DB12-T200-2004鮮番茄及番茄制品中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測方法

1、DB12/T 2002004DB12/T 2002004ICS 65.020.01B04備案號：市 地 方DB12/T 2002004鮮*茄及番茄制品中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測方法：0col of the qualitative detection for traiisgenic componentin fresh tomato and tomato processed products：0 DMIF-GEN-T1B2 DMIF-GEN-T1B?、DMIFGENT 1B4和本標準在呻息用于檢測尊番茄和番茄制品內(nèi)源基因和外源基因的引物序列時,釆用了歐盟推薦的檢 測方法，耳DMIF-GEN-T本標準由

2、或SMT4-CT96-2072 ,本標準起耳單艮天津帶農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心、中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局。 本標準主缽起葦人：金紅、趙昕、王永、程奕、鄭貴忠。DB12/T 2002004DB12/T 2002004 DB12/T 2002004 部轉(zhuǎn)入50 mL離心管中。用0.1 mol/LTris-HCl (6.3.14)溶液反復洗滌樣 入 30 mL 0.1 mol/L Tris-HCl 溶液(6.3.14),反復搖勻，于 4C 10 000 r/min 離心 留沉淀用宇DNA提取。研缽中，置于冰品三次，方應為力15 min,棄上灣，取鮮番茄樣風2g,置煎冷研缽中，加入液氮(6

3、.3.30)衲磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，用 于DNA提取。6.4.1.2 CTA.研細，全B傳提取 取經(jīng)預處理浦樣品加入時，期間每隔 加入等體積的豐色 加入等體積的三氯| 搖勻，室溫靜亶1離心10 min,取上i 留的乙醇，待* 淀，加入100卩LT6. 4.2樣品中dImL溶解沉淀,4 C靜置過夜,6. 4. 2. 1紫外分丿釆用紫外分光 的最佳范圍是2 Mg 外分光光度計的比 鏈 DNA。PCR 皴釆用內(nèi)源曇10 mL經(jīng)65C預熱的CTAB提取緩沖掖(6. 3. 10),混勻。65C水浴1小彳到混勻一次，取出靜置冷卻至室溫，12 000 r/min離心12 min,取上清,0 mi

4、n輕輕顛甲烷+異戊醇(6. 3. 8)緩慢顛倒搖勻5 min,于10 000 r/min離心10 min,取上清， 甲烷+異彼醇(6. 3. 8)重復抽提一次，取上清，加入2倍體積的CTAB沉淀液(6. 3.11), 牛時，12 600 r/min離心10 min,棄上清，沉淀加入1.2 mol/LNaCl溶液(6. 3. 12) 冒靜置5 min,加入等體積三氯甲烷+異戊醇(6. 3.8)顛倒搖勻1 min,于12 000 r/min 加入的3 mol/L乙酸鈉(6. 3. 13)和等體積的冷異丙醇(6. 3. 7),緩慢混勻,ICO r/min *心15 min,棄上清，加入400成J。冷

5、乙醇(6.3.9)洗滌沉淀，除去殘 午燥后，“入30虬滅菌的去離子水(6.3. 20)瀋解從番茄加工制品提取的DNA沉 E (6. 3.15)溶解從鮮番茄提取的DNA沉淀,均置-20C保存?zhèn)溆??！爱a(chǎn)量和此的鑒定,光度法*度法對M鮮番茄中提取的DNA進行產(chǎn)量和質(zhì)貴的鑒定。紫外分光光度法檢測核酸 Ll50 MgjmL, OD值應該在0.051的區(qū)間內(nèi)。將DNA溶液做適當?shù)南♂?，放入?g皿中，亍260|nA 溶液OD260nmtD280nm 比值為 1.72.0。因增法鑒言從番茄加士制品中提取的DNA的質(zhì)量。通過PCR技術，擴增番茄內(nèi)源nm處測定其吸收峰，lOD260nm=50 Pg/mL雙鏈DN

6、A或38 Pg/mL單基因。6. 4.3 基因。6. 4.3 定性 fC6.4. 3.1 PCR檢測鮮番茄秤2o反應體系中各盤6. 4. 3. 2反應體 進行PCR&i 基因番茄材料申由 的DNA為模板；金測7體系為原料的番茄加工制品中內(nèi)源基因和外源基因釆用的PCR檢測體系見表為原料的番茄加工制品中內(nèi)源基因和外源基因釆用的PCR檢測體系見表劑的量根歩反應體系:的總體積進行適當調(diào)整。每個反應體系應該設置兩個平行管。 2 PCR也測參考反應體系(25凹L體系)試劑名加入PCR反應體系的量lOxPCR 即緩F液2.5 卩L氯化鎂(25 I1/L)2.0虬dNTP溶液(I 2.5 mmol/I,)2.

7、0吒正向引物(1)prjlOl/L)2.5吒反向引物(1)P1。皿)2.5 卩LTaq 酶(2U/丄L)2.0模板(樣曲學ID!A)810虬水補足反應體系，使單、體積為25卩L注：表中陽伯對J仲和陰性對卩，的DNA模權用量取IPL。時照的設i必須設置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照：用Nema282F轉(zhuǎn)必須設置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照：用Nema282F轉(zhuǎn)的DNA件為PCR反應體系的DNA模板；陰性對照：用非轉(zhuǎn)基因番茄材料中提取 一日對照：神置反應林系的實驗用水代替模&。6. 4. 3. 3樣品申內(nèi)箱基因和亦源基因的檢測DB12/T 2002004 檢測鮮番W和*番茄果為原

8、料的番茄加工制品中的內(nèi)源基因和外源基因的PCR檢測的參考反應 條件見表3。反國遂件需根航檢測儀器拓能做相應調(diào)整。被擴增軒星PG34-CaMV35NOSPG變性94*jc, 3 min94 , 3 min1A擴增 94C, 30s 60C, 30s 72C, 45s 94C, 30s 54C, 40s 72C, 60s 94C, 30s 60C, 60s 72C, 45s；循杯次數(shù)i備3540351*-最后延伸72C, 5 min72C, 3 min72C, 6 min95 &,5 minPG34L-NCs95 C,5 min94C, 30s60C, 60s72C, 60s3572C, 6min

9、NptII(215tf卬)j94C,3 min94C, 30s62C, 30s72C, 60s4072C, 5 minNptll (173 t屮）r94 ,C5 min94C, 60s58C, 60s72C, 60s4072 C, 7 min表3樣品中內(nèi)源驀因和外源基因的PCR參考反應條件6. 4. 3. 4凝膠電津耳測PCR產(chǎn)物用IxTAE 液制備*的瓊脂糖凝膠（凝膠融化后晾宇6OC左右時加入漠化乙錠，含量為 0. 5g/mL）o按btw|10 vlL的產(chǎn)物%上樣緩沖液均勻混合，笑后如入對應的凝膠孔中，同時加入 合適的DNA分予軻記物，選*合適的電壓（3 V/cm5 V/cm）進彳亍電|泳，

10、電泳時間為40 min60 min。 6. 4. 3. 5 破擊電泳結束后，M 增出的目的條帶的村 6. 4.4結果分析妝 6. 4. 4.1內(nèi)源基弓的對于番茄特異郵出現(xiàn)383bp的條希，貝，則不能用于檢測糙因，應該言新提取福測樣品DNA,直到能擴383bp的條帶，防止檢測中產(chǎn) 生假陰性。6. 4. 4. 2外源基因?qū)Υ郎y樣品取液進彳亍外源基因的PCR檢測，如果陰性和鹽和空白對照未出現(xiàn)條帶，陽性 、 I 師期大小國擴增條帶j,則可判斷待測樣品中含有源基因。茄制*中轉(zhuǎn)基鳳成分的檢神，可參考表1的內(nèi)容，先誡選檢測CaMV35S、NOS、NptII 基因，篩選檢測颯陰*則直接只告結果。： -，則需3一步鑒定檢測外源目的基因片段PG344-NOS,以確定是否為轉(zhuǎn)基因番許（照相?脂糖凝膠*于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據(jù)DNA分子量標記判斷擴 ，將電泳結果形成俄子文件存檔或用照相系統(tǒng)拈照。度測源基因P34片段啟檢測，如果陰性對照、待測樣品和陽性對照的PCR產(chǎn)物都 |表明提取待測樣4DNA符合PCR反應的要求，能用于外源基因的檢測；否:測對照和待測樣品均出對鮮番茄和番若篩選檢測綃果 茄 Nema282F 品系 |。若陰性對照，兩京基因得至擴增外，菸有