20160831 畢赤酵母蛋白不表達(dá)的原因

1、畢赤酵母蛋白不表達(dá)的原因很多朋友問這樣一個(gè)問題：為什么畢赤酵母不表達(dá)?他們自己也很納悶，重組酵母PCR檢測(cè)也證明目的基因重組了，但是誘導(dǎo)之后就 是在表達(dá)上清中檢測(cè)不到目的蛋白，仔細(xì)研究操作手冊(cè)后仍然不知道原因。本人，根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)，采用倒推的方法，按實(shí)驗(yàn)過程從后向前分析，供大家參考：1、誘導(dǎo)之后表達(dá)上清中檢測(cè)不到目的蛋白：檢測(cè)的方法是否有問題，要考慮是不是蛋白表達(dá)量低而沒有檢測(cè)到？如果是蛋白表達(dá)低，可以選擇濃縮蛋白，具體的方法很多，有TCA、丙酮、濃縮柱 等等方法，之前在本版已經(jīng)發(fā)過帖，在此不贅述。：如果蛋白濃縮N倍之后仍然檢測(cè)不到，那基本可以確證蛋白并不在上清中。那 么蛋白到哪里去了，考慮是

2、否沒有分泌出來，而是在胞內(nèi)，那就需要通過裂解酵母來檢 測(cè)胞內(nèi)蛋白，具體的方法很多，在此也不贅述，曾整理過相關(guān)破碎的帖子。：如果胞內(nèi)也沒有目的蛋白表達(dá)，那么基本可以確定蛋白并沒有表達(dá)。2、為什么沒有表達(dá)呢?倒推回來就是誘導(dǎo)的過程了，誘導(dǎo)體系是什么?甲醇 濃度是多少?培養(yǎng)問題是多少，轉(zhuǎn)速是多少?這些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的是0.5%，也有很多人也用1.0%， 曾見過一個(gè)帖子，說超過 1.5%反而會(huì)抑制表達(dá)，沒有驗(yàn)證過，供大家參考。培養(yǎng)問題 28-30 度比較合適，轉(zhuǎn)速 250rpm 比較合適，誘導(dǎo)體系沒有固定的體系，說明書上推薦的是BMGY到OD600 26,換到BMMY

3、中 OD600 為 1 左右。3、如果誘導(dǎo)的過程也沒有問題，那問題就復(fù)雜了，特別是重組酵母 PCR 檢測(cè)證明目的基因確實(shí)已經(jīng)發(fā)生了重組。這個(gè)時(shí)候是最郁悶的了，但是郁悶怎么辦，還是要找原因，在此我給的建議是先做 RT-PCR 證明 mRNA 水平的情況，也就是說有沒有轉(zhuǎn)錄。如果轉(zhuǎn)錄了，后續(xù)的操作也 沒有問題（本帖的 1、 2 項(xiàng)），那么只有重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，比如換酵母株，有文章上說：用 GS115表達(dá)不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達(dá)。4、關(guān)于畢赤酵母不表達(dá)的。有個(gè)帖子說的很好，在此和大家分享一下。1、菌株：用GS115表達(dá)不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達(dá)。2、溫度： 在 28 度

4、和室溫下誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)水平可能都不低。3、pH：手冊(cè)上用6.0, pH提高到6.8,不表達(dá)的蛋白可能就表達(dá)出來。BMMY的 PH7.0-7.5比較合適。國內(nèi)外做的最好的rHSA，最適pH大概5-6左右。pH3的時(shí)候 yeast 和 peptone 好像會(huì)沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調(diào)，具體比例自己去試試。4、偏愛密碼子：codon bias 般不是主要的問題，你要表達(dá)的蛋白特性才是主要 問題，酵母對(duì)分子量大（30KD以上），結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如一些蛋白酶），二硫鍵含量多的蛋白往 往不能有效表達(dá)，尤其是分泌表達(dá)。密碼子改造對(duì)一些較小的而且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的蛋白表達(dá) 量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用Pic

5、hia酵母表達(dá)一個(gè)單鏈抗體，29KD，含 有2對(duì)二硫鍵，表達(dá)量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達(dá)量沒有 什么提高。5、表達(dá)時(shí)間與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照：誘導(dǎo)時(shí)間長了以后，是會(huì)有很多蛋白分泌出來的， 時(shí)間越長雜蛋白就越多，且分子量都比較大。最好做一個(gè)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對(duì)照，這樣就會(huì) 比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結(jié)果。6、污染：每個(gè)樣品從G418板上挑10個(gè)左右單克隆于2ml BMGY搖菌（30ml玻璃 管，比LB管大一點(diǎn)），紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml，余1ml 換2ml BMMY誘導(dǎo)表達(dá)，3,4層紗布足夠了。污染一般都是跟瓶口覆蓋有關(guān)的原因造成的，只蓋紗布肯定會(huì)污

6、染。加蓋報(bào)紙后， 就再?zèng)]遇到過污染。如果只用6層紗布，污染的可能當(dāng)然很大，100ml三角瓶，裝量 10ml培養(yǎng)液，用橡筋把8層紗布和2層報(bào)紙拴緊封口，空氣浴搖床。7、不表達(dá)：蛋白有沒有表達(dá)就要看你的運(yùn)氣了，一般重復(fù)2-3次實(shí)驗(yàn)都沒有表達(dá) 菌株，這個(gè)蛋白就放棄表達(dá)了。8、表達(dá)量：30KD,10mg/L表達(dá)量已經(jīng)很高，最直接的方法是發(fā)酵，一般提高5-10 倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團(tuán)的超表達(dá)蛋白。9、糖基化：酵母分泌表達(dá)的N糖基化是可以預(yù)測(cè)的，有如下序列：N X S/T就是 潛在的糖基化位點(diǎn)，X為任意氨基酸，1個(gè)糖基化位點(diǎn)會(huì)加上1-3KD左右的糖基。另外 可能還有O糖基化話，但是無法預(yù)測(cè)其位點(diǎn)，不過很

7、少聽說表達(dá)蛋白有O糖基化的。 如果胞內(nèi)表達(dá)，不存在糖基化的問題。10、表型與表達(dá)：重組Sall和Bglll酶切產(chǎn)生單交換和雙交換，結(jié)果就是產(chǎn)生Mut+ 和 Muts 表型的菌株;前者在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)生長快，消耗的甲醇多，后者生長慢，消耗 的甲醇少，所以誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多， 但是對(duì)某些蛋白Muts菌株可能表達(dá)的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達(dá) 較好。11、培養(yǎng)基YPD：最基本的培養(yǎng)用;BMGY：誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用;BMMY：誘導(dǎo)表達(dá)用;MD：電 轉(zhuǎn)化后篩選his+用。YEPD 是不能代替 BMGY 的，因?yàn)橛衅咸烟牵@樣殘留的葡萄糖會(huì)影響下

8、一步的 誘導(dǎo)表達(dá)。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡 萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會(huì)抑制 甲醇利用。BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制BMMY時(shí)也沒必要用 5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加 100%甲醇至你要的濃度。YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待 培養(yǎng)基高壓滅菌后加入配YPD時(shí)可以加入YPD 一起滅菌，但時(shí)間不能太長，溫度不 能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時(shí)間過長，溫度過高，可能導(dǎo)致YPD 焦化。 glucose 和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。 顏色很深的話，基本不能使用了?；蛘吆衅咸烟呛?或 YNB 的培養(yǎng)基 108度 35min 高壓滅菌。小量發(fā)酵其實(shí)可以把培養(yǎng)基成分