蛋白質(zhì)的分離與純化重組蛋白質(zhì)表達分離與純化技術(shù)講座

1、蛋白質(zhì)的分離與純化重組蛋白質(zhì)表達分離與純化技術(shù)講座蛋白質(zhì)(Proteins)蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。機體中的每一個細胞和所有重要組成。氨基酸人類一共有20種常見的氨基酸，它們的排列組合形成了人類絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)。氨基酸鏈組成的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸分子呈線性排列所形成，相鄰氨基酸殘基的羧基和氨基通過肽鍵連接在一起。我們?yōu)槭裁匆兊鞍踪|(zhì)生命科學(xué)研究：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能，以及其在生理以及病理學(xué)的意義；工業(yè)或者治療：比如血液制品人血白蛋白，以及從豬胰臟中獲得的胰島素制劑；用于藥學(xué)研究等，比如能夠使一些細菌產(chǎn)生的抗性的蛋白；

2、生物體如何合成蛋白質(zhì)我們知道蛋白質(zhì)雖然結(jié)構(gòu)變化多端，但其實由20種氨基酸以特定的序列組成。但這個序列又從何來？近代分子生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)序列都是脫氧核糖酸DNA編碼的，但無論是人類，高等動物，高等植物還是細菌。即稱為中心法則(Genetic Central Dogma)AAADNAUUURNAPheProtein苯丙氨酸生物體的中心法則中心法則(Genetic Central Dogma)： 是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，以及遺傳信息從DNA傳遞給DNA的復(fù)制過程。DNA復(fù)制DNA轉(zhuǎn)錄RNA翻譯Central Dogma of Molecu

3、lar BiologyProposed by Francis Crick, 1958細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成如何獲得蛋白質(zhì)？天然蛋白從動植物組織中得到天然狀態(tài)的蛋白有機化學(xué)合成重組蛋白利用基因工程方法在宿主中表達的外源性蛋白。利用有機化學(xué)的方法合成，多數(shù)只能合成55個氨基酸以下的肽鏈重組蛋白表達中心法則告訴我們：既然蛋白質(zhì)的全部氨基酸信息都包含在DNA序列中，所以我們可以利用DNA來合成蛋白。我們可以利用宿主的中心法則系統(tǒng)，合成包括一些宿主本來根本不存在的蛋白，即重組蛋白。DNA復(fù)制DNA轉(zhuǎn)錄RNA翻譯重組蛋白表達大致過程包括基因獲取以及構(gòu)建，宿主的轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染，以及最后的蛋白質(zhì)收集。基因獲取基因克

4、隆宿主轉(zhuǎn)化蛋白獲得原料準(zhǔn)備蛋白合成啟動重組蛋白表達1. 原料-需要有正確而且完整的編碼蛋白質(zhì)的DNA的序列；2. 工廠-需要有將DNA轉(zhuǎn)錄翻譯的宿主系統(tǒng)，并處于正常工作中，將DNA序列正確加工成蛋白質(zhì)產(chǎn)品；常用的重組蛋白表達體系原核體系（工程桿菌-改造大腸桿菌）；昆蟲體系（天蠶蛾sf9,high5細胞）；哺乳動物體系：（倉鼠卵細胞CHO，人囊胚腎細胞Hek293等）；CHO細胞-贏潤細胞庫工程桿菌-贏潤基因庫為何選原核表達為什么選大腸桿菌做原核系統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達？容易克隆與基因改造；生長迅速，表達快速；培養(yǎng)容易而且非常廉價；大腸桿菌菌落-固像培養(yǎng)大腸桿菌菌液-液像培養(yǎng)適應(yīng)大腸桿菌中心法則保證DN

5、A不被降解能夠隨著細菌的增殖而同時被擴增（可復(fù)制）；保證質(zhì)粒在在細菌生長時不能丟失（不丟失，不出錯）；能夠正確被大腸桿菌宿主翻譯體系識別得到翻譯正確蛋白質(zhì)（可轉(zhuǎn)錄）。載體載體能夠承載靶蛋白的DNA序列，并使該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯完全能配合宿主系統(tǒng)，即被大腸桿菌識別。同時保證靶蛋白的基因序列可擴增，可復(fù)制，可表達。原核表達載體一般構(gòu)架復(fù)制啟動子Ori，保證質(zhì)粒在細菌中復(fù)制（可復(fù)制）抗生素抗性基因，生長抗性壓力下的細菌必須擁有質(zhì)粒（不丟失)轉(zhuǎn)錄起始，核糖體結(jié)合位點Figure 1: Diagram of the pGEX expression vector.pGEX-系列載體同樣擁有啟動子Ori（可復(fù)

6、制）抗性基因（不丟失）及轉(zhuǎn)錄lac基因（可轉(zhuǎn)錄）。常見的原核表達載體pGEX系列，包括pGEX-KG,pGEX-4T-2等pET系列，包括pET-15b，pET-22a，pET-42a等；pDESTpMAL系列；pBAD系列：常見的原核載體pTYB1，pMAL, pET28-b，pET-20b(+)，pRSFDuet-1，pRset-a ，pGEX-4T-2，pGEX-KG，pQE9, pBAD-his等原核表達載體，能夠滿足各種不同的需求。如果有興趣了解更多原核載體可以查詢：贏潤載體庫: :/如何得到更高效表達高效的噬菌體RNA聚合酶以及噬菌體啟動子何謂噬菌體噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或

7、螺旋體等微生物的細菌病毒的總稱。T7噬菌體其能夠侵染大腸桿菌，并快速的在大腸桿菌中進行復(fù)制，并利用大腸桿菌高效的表達自身的蛋白，而抑制大腸桿菌自身的蛋白質(zhì)合成。T7噬菌體T7噬菌體侵染大腸桿菌后，可以看到大腸桿菌自身的蛋白質(zhì)表達完全停滯。噬菌體浸染大腸桿菌的時間噬菌體高效表達自身蛋白原因T7啟動子活性非常高；噬菌體的轉(zhuǎn)錄活性非常高，擁有特定的DNA序列；因此兩者結(jié)合，能夠達到高效表達蛋白。因此Novagen公司就開發(fā)出一系列的pET(T7)系列的載體。這個體系有時候重組蛋白都可以達到細菌自身的一半以上。細胞分離提純分離原料從何處來?我們需要的特定蛋白如何與其它雜質(zhì)分離？分離得到粗蛋白之后，我們

8、如何進一步提純？蛋白質(zhì)分離純化流水過程得到含有重組蛋白的細胞之后，我們?nèi)绾螐闹械玫降鞍?？細胞裂解細胞裂解是為了將含有重組蛋白的分成釋放到可溶性的溶液中；常用方法：反復(fù)凍溶超聲儀破碎；碾磨破碎；如何分離與捕捉蛋白？目的蛋白留下含有10000種蛋白的粗提物其它無關(guān)蛋白棄去蛋白表面正電荷差異蛋白表面負電荷差異蛋白表面疏水性差異蛋白分子量大小差異蛋白表面親水性差異特定的親合能力差異性質(zhì)差異分離蛋白蛋白質(zhì)的捕捉為了從液像中捕獲蛋白，我們通過固象的瓊脂糖(sepharose)介質(zhì)偶聯(lián)特異性基團，就可以制成不同性質(zhì)的純化填料，捕捉不同特性的蛋白質(zhì)。疏水層析包括疏水層析(Phenyl-SepharoseTM6

9、FastFlow)，蛋白表面疏水性差異陰陽離子交換層析包括Q陰離子交換，以及SP陽離子交換層析蛋白表面正電荷差異蛋白表面負電荷差異Q陰離子交換SP陽離子交換陰陽離子交換層板洗脫目的蛋白質(zhì)陰陽離子交換層析分子量大小分離蛋白質(zhì)分子篩可以用于分離分子量大小不同的蛋白質(zhì)親合層析通過特異性的標(biāo)簽肽或蛋白，包括GST,His，使得目的蛋白能夠與蛋白柱特異性的結(jié)合。washporousbeadglutathioneeluteGSTapply samplethrombin siteprotein of interestExample: GST - GlutathioneGST-tagged proteins

10、bind to gluthatione on beadsNon-specifically or weakly bound proteins washed offGST-tagged proteins eluted with glutathione (competitor) or thrombin (protease)GST親合層析利用蛋白特性親合純化如NADPH偶連的層析柱能夠捕捉NADPH結(jié)合的蛋白質(zhì)；如鈣磷ATP柱能夠特異性的捕捉與ATP結(jié)合的蛋白激酶；金黃色葡萄球菌蛋白Protein-A可以特異性的結(jié)合抗體，并用于抗體蛋白的分離與純化。三種蛋白質(zhì)層析的檢測Protein mixture applied to columnSolvent (buffer) applied to top, flowed through column Different pro