抗體標記技術(shù)匯總

1、第1章抗體分子標記技術(shù)第一節(jié) 抗體的I12標記法基本原理有多種方法可用于蛋白質(zhì)的碘標記，如應用化學法或酶促法通過氧化對蛋白質(zhì)分子進行碘化是常用的方 法。當應用化學氧化法時，碘化鈉（NaI）遇強氧化劑，碘離子被氧化為碘分子，所生成的自由碘分子可與某 些基團進行鹵化反應。蛋白質(zhì)分子可進行鹵化反應的基團主要為酪氨酸殘基，某些組氨酸殘基也可能進行碘 化。在應用氯胺T（Chloramine T）法的實驗中，所用的氧化劑（1，3，4， 6-tetrachloro-3a , 6a -diphenyl-glucoluril）是溶于強揮發(fā)性的有機溶劑中。該溶劑加入試管后，先讓其揮發(fā)（即讓氧化劑將試 管包被），然

2、后把阻I和蛋白質(zhì)液加入包被好的試管中，反應完成即將混合液移入他管，以終止反應。試劑及儀器經(jīng)親和層析純化的多克隆抗體或單克隆抗體0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.5 （配法見附錄1）無載體的 Na125I 3.7GBq/ml （ 100 mCi/ml ）的 NaOH 液凝膠過濾柱Y -記數(shù)器100g/L三氯醋酸70%乙醇玻璃纖維濾氯胺T （Chloramine T）反應用*新鮮制備的含2mg/ml氯絡胺T的0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）；*氯胺T反應終止緩沖液：2.4mg/ml偏重亞硫酸，10mg/ml酪氨酸，10%甘油，1g/L Xyene cyanol的PBS 液。操

3、作步驟*注意：125I對健康有害，需要保護措施。在應用125I應先有關(guān)同位素知識，及在有關(guān)部門的監(jiān)測下，按放射 線同位素的應用及處置要求進行。（一）氯胺T法用1.5ml Ependof管，加10p l抗體及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液總體積至25p l；加 500 p Ci 的 Na125I，混勻；加25p l 2mg/ml氯胺T液，混勻；在室溫下培養(yǎng)1分鐘； 加入50p l氯胺T反應終止緩沖液（以飽和的酪氨酸來捕獲游離的Na125I）；通過凝膠過濾層析分離將碘化抗體與碘化酪氨酸分離。將反應混合液上1ml的凝膠過濾層析柱，分 部收集洗脫液100p l/管，碘化抗體在開始的組分排

4、出。應用Y -記數(shù)器監(jiān)測各組分；收集、合并含碘化抗體的各管；將125I標記的抗體管放入同位素保護管中，置4C保存。（二）lodogen-包被試管法lodogen 以 0.5p g/ml 溶于氯仿；將100p l lodogen液移入合用的玻璃試管中；試管置通風櫥中過夜，在室溫下讓氯仿蒸發(fā)；加入50p l抗體（0.2-1mg/ml在pH 7.5的0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液中）；加500 p Ci Na125I到加有抗體的Iodogen-包被管中，室溫保溫2分鐘；將管中反應液轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendof管（其中已先加有50p l Iodogen反應終止緩沖液），輕混；通過凝膠過濾層析，將碘

5、化抗體與碘化酪氨酸分離（同前絡胺T法）；收集、混合含碘化抗體的各管；將125I標記的抗體置同位素保護管中，放4C保存。實驗質(zhì)量監(jiān)測應用三氯醋酸沉淀法測定抗體標記效率：取兩片玻璃纖維濾紙，用軟鉛筆寫標記；將濾紙平放在試管架的孔部，使其中心部分不接觸試管架；將1-5p l含約10000cpm的樣品，準確的點到每一張濾紙的中心，在室溫下待干；用平頭鑷子將一濾紙轉(zhuǎn)入試管，加入2ml 100g/L三氯醋酸；濾紙在三氯醋酸液中浸轉(zhuǎn)10分鐘，傾出溶液；再加入2ml 100g/L三氯醋酸，重復上述操作；加入2ml 70%乙醇，濾紙浸在乙醇中轉(zhuǎn)動10分鐘后，傾出溶液；測定經(jīng)過洗過滌與未洗滌濾紙的放射性；由所測定

6、濾紙點樣中與抗體結(jié)合的125I量，計算與抗體液中與抗體結(jié)合的125I總量。洗后濾紙的cpm未洗濾紙的cpm X 100 =結(jié)合碘的比率樣品的總量/收集的分量X在洗后濾紙中的cpm =總抗體-結(jié)合放射性*與抗體結(jié)合的同位素量應為樣品中同位素總量的70-95%。實驗要點及說明用氯胺T法進行碘化，也可在大約pH 7.0的緩沖液中進行。均必需保證反應體系中無還原劑存在。 如果氧化反應損傷蛋白質(zhì)，可將氯抗體與異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯(lián)）胺T量減少到0.02mg/ml,并 將偏重亞硫酸液的濃度降到0.024mg/ml。Iodogen-包被的試管可在干燥器中，室溫下，保存多年。125I標記的抗體，在制備

7、后六周內(nèi)均可使用（1251的半衰期為59.6天）。要注意保證所用的Na125I是新鮮的，陳舊制劑的比活性低。酪氨酸的碘化偶爾會對抗原的抗體結(jié)合位點有干擾，因此降低其結(jié)合能力，但這種情況很少見。*以上同位素標記方法中需用高度純化的抗體，以保證結(jié)果的可靠。參考文獻Fraker, PL .and Speck, JC (1978) Proteinand cell membrane iodination with sparkingly soluble chloramines, 1, 3, 4,6-tetrachloro-3a ,6a -diphenyl-glucoluril. Biochem. Biop

8、hys. Res. Commun. 80,849-857.Greenwood, FC., Hunter, WM. And Glover, JS. (1963) The preparation of 125-labeled human growth hormone of high specific radioactivity. J. Biochem. 89, 114-123. 孫冊，朱正美及顧天爵 放射性標記凝集素糖復合物生化研究技術(shù)浙江大學出版社1999 pp.501-504(朱正美)抗體的酶標記法基本原理本法是應用偶聯(lián)劑使酶與抗體結(jié)合。即通過應用單、雙或多功能基試劑，分別與大分子的抗體所存在

9、的 功能性基團發(fā)生反應，生成酶一抗體偶聯(lián)復合物。不同的醇抗體復合物制備方法中，最廣泛應用的是第一步 加入戊二醛的方法，本法與其它偶聯(lián)方法相比，具有操作簡單、反應條件溫和，及實用面廣等長處。試劑及儀器親和純化的多克隆抗體或生物化學純的單克隆抗體（5mg/ml PBS液或0.1 mol/L磷酸緩沖液pH6.8）用以標記的酶（EIA級，有商品供應）：辣根過氧化物酶（HRP,純度為A430/A275 3），黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛腸堿性磷酸酶（AKP）， 或大腸干菌8 D 一半乳糖苷酶均可選用，但以HRP最為常用。25%戊二醛液（電鏡級）0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）PBS （見附錄）2

10、 mol/L甘氨酸液蒸溜甘油透析袋（分子量6000-8000）電磁攪拌器和攪拌棒操作步驟抗體與過氧化物酶偶聯(lián)將5mg抗體與10mg酶在總體積1ml的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）混合； 在4C對0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）透析過夜；用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）稀釋戊二醛至1%； 向透析混合液中加入50p l稀釋過的戊二醛，在室溫下輕1輕攪拌三小時；加入2 mol/L甘氨酸液使最終濃度達到0.1 mol/L，混合液室溫放置2小時，以封閉殘存的醛基混合液在4C對PBS透析過夜；10000 X g 4。離心 30 分；將上清移入另一管中，按體積1： 1

11、加入甘油，使終濃度達50%；置-20 C保存?？贵w與AKP偶聯(lián)將5mg抗體與10mg酶在總體積2ml的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.8）混合；其它操作同HRP標記法。抗體與葡萄糖氧化酶偶聯(lián)按HRP偶聯(lián)法操作，僅加入的1%戊二醛改為150 p l?？贵w與0D一半乳糖昔酶偶聯(lián)按HRP偶聯(lián)法操作，但見偶聯(lián)反應總體積改為2ml，l%戊二醛用量改為的100p l。反應質(zhì)量測定可用抗原包被的微量板通過直接酶免疫試驗測定偶聯(lián)度。(具體方法見-)實驗要點及說明如果參與偶聯(lián)的氨基位于抗體和抗原的結(jié)合位點，則在偶聯(lián)反應中，被標記抗體的親和性能會不同 程度的受到破壞；主要影響偶聯(lián)成功率的原因是在反應混合液

12、中有游離氨基存在，游離氨基容易和戊二醛反應，因而 干擾蛋白質(zhì)的交連。因此，必須用絕對不含有機物的水配置緩沖液，并且反應混合液要在偶聯(lián)前對 該緩沖液充分透析，是反應成功的要點。反應不能應用Tris-甘氨酸緩沖液。參考文獻Avrameas,S. (1969) Coupling of enzymes to protein with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibody. Immunochemistry 5, 43-52Avrameas,S. and Ternyck, T. (1

13、971) Peroxidase labelled antibody and Fab congugates with enhanced intracellular penetration. Immunochemistry. 8(12): 1175-1179(朱正美)第三節(jié)抗體的生物素化標記基本原理本法可使抗體或其它蛋白質(zhì)的 -氨基通過手臂與酰化的生物素共價結(jié)合。其后，生物素化的分子可應用 酶標-親和素或熒光染料-鏈霉親和素復合物來檢測。小分子的水溶性生物素對細菌蛋白鏈霉親和素具有高度 親和力是本法的設計基礎。試劑及儀器NHSB： N-羥基琥珀酰亞胺生物素（有商品供應）0.1 mol/L碳酸氫鈉緩

14、沖液，pH 8.0 （見附錄）雙蒸水（注意去除游離氨基），用以配制碳酸氫鈉緩沖液或硼酸緩沖液DMSO （二甲亞颯，有毒試劑）1 mol/L NHCl4疊氮鈉（有毒試劑）PBS （見附錄）10g/L牛血清白蛋白（W/W） PBS液分子篩柱（如G25）電磁攪拌器透析袋（MW CO 8000）鋁鉑微量移液器操作步驟將待生物素化的蛋白質(zhì)用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.6）稀 釋到1mg/ml, 一般實驗室應用的生物素化體積為1-2.5ml;交互用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.6），對

15、蛋白質(zhì)充分透析;用 1ml DMSO 溶解 NHSB 1mg；向1ml蛋白質(zhì)溶液（即含蛋白質(zhì)1mg）加入120p l NHSB溶液（即含NHSB 120 p g）；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4小時；加入9.6p L1 mol/L NH4Cl （每25 p g NHSB加1 p l），在室溫下攪拌10分鐘；在4C，對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上1ml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集1ml/管，蛋白質(zhì)在1-3ml之間洗下；最后，樣品加入疊氮鈉（終濃度0.5g/L）及1.0g/L BSA。將結(jié)合產(chǎn)物置4C，避光保存，亦可加入50% 重蒸甘油，置一20 C保存。質(zhì)量監(jiān)測與酶-或熒光染

16、料-結(jié)合的親和素、鏈霉親和素或中和親和素（neutravidin），通過標準方法（Western blotting或免疫熒光染色法）測定交聯(lián)率。實驗要點及說明如在反應混合液中有疊氮鈉或游離氨基存在，會抑制標記反應。因此，蛋白質(zhì)在反應前要對0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖液或0.5 mol/L硼酸緩沖液充分透析；所用的NHSB及待生物素化蛋白質(zhì)之間的分子比按蛋白質(zhì)表面的 -氨基的密度會有所不同，選擇不 當則影響標記的效率，應先用幾個不同的分子比來篩選最適條件；用NHSB量過量也是不利的，抗原的結(jié)合位點可能因此被封閉，導致抗體失活；由于抗體的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此時可加入去污劑如Tr

17、iton X-100,Tween 20等。當游離 -氨基（賴氨酸殘基的氨基）存在于抗體的抗原結(jié)合位點時，或位于酶的催化位點時，生物 素化會降低或損傷抗體蛋白的結(jié)合力或活性。此時，應試用其它交聯(lián)方法；生物素還可能與不同的功能基團，如羰基、氨基、巰基、異咪唑基及苯酚基，也可與糖基共價結(jié)合 （詳見參考文獻1）；交聯(lián)反應后，應充分透析，否則，殘余的生物素會對生物素化抗體與親和素的結(jié)合產(chǎn)生競爭作用；在細胞的熒光標記實驗中，中和親和素的本底低，但由于鏈霉親和素含有少量正電荷，故對某些細 胞可導致高本底。參考文獻Bayer,EA. And Wilchek, M. （1980） The use of avid

18、in-biotin complex as a tool in molecular biology. Meth. Biochem. Anal. 26, 1-45.Guesdon, JL., Ternynck, T. And Avrameas, S. （1979） Thr use of avidin-biotin interaction of immuenzymatic techniques. J. Histochem. Cytochem. 27, 1131-1139.（朱正美）第四節(jié)抗體的熒光標記法基本原理許多蛋白質(zhì)分子在其表面含有較多的賴氨酸殘基。這些賴氨酸殘基的游離：-氨基可與FITC （其

19、激發(fā)波 長為492nm,發(fā)射光波長為525nm）共價結(jié)合。與FITC結(jié)合的抗體可用為特異性的探針，以測定細胞相應抗 原的存在。FITC具有很高的量子產(chǎn)量（發(fā)射光與吸收光的比值,0 .85），而且形成的偶聯(lián)物的穩(wěn)定性很好。 FITC是應用最廣的熒光染料，流式細胞儀就按FITC的特性，設計了激光波長為488 nm，很接近于FITC的最 大激發(fā)波長492nm）。偶聯(lián)反應是在pH 9.8條件下，賴氨酸殘基的游離 -氨基與FITC發(fā)生的親核反應，由此形成硫脲連接。試劑及儀器待偶聯(lián)抗體碳酸氫鈉緩沖液：25m mol/L怛叫/ NaHC03緩沖液PH9.8 （新鮮配制，配法見附錄）PBS （見附錄）疊氮鈉（

20、有毒試劑）異硫氰酸熒光素（I型異購體，有商品供應）電磁攪拌器鋁鉑操作步驟用碳酸氫鈉緩沖液PH9.8稀釋抗體為1-5mg/ml，或抗體對該緩沖液充分透析，以足以使賴氨酸不解離 （去其正電荷），但注意保持大部分蛋白質(zhì)仍未變性；將透析袋放入100ml含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液（新配制）的燒杯中，用鋁鉑包燒 杯以避光，4C攪拌過夜；上述抗體液對PBS在4C透析以終止反應。其間至少更換PBS液三次，直致480nm的吸收為零；加入0.5g/L的疊氮鈉。此后，結(jié)合物在4C避光保存，或分裝后在一20C凍存。熒光偶聯(lián)質(zhì)量的檢測用標準免疫熒光染色試驗以測定偶聯(lián)率?；蛴肍/P值測定對

21、其FITC標記質(zhì)量進行鑒定：取結(jié)合物液0.2ml，加PBS 2.8ml （或兩者均改用半量），測定其A490/A280，查FITC標志曲線得其濃 度p g/ml值，按IgG的消光系數(shù)（mg/ml約A280 1.2），可計算其F/P值，即每mg抗體所標記的p gFITC的 比值，可以此鑒定及比較各批標記物的質(zhì)量。實驗要點及說明偶聯(lián)反應要求在盡可能接近pH9.8的溶液中進行，而且注意在反應過程中要保持此pH水平；要確定在偶聯(lián)反應緩沖液中不含游離氨基（Tris,氨及疊氮鈉均可與FITC反應，因此會降低蛋白質(zhì)與FITC的偶聯(lián)率）；FITC與蛋白質(zhì)的比值(F/P),可通過測定495nm與280nm吸光度

22、來鑒定。此比值的范圍應為0 .31.0(方法見前)；FITC唯一的缺限是易被光淬滅，因此復合物必須始終避光保存；如果FITC一復合物對PBS透析不充分，可能造成高本底，對免疫熒光染色產(chǎn)生干擾；如果被標記的蛋白質(zhì)是第二抗體或通用的第一抗體，則從商品購置可能更方便可取。參考文獻The, TH and Feltkamp, TEW. (1970) Conjugation of f luorescein isothiocyanate to antobodies.Experiments on the conditions of conjugation. Immunology 18, 865-873.The

23、, TH and Feltkamp, TEW. (1970) Conjugation of fluorescein isothiocyanate to antobodies.A reproducible method. Immunology 18, 875-881(朱正美)第五節(jié)生物合成過程的標記基本原理對生物合成過程進行標記，主要是為了研究蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)、合成、加工、細胞內(nèi)傳送、分泌和降解 過程。通常將細胞放在含有充足營養(yǎng)成分和放射性標記氨基酸的培養(yǎng)基中，雖然蛋氨酸和半胱氨酸在蛋白質(zhì) 中的含量較低，但其35S標記物具有特異性高（2.93 X10i3Bq/mmol）、容易檢測的特點，因此是進

24、行生物合 成標記的首選氨基酸。下列步驟是對懸浮液中細胞（脾或胸腺的單細胞懸浮液或者培養(yǎng)物）進行短期標記的 方法。注意事項：實驗室應具備進行放射性化合物操作的各種相關(guān)設備。放射性工作專用的水浴槽，保溫箱和離心機；在進行標記操作的時候，用蓋革氏計數(shù)器監(jiān)測操作區(qū)域；做好35S固體與液體廢物的處理工作；在實驗開始之前，要得到相關(guān)部門的批準；操作中，要嚴格地遵照國家管理條例的要求。試劑與設備在培養(yǎng)基中的細胞冰冷卻的PBS （參見附錄A）標記培養(yǎng)基:不含蛋氨酸、半胱氨酸的RPMI 1640培養(yǎng)基，水浴預熱到37 C35S蛋氨酸和35S半胱氨酸（800-l200 Ci/mmol = 2.93-4.44 X

25、1013 Bq/mmol）15或50 ml錐形聚丙烯離心管對標記培養(yǎng)基充分透析的胎牛血清（FCS）L-谷氨酸.微量吸管恒溫箱離心機（冷凍）操作步驟（一）細胞的準備工作在室溫下，以300 Xg離心5分鐘，收集到107-108個細胞；在錐形離心管中，用10ml 37 C的標記培養(yǎng)基洗滌細胞，然后300 X g離心5分鐘；丟棄上層清液；細胞沈淀加入標記培養(yǎng)基，重復洗滌一次。（二）前脈沖 Prepulse洗滌后的細胞，用37 C預熱的標記培養(yǎng)基重新懸?。? ml含20 X 106個細胞），在37 C孵育30分 鐘，間歇漩渦振蕩，以耗盡細胞內(nèi)原有的蛋氨酸和半胱氨酸；室溫解凍35S蛋氨酸和35S半胱氨酸；

26、注意：35S蛋氨酸容易揮發(fā)，請在專用的、裝有活性炭過濾器的通風櫥內(nèi)，打開35S蛋氨酸儲存液。目前，不易揮發(fā)的35S蛋氨酸和35S半胱氨酸均有商品出售。細胞液在室溫下，以300 X g離心5分鐘，棄上清。（三）脈沖Pulse將細胞團重新懸浮于標記培養(yǎng)基中（濃度20 X 106個細胞/1 ml）；加入 250 Mi 的 35S蛋氨酸和35S半胱氨酸（9.25 X 109 Bq）；細胞放入37。恒溫箱中，孵育30分鐘到3小時，孵育期間經(jīng)常振蕩，以保持細胞懸??；細胞液在室溫下，以300 Xg離心5分鐘，棄上清；警告：使用過的培養(yǎng)基和洗滌液均含有放射性，因此，請按規(guī)定方法操作和處理放射性物質(zhì)；用10ml

27、冰冷的PBS重新懸浮細胞，反復洗滌兩次；按“細胞提取液的制備”（見Protocol 43）中的方法進行細胞處理和分析，或者-20 C凍存細胞。質(zhì)量要點如果脈沖需要持續(xù)1小時以上，需要在無菌的條件下，向標記培養(yǎng)基中添加2%的胎牛血清和2%的L- 谷氨酸；對于大多數(shù)類型的細胞，可以采用帶螺口的組織培養(yǎng)瓶，并在濕潤的、含5% CO2的培養(yǎng)箱中進行孵育；孵育必須在37 C進行，溫度低會顯著地減少摻入到蛋白質(zhì)中的放射性；也可以使用14C-標記的氨基酸作標記，其半衰期長，有利于在較長的時間（幾個星期）內(nèi)使用標記的蛋 白質(zhì)，例如標記雜交瘤B細胞分泌的單克隆抗體，就常采用14C-標記的氨基酸混合物（絲氨酸，亮

28、氨酸， 纈氨酸）。參考文獻Coligan, J.E., Gates, F.T., III, Kimball, E.S. and Maloy, W.L. （ 1983） Radiochemical sequence analysis of biosynthetically labeled proteins. Meth. Enzymol. 91,413-434.Meisenhelder, J. and Hunter, T. （ 1988 ） Radioactive protein labelling techniques. Nature （London） 335, 120.（李京華朱正美）第六節(jié)免

29、疫膠體金標記抗體及檢測抗原基本原理膠體金在光鏡和電鏡中均為有效的標記物，可以檢測單一和多重抗原。膠體金在電解質(zhì)中不穩(wěn)定，但被 蛋白質(zhì)包被的膠體金是穩(wěn)定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被膠體金，可作標記二抗進行免疫檢測，本 方法應用范圍廣，染色后的樣品可以長期保存。試劑和設備超速離心機顯微鏡溫箱分光光度計0.2 um微孔濾膜載玻片，蓋薄片，濾紙氯金酸鈉1%檸檬酸鈉水溶液山羊抗鼠Ig抗體對T淋巴細胞特異的鼠抗人單克隆抗體自人外周血分離的白細胞懸液10%氯化鈉1%聚乙二醇0.01mol/L pH7.2 的 PBS1%戊二醛乙醇溶液50%硝酸銀溶液（提前一天配制）明膠顯影液，2g明膠溶解于99ml蒸餾水中，加1 ml甲酸操作步驟（一）膠體金溶液制備稱取0.1g氯金酸鈉，溶解于1L去離子水中；加熱煮沸，劇烈攪拌下，迅速加入25ml新配的1%檸檬酸鈉溶液；繼續(xù)煮沸5分鐘，至溶液變成桔紅色；用蒸餾水將溶液