramirez Solis應(yīng)用位點(diǎn)特異的重組酶系統(tǒng)首次在小鼠ES細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了最長34cM染色體組片段的缺失、倒位和重復(fù)。并采用同源重組技術(shù)構(gòu)建了大片段染色體缺失的基因剔除小鼠。第四十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 將基因打靶這種基因驅(qū)動(dòng)的研究和ENU誘變這種表型驅(qū)動(dòng)的研究結(jié)合起來具

15、有明顯的優(yōu)勢。ENU誘變可以在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的突變體小鼠，但點(diǎn)突變的鑒定依然是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作。采用通過基因打靶獲得的特定染色體組缺失或者易位的ES細(xì)胞建立突變小鼠可以簡化篩選的程序和工作量，并把點(diǎn)突變限定在序列已知的區(qū)域內(nèi)，這樣可以大大簡化點(diǎn)突變鑒定的過程。第四十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 5ENU突變表型篩選 ENU誘導(dǎo)突變表型的篩選包括形態(tài)異常表型、行為和神經(jīng)功能異常、血液學(xué)和臨床生化指標(biāo)和老年癥狀篩選等。形態(tài)異常表型的篩選通常在小鼠分窩時(shí)進(jìn)行。行為和神經(jīng)功能異常篩選包括肌肉缺陷和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元低下、感官缺陷、精神、小腦平衡、自律行為方面的缺陷等。第四十八張，PPT共五十四

16、頁，創(chuàng)作于2022年6月 有表型的小鼠將通過更復(fù)雜的測試，如探險(xiǎn)運(yùn)動(dòng)、食物攝取、學(xué)習(xí)和記憶；焦慮、神經(jīng)心理學(xué)測試等等。血液學(xué)測試在小鼠610周時(shí)進(jìn)行。隨機(jī)挑選無表型的小鼠飼養(yǎng)1年以上再進(jìn)行老年癥狀表型篩選。主要觀察是否具有老年相關(guān)疾病的表型，包括體重增加、動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、心血管異常、感知功能和行為異常等等。第四十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 ENU誘變的最終目的是為了鑒定導(dǎo)致表型的突變基因，發(fā)現(xiàn)新的基因和新的代謝途徑，促進(jìn)人類對哺乳類動(dòng)物基因功能的了解。位置候選基因法是鑒定突變基因的首選方法：用50只突變回交小鼠做連鎖分析。突變大致可定位在1020cM的范圍內(nèi)。分析500只

17、回交小鼠可將突變定位在1cM的范圍內(nèi)?；蝌?qū)動(dòng)法與表型驅(qū)動(dòng)法相結(jié)合的ENU誘變篩選的小鼠，其突變已被定位在特定的染色體組區(qū)域內(nèi)，因而不用再作連鎖分析。二、ENU誘導(dǎo)點(diǎn)突變的鑒定第五十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 在突變基因被精確地定位后，結(jié)合突變小鼠的表型進(jìn)行候選基因的預(yù)測。候選基因的線索可從多方面的分析獲得。比如小鼠表型是否與某種已知突變基因的人類疾病相似；小鼠的表型與候選范圍內(nèi)某些基因的表達(dá)模式具有相關(guān)性；候選范圍內(nèi)某些基因的功能與小鼠表型可能相關(guān)等。小鼠基因組已定位近7000多個(gè)微衛(wèi)星，使得染色體上大約每0.35cM便有一個(gè)標(biāo)記。可以根據(jù)已知微衛(wèi)星的位置定位突變基因，相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，穩(wěn)定的高通量基因型鑒定方法將會(huì)極大地發(fā)展。第五十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 我們目前所認(rèn)知的基因絕大多數(shù)來源于對突變基因的研究，突變意味著某一些基因?qū)ι矬w的原有功能發(fā)生了變化，通過研究這種變化的遺傳機(jī)制，可以獲得有關(guān)基因功能的極有價(jià)值的資料。只有通過分析不正常才能知道基因的正常功能是什么，才能通過對突變的分析建立起因果關(guān)系。大量突變動(dòng)物模型的獲得為基因