海洋生物技術(shù)第七章 基因工程的下游技術(shù)

1、第七章 基因工程下游技術(shù)內(nèi)容提要第一節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點第二節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性第三節(jié) 基 因 工 程 菌 中 試第四節(jié) 重 組 工 程 菌 的 培 養(yǎng)第五節(jié) 高密度發(fā)酵第六節(jié) 基因工程藥物的分離純化第七節(jié) 變性蛋白的復(fù)性第八節(jié) 基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制第九節(jié)基因工程產(chǎn)品制造實例第一節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點 菌體的生長常用比生長速率（每小時單位質(zhì)量的菌體所增加的菌體量）表示。 工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源控制補料和稀釋速率等方法控制菌體的生長。 控制菌體的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。 大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體

2、的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度。 培養(yǎng)條件的改變，會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的合成和菌體的生長。一、菌體的生長與能量的關(guān)系菌體生長由呼吸控制，碳源決定菌體在該培養(yǎng)基的最大比生長速率。菌體生長所需能量大于有氧代謝所能提供的能量時，菌體產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物乙酸抑制菌體的生長。在高密度培養(yǎng)時，提高培養(yǎng)基pH可減弱乙酸的作用。分批培養(yǎng)中選用不同的碳源、補料培養(yǎng)中控制補料速度、連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等，通過降低供能速度和前體供應(yīng)速度，在一定范圍能控制菌體生長，實現(xiàn)高密度培養(yǎng)和提高產(chǎn)物的表達水平。實質(zhì)： 控制菌體的糖酵解速度，使之低于三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的最大代謝能力，從而避免乙酰

3、輔酶A的積累和乙酸的產(chǎn)生，以降低供能速度或前體供應(yīng)速度來降低蛋白合成和菌體生長速度。 大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。 采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷毎柚挂宜岙a(chǎn)生，可提高產(chǎn)量。二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加。 基因工程菌質(zhì)粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致工程菌生長速率降低。 質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。 高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程

4、菌大量前體被利用引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴緊反應(yīng)”有關(guān)。 “嚴緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時,核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點的ppGpp的結(jié)果。 ppGpp是一個重要的調(diào)控分子。它通過影響RNA鏈的延深過程減少轉(zhuǎn)錄。 (1)ppGpp四磷酸鳥苷（在G的5和3位點各附著兩個磷酸） (2) pppGpp五磷酸鳥苷（鳥苷5一三磷酸-3二磷酸）。 它的濃度增加會導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時RNA聚合酶在模板上的移動產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴緊控制的啟動子如rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。 也可能ppGpp是通過干擾RNA聚合酶與PL啟動子專一識別反應(yīng)?；蚬こ叹?/p>

5、傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，又分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。分裂不穩(wěn)定是指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。一、質(zhì)粒的不穩(wěn)定性第二節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因分裂不穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定二種類型（1）含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率（2）兩種菌的比生長速率差異的大小 （質(zhì)粒拷貝數(shù)低/高）質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析 將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，在不含抗性標記的平板培養(yǎng)基培養(yǎng)10-12h，隨機選100個菌落接種到含抗性標記的培養(yǎng)基培養(yǎng)10-12h，統(tǒng)計長出的菌落數(shù)，計算比值ST（stability）二、提高質(zhì)

6、粒穩(wěn)定性的方法（1）選擇合適的宿主菌 宿主菌的比生長速率、基因重組系統(tǒng)的特性、染色體上是否有與質(zhì)粒和外源基因同源序列等。（2）選擇合適的載體低拷貝質(zhì)粒工程菌不含質(zhì)粒子代頻數(shù)大高拷貝質(zhì)粒工程菌比生長速率低于不含質(zhì)粒菌調(diào)控比生長素率可改變質(zhì)?？截悢?shù)（3）兩階段培養(yǎng)法 使菌體生長至一定密度 誘導(dǎo)外源基因的表達（4）在培養(yǎng)基加入選擇性壓力 （加入抗生素抑制質(zhì)粒丟失菌的生長）（5）控制培養(yǎng)條件 （溫度、pH、培養(yǎng)基組分、溶解氧濃度）（6）固定化第三節(jié)基 因 工 程 菌 中 試中試應(yīng)考慮的問題 適合商品化生產(chǎn)的工程菌設(shè)計發(fā)酵反應(yīng)器選擇反應(yīng)過程發(fā)酵培養(yǎng)基組分維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法工藝監(jiān)測、控制、自動化使用

7、方法生物催化劑的使用產(chǎn)品分離、純化方法一、工程菌選擇（條件）能用一般基因重組技術(shù)獲得有高產(chǎn)潛力能以工業(yè)原料（碳源）為培養(yǎng)基生產(chǎn)工藝能用一般工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗?zāi)墚a(chǎn)生、分泌蛋白質(zhì)不致病、無毒性生產(chǎn)安全，符合國家衛(wèi)生部門規(guī)定代謝能控制產(chǎn)品有特異性發(fā)酵液黏度小二、反應(yīng)器（發(fā)酵罐）設(shè)計符合生物反應(yīng)與化學(xué)工程的需要設(shè)計前的生物數(shù)據(jù)：培養(yǎng)細胞系特性、細胞生長率、發(fā)酵罐消毒方法、溫度、溶氧、pH、CO2、代謝產(chǎn)物、后處理效果等。設(shè)計要求：能連續(xù)發(fā)酵和分批發(fā)酵；附有加料管、取料管、測量儀表；易安裝與移動；儀表數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好；可任意裝置附件；罐體為不銹鋼、光滑。三、發(fā)酵培養(yǎng)基組成提供化學(xué)元素：C、N、O、H、P、微

8、量元素、金屬離子等提供特殊營養(yǎng)：氨基酸、維生素等提供能源：葡萄糖等控制代謝：加入活性物質(zhì)、改變溫度和pH等四、工藝優(yōu)化與參數(shù)監(jiān)控優(yōu)化工藝：周期短、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、消耗低、安全性高、廢物處理周全、速度快、失敗率低等綜合指標。監(jiān)控數(shù)據(jù)：1）主要參數(shù)：pH、溫度、溶氧、CO22）生物量：濁度、細胞組分、總氮量、菌絲干重3）碳源：糖、有機酸、乙醇、淀粉、脂質(zhì)4）產(chǎn)品五、計算機的應(yīng)用優(yōu)化生產(chǎn)工藝降低勞動強度自動化第四節(jié)重 組 工 程 菌 的 培 養(yǎng)基因工程菌的培養(yǎng)過程（1）搖瓶操作：了解工程菌生長的基礎(chǔ)條 件（溫度、pH、培養(yǎng)基組分及C/N）， 分析表達產(chǎn)物的合成、積累對受體細 胞的影響。（2）培養(yǎng)罐操

9、作：確定培養(yǎng)參數(shù)、控制方 案及順序。一、基因工程菌的培養(yǎng)方式（1）補料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方式。溶氧、流加補料（2）連續(xù)培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定濃度后，開動進料和出料的蠕動泵，以控制一定稀釋率進行不間斷的培養(yǎng)。兩階段連續(xù)培養(yǎng)，控制和優(yōu)化誘導(dǎo)水平、稀釋率、細胞比生長速率。（3）透析培養(yǎng)：利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其生產(chǎn)菌的不利影響。（4）固定化培養(yǎng)：維持質(zhì)粒穩(wěn)定性（5）分批培養(yǎng)DO-Stat法：調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣速率控制DO （溶氧）在20%

10、，補料的流加速率是關(guān)鍵。Balanced DO-Stat法：控制溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速、糖的流加速率，使乙酸維持在低濃度?？刂凭w比生長速率的方法：在最優(yōu)表達水平獲得高密度、高表達。二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝基因工程菌發(fā)酵工藝的影響因素（1）培養(yǎng)基的影響（C、N、無機鹽、維生素、微量元素等）常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解產(chǎn)物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。另外還要加一些無機鹽、微量元素、維生素、生物素等。對營養(yǎng)缺陷型菌株還要補加相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)。 （2）接種量的影響（取決于菌種在發(fā)酵中的生長繁殖速度）接種量是指移入的種子液體和培養(yǎng)液體積的

11、比例。接種量小，不利于外源基因的表達，大接種量有利于對基質(zhì)的利用，縮短生長延遲期，并使生產(chǎn)菌能迅速占領(lǐng)整個培養(yǎng)環(huán)境，減少污染機會，但接種量過高又會抑制后期菌體的生長。所以接種量大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵中的生長繁殖速度。（4）溶解氧的影響（調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速前期低/后期高）溶解氧是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中影響菌體代謝的一個重要參數(shù)，對菌體的生長和產(chǎn)物的生成影響很大。外源基因的高效表達和翻譯需要維持較高水平的DO2值。通常采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法，可以改善培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。 （5）誘導(dǎo)時機的影響（溫度、氧、營養(yǎng)）一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導(dǎo)表達。（6）pH的影響（細胞生長期、外蛋白表

12、達期）pH對細胞的正常生長和外源蛋白的高效表達都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對pH進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。（7）誘導(dǎo)表達程序的影響：熱誘導(dǎo)總之，工程菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化對異源蛋白的表達關(guān)系重大，必須建立最佳化工藝。第五節(jié) 高密度發(fā)酵50gDCW/L200gDCW/L一、影響高密度發(fā)酵的因素1.培養(yǎng)基碳/氮 小 菌體生長旺盛碳/氮 大 數(shù)量得不到保證2.溶氧濃度提高溶氧的方法：用空氣通氣系統(tǒng)，提高通氣中氧的分壓。將透明顫菌血紅蛋白基因克隆到菌體中。與小球藻混合培養(yǎng)。 3.PH值4.溫度生長與表達之間的調(diào)節(jié)。升溫過程的控制。5.代謝副產(chǎn)物乙酸、CO2二、實現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法1.發(fā)酵條件的改進培養(yǎng)

13、基的選擇建立流加式培養(yǎng)方式提高供氧能力2.構(gòu)建產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑對碳代謝流進行分流限制進入糖酵解途徑的碳代謝流引入血紅蛋白基因3.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第六節(jié)基因工程產(chǎn)物的分離純化基因工程產(chǎn)品的特點（1）目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低；（2）含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜；（3）目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，易失活/變性；（4）生物活性物質(zhì)種類繁多；（5）應(yīng)用面廣，對質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱原等。因此，為了獲得合格得目的產(chǎn)物，必須建立與上述特點相適應(yīng)的生物技術(shù)產(chǎn)品的分離純化工藝。一、建立分離純化工藝需了解的各種因素（1）含目的產(chǎn)物的起始物料的特點 菌種類

14、型及代謝特性 原材料和培養(yǎng)基的來源及質(zhì)量 生產(chǎn)工藝與條件 初始物料的理化特性與生物學(xué)特性（2）物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)（3）目的產(chǎn)物特性（4）產(chǎn)品質(zhì)量的要求二、分離純化的基本過程分離純化是基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)中極其重要的一環(huán)。一般不應(yīng)超過45個步驟，包括細胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。分離純化的一般工藝過程可分為4個階段，即預(yù)處理、提取、精制、成品加工。（沉淀、吸附、萃取、超濾、結(jié)晶）發(fā)酵液初步純化細胞碎片分離細胞破碎細胞分離高度純化成品加工預(yù)處理胞外產(chǎn)物（加熱、調(diào)pH、絮凝）（過濾、離心分離、膜分離)（勻漿、研磨、酶解）（離心分離、雙水相萃取、膜分離）（重結(jié)晶

15、、離子交換、色譜分離、膜分離）（濃縮、無菌過濾、干燥、成型）胞內(nèi)產(chǎn)物提取精制三、細胞的破碎方法物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、高壓擠壓法?；瘜W(xué)破碎法：滲透沖擊、增溶法、脂溶法。生物破碎法：酶溶法機械破碎珠磨法研磨法勻漿法X-press法 通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。1 機械破碎法DY89-I型 電動玻璃勻漿機WSK臥式高效全能珠磨機Crushing in ball mill 珠磨法 ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機在高速珠磨機中，圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，使細胞懸浮液和玻璃珠相互攪動，由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動引起細胞破碎。 Homogenization勻漿法：Xpre

16、ss法將濃縮的菌體懸浮液冷卻至25至30形成冰晶體，利用500 MPa以上的高壓沖擊，冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。主要用于實驗室中。該法的優(yōu)點是適用的范圍廣，破碎率高，細胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，該法對冷冰融解敏感的生化物質(zhì)不適用。2 物理破碎法物理破碎干燥法凍融破碎法滲透壓破碎法超聲波破碎法 通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。JY92-II D超聲波細胞粉碎機 （1）超聲波破碎法超聲波破碎儀 超聲波破碎機通常在15到25千赫（kHz）的頻率下操作，細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用。這種空

17、穴泡由于受到超聲波的迅速沖擊而閉合，進而引起粘附性旋渦，渦旋生成與消失時產(chǎn)生巨大拉力，在介質(zhì)中的懸浮細胞上造成了剪切力，促使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。超聲波振蕩容易引起溫度的劇烈上升，操作時可以在細胞懸浮液中投入冰或在夾套中通入冷卻劑進行冷卻。（2）滲透壓破碎法將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內(nèi)，引起細胞壁的破裂。滲透壓沖擊的方法僅對細胞壁較脆弱的菌，或者細胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強度減弱時才是合適的。（3）凍融（凍結(jié)融化）法將細胞放在低溫下冷凍和室溫下融化，

18、反復(fù)多次而達到破壁作用。此法適用于細胞壁較脆弱的菌體。此法破碎率低，容易使對凍融敏感的蛋白質(zhì)變性，因此不適于對冷凍敏感的物質(zhì)分離。（4）干燥法包括空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等。通過改變細胞膜滲透性，再用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來?？諝飧稍镏饕m用于酵母菌，一般在25至30的氣流中吹干，然后用水、緩沖液或其它溶劑抽提?？諝飧稍飼r，部分酵母可能產(chǎn)生自溶，所以較冷凍干燥、噴霧干燥容易抽提。真空干燥適用于細菌的干燥。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)，將冷凍干燥后的菌體在冷冰條件下磨成粉，然后用緩沖液抽提。3 化學(xué)破碎法化學(xué)破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活

19、性劑：Triton、Tween通過各種化學(xué)試劑對細胞壁、膜的作用，而使細胞破碎（1）去污劑。如: Trition X-100 ，能溶解細胞膜而使蛋白透過細胞.去污劑能使蛋白變性,在細胞破碎以后必需除去. （2）有機溶劑。例如丙酮等，將菌體懸浮液慢慢倒入10倍體積預(yù)冷至20的丙酮中攪拌，使細胞脫水。丙酮除能脫水外，還能溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。但是，這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會帶來分離和回收化學(xué)物質(zhì)的問題。4 酶解破碎酶解破碎自溶法外加酶制劑法通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎 酶解法是利用酶反應(yīng)分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而達到破

20、壁目的。酶解的優(yōu)點是專一性強，發(fā)生酶解的條件溫和。 （1）溶菌酶 應(yīng)用最多的酶，能專一地分解細胞壁上糖蛋白分子的-l，4糖苷鍵，使脂多糖解離。經(jīng)溶菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中使細胞破裂。（2）自溶作用 微生物可代謝產(chǎn)生一種能水解細胞壁聚合結(jié)構(gòu)的酶，促進細胞增長。改變微生物的環(huán)境（溫度、pH等），可誘發(fā)產(chǎn)生過剩的自溶酶，以達到自溶目的。微生物細胞的自溶常采用加熱法或干燥法。但是，對不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細胞培養(yǎng)液過濾速度也會降低。四、固液分離離心沉降重力沉降膜過濾目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來決定。目的

21、產(chǎn)物分離純化的方法主要依賴色譜分離方法。五、重組蛋白質(zhì)的分離純化 產(chǎn) 物 特 性 作 用 等電點 決定離子交換種類及條件相對分子量 選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性 與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性 決定親和配基溶解性 決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性 決定工藝采用溫度及流程時間 產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用分離純化的技術(shù)要求：技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達到較高的純化倍數(shù)。收率要高。兩個技術(shù)間能直接銜接，不需要對物料加以處理。純化過程要快，滿足高生產(chǎn)率的要求。1 色譜分離技術(shù)的基本原理色譜分離技術(shù)是一類相關(guān)分離方法的總稱，利用不同組分在兩相中物理

22、化學(xué)性質(zhì)的差別，通過兩相之間不斷的相對運動，經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），使各組分以不同的速率移動，原來微小的分配差異被不斷放大，從而將各組分分離的技術(shù)。將它用于分析化學(xué)并配合適當(dāng)?shù)臋z測手段，就稱為色譜分析法。2 色譜系統(tǒng)的基本組成分為四個部分：高壓輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)所有的色譜系統(tǒng)都有兩個相組成，一個為固定相，一個為流動相。混合物在兩相中的分離決定于混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數(shù)來描述：當(dāng)一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中進行分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值為一常數(shù)，即分配系數(shù)（K）（平衡系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)）。用下式表示

23、： Cs 表示某一物質(zhì)在固定相中的濃度 K = Cm 表示某一物質(zhì)在流動相中的濃度 3 分配系數(shù)分配系數(shù)與被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)、固定相和流動相的性質(zhì)、色譜柱的操作溫度有關(guān)。各組分分配系數(shù)的差異程度決定了色譜的分離效果，分配系數(shù)差異越大分離效果越理想。4 色譜的基本概念固定相：固定相是色譜的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在色譜過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱色譜中一般稱為洗脫劑，薄層色譜時稱為展層劑。

24、如圖所示為一色譜流出曲線：基線：在實驗條件下，色譜柱后僅有純流動相進入檢測器時的流出曲線稱為基線?；€在穩(wěn)定的條件下應(yīng)是一條水平的直線。它的平直與否可反應(yīng)出實驗條件的穩(wěn)定情況。峰高（h）和峰面積（A） ：色譜峰頂點與峰底基線的垂直距離叫峰高。色譜峰與峰底基線所圍成區(qū)域的面積叫峰面積。區(qū)域?qū)挾龋嚎捎糜诤饬可V柱的柱效。寬度越窄，其效率越高，分離的效果越好。色譜分離中的四種典型情況 分離效果差，柱效低，選擇性低 完全分離，柱效高，峰窄，選擇性低 ；完全分離，選擇性增加，柱效低，峰寬完全分離，柱效高，選擇性好色譜流出曲線的意義： 色譜峰數(shù)等于樣品中單組份的最少個數(shù)； 色譜保留值定性分析的依據(jù)； 色譜

25、峰高或面積定量分析的依據(jù)； 色譜保留值或區(qū)域?qū)挾壬V柱分離效能評價指標； 色譜峰間距固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。 理想的洗脫曲線如圖所示。圖中的峰均呈對稱形，二者沒有重疊，這表明樣品液中的組分已完全分開。色譜峰的面積(FEG)、峰高(BE)和半峰高寬度(HI)等參數(shù)是定性、定量洗脫物的依據(jù)。表-1 概念、表示方法及計算公式匯總表-25 色譜分離方法的分類 色譜分離方法很多，種類有四、五十種。但常用于生物大分子分離的色譜方法，有以下幾種。柱色譜：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙色譜：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層色譜：將適當(dāng)粒度的吸

26、附劑鋪成薄層，以紙色譜類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。1) 按固定相形態(tài)不同分類：紙色譜和薄層色譜主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱色譜是常用的色譜形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠色譜、離子交換色譜、親和色譜、高效液相色譜等都通常采用柱色譜形式。2）根據(jù)流動相的相態(tài)不同分類色譜法液相色譜法氣相色譜法氣-液色譜法氣-固色譜法液-固色譜法液-液色譜法超臨界流體色譜法氣-液色譜是指載體表面涂有一層薄薄液體分子制成的介質(zhì),氣-固色譜是指載體表面含有許多吸附基團的固體吸附介質(zhì)。 分配色譜：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。吸附

27、色譜：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。 離子交換色譜：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠色譜：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 親和色譜法：利用固定相載體表面偶聯(lián)的具有特殊親和作用的配基，與流動相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性結(jié)合而進行分離。3) 按色譜過程的機理分類 凝膠色譜，又稱為凝膠過濾、分子排阻色譜或分子篩色譜。是以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種色譜技術(shù)。其設(shè)備簡單，操作方便，不需要再生處理即可反復(fù)使用，適用于不同相對分子質(zhì)量的各種物質(zhì)的分離，已廣泛地用于生物化學(xué)、生物工程和工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)

28、域。 6 凝膠色譜色譜技術(shù)各論 凝膠色譜的基本原理 當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠色譜柱時，大分子物質(zhì)分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出色譜柱，而達到分離的目的。離子交換色譜是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進行的。廣泛用于生化物質(zhì)(例如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、核苷和有機酸等)的分析、制備、純化，以及溶液的中和、脫色等方面。7 離子交換色譜色譜技術(shù)各論 離子交換色譜技術(shù)基本原理 離子交換劑由基質(zhì)、電荷基團(或功能基團)和反離子（

29、活性離子）構(gòu)成，基質(zhì)與電荷基團以共價鍵連接，電荷基團與反離子以離子鍵結(jié)合。 離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進行，假設(shè)以RA+代表陽離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：RA+B+ RB+A+ 親和色譜是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的色譜技術(shù)。 具有專一而又可逆的親和力的生物分子是成對互配的。主要的有：酶和底物、酶與競爭性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。 在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液中的另一方分子進行親和

30、色譜，達到分離純化目的。例如，酶與其輔酶是成對互配的，既可把輔酶作為固定相，使樣品中的酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中的輔酶分離純化。 8 親和色譜 色譜技術(shù)各論親和色譜的示意圖生物親和作用的本質(zhì)親和作用機理，特別是蛋白質(zhì)親和作用機理尚不清楚。蛋白質(zhì)表面存在一些凹陷或凸起結(jié)構(gòu)，上述結(jié)構(gòu)恰好能使某些小分子進入到其中，形成構(gòu)象上的鑰匙-鎖關(guān)系親和作用不僅依靠結(jié)構(gòu)上相似性，還需要多種力的相互作用載體配體臂待分離組分親和吸附洗滌洗脫再 生雜蛋白目的酶親和分離原理示意圖9 高效液相色譜色譜技術(shù)各論 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, H

31、PLC)，又稱高壓液相色譜法 、高速液相色譜法、現(xiàn)代液相色譜法等，是在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分析技術(shù)。適用于高沸點、不能氣化或熱穩(wěn)定性差的有機物分離分析，應(yīng)用廣泛。 工作原理：高壓泵將貯液罐的溶劑經(jīng)進樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出。當(dāng)待分離樣品從進樣器進入時，流經(jīng)進樣器的流動相將其帶入色譜柱進行分離，按先后順序進入檢測器，由記錄儀記錄。二、HPLC的特點 HPLC在高壓下使液體通過色譜柱，在室溫條件下分離混合組分，經(jīng)檢測器轉(zhuǎn)變成電信號，由記錄器描記或數(shù)據(jù)處理裝置顯示測定結(jié)果，具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特點。 高壓：HPLC是以液體作為流動相，通過色譜柱時所受的

32、阻力比較大，必須施加高壓。一般為15-30MPa，最高可達50MPa。 高速：HPLC采用高壓后，使流動相液體的流速加快，一般分析周期為數(shù)分鐘至數(shù)10分鐘，比經(jīng)典的液相柱色譜要快得多。 高效：HPLC的柱效較高(每米塔板數(shù)可達5000)，有時一根柱子可分離數(shù)十種乃至上百種組分。 高靈敏度：采用靈敏的檢測器和自動化裝置，可檢出10-9g乃至10-11g 的物質(zhì)；所需試樣量很少，通常只需數(shù)十微升試樣即可進行全分析。 操作過程演示1配制流動相把二次蒸餾水和色譜純級甲醇以15：85的比例混合取混合均勻的溶液，經(jīng)0.45m的有機膜過濾，再脫氣15分鐘即可操作過程演示2 更換色譜柱 把流動相貯液器放置在略

33、高于高壓泵的位置，插入帶有不銹鋼濾芯的輸液管 開啟高壓泵電源開關(guān)，打開排放閥 設(shè)置流動相比例和流速等參數(shù) 撳下高壓泵啟動鍵“ON/OFF”，再按“Purge”鍵，儀器開始清洗高壓泵和排除管路中的氣泡 。 觀察廢液出口，若沒有氣泡，按“Purge”鍵，停止排放，關(guān)閉排放閥。 打開檢測器電源開關(guān)，設(shè)置檢測波長 操作過程演示3儀器運行平衡后，用液相進樣針進樣，一般為定量管的35倍。工作站對所注射樣品進行分析測試，并繪制分離色譜圖。 色譜工作站對測試數(shù)據(jù)進行計算，并將結(jié)果在屏幕上顯示出來 操作過程演示4液相色譜法分析流程 高壓輸液泵將貯液器中的流動相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通

34、過進樣器將樣品導(dǎo)入，流動相將樣品依次帶入預(yù)柱、色譜柱，在色譜柱中各組分被分離，并依次隨流動相流至檢測器，檢測到的信號送至工作站記錄、處理和保存。 高壓輸液系統(tǒng) 貯液器材質(zhì)：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK） 容積：0.52.0L 放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓差 注意：密封、過濾高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液泵 要求：泵體材料能耐化學(xué)腐蝕；能在高壓（3060MPa）下連續(xù)工作；輸出流量穩(wěn)定（1%），無脈沖，重復(fù)性高（0.5%），而且輸出流量范圍寬；適用于梯度洗脫。 類型：一般可分為恒壓泵和恒流泵兩大類 高壓輸液系統(tǒng) 流動相過濾與脫氣裝置 流動相過濾裝置 分為在線過濾和真空過濾 流

35、動相脫氣裝置 分為在線真空脫氣和超聲波脫氣六通閥進樣器：用于固定體積進樣進樣系統(tǒng)六通閥進樣示意圖進樣系統(tǒng) 液相色譜進樣針：其針頭為平頭，以免扎破六通閥管路。用于可變體積進樣 自動進樣器分離系統(tǒng) 色譜柱 分離系統(tǒng)的主要部件是色譜柱，柱效高、選擇性好、分析 速度快是對色譜柱的一般要求。安裝和更換色譜柱時一定要使流動相能按箭頭所指方向流動。 一般在色譜柱前要求安裝保護柱，起到保護延長分析柱壽命的作用。有些物質(zhì)的分離條件要求有一定的溫度，因此，給色譜柱配一個柱溫箱是非常有必要的。 檢測系統(tǒng)解： 分類通用型：示差折光檢測器（RID）、電導(dǎo)檢測器（ECD）和蒸發(fā)光檢測器（ELSD）,它們檢測物質(zhì)總體物理性

36、質(zhì)的變化情況專用型：紫外檢測器（UV-Vis）、熒光檢測器（FD）， 它們檢測某一物理或化學(xué)性質(zhì)的變化數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（工作站） 打開工作站，選擇工作通道編輯方法文件，設(shè)置方法名稱、運行時間及定量方法輸入路徑名、樣品名、操作者等樣品分離完成后，記錄譜圖文件名和色譜峰峰高、峰面積和保留值等介質(zhì)：濾紙操作方法：將試樣溶于適當(dāng)溶劑中，點樣于濾紙的一端；選用適當(dāng)?shù)恼归_劑，借助毛細管現(xiàn)象從點樣的一端向另一端流動，展開結(jié)束后，取下濾紙，晾干，染色顯跡。10、紙色譜 （一）原理 濾紙一般能吸收25%29%的水，其中6% 7%的水是以氫鍵與濾紙纖維上的羥基結(jié)合，較難脫去。紙色譜實際是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而

37、以有機溶劑(與水不相混溶或部分混溶)作為流動相。展開時，有機溶劑在濾紙上流動，樣品中各物質(zhì)在兩相之間不斷地進行分配。由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度不同，從而達到分離的目的。 溶質(zhì)在濾紙上移動的速率可用Rf值（阻滯因數(shù)）表示： Rf= x/ y式中x：溶質(zhì)斑點中心的移動距離 y：溶劑前沿移動的距離 Rf值決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。在同一實驗條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以Rf值決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，Rf值也不相同，由此可以根據(jù)Rf值的大小對物質(zhì)進行定性分析。 溶劑前沿氨基酸顯色點濾紙原點XY（二）紙色譜操作過程 （1）樣品處理 用作紙色譜的樣品

38、，應(yīng)盡可能純化。調(diào)節(jié)到一定的pH值，濃度太低的可用真空濃縮提高濃度，濃度太高則需稀釋。 （2）點樣 將濾紙裁成適當(dāng)大小，用鉛筆在距邊線2cm左右劃一直線(稱為原線)，線上每隔2-3cm劃一圓點(稱為原點)。然后用點樣器(定性分析用普通毛細管，定量分析用血球計數(shù)管或微量注射器)輕輕點在原點上。樣品點的直徑約0.3-0.5cm。點樣的量由紙的長短及樣品的性質(zhì)決定，一般為5-30g。點樣采用少量多次，每點一次必須用冷風(fēng)吹干，然后再點第二次。每次點樣的位置應(yīng)完全重合，否則會出現(xiàn)斑點畸形現(xiàn)象。 （3）平衡 點樣以后展開之前先將濾紙與色譜缸用配好的溶液系統(tǒng)的蒸汽飽和，這個過程稱之為“平衡”。若不經(jīng)平衡，濾

39、紙和色譜缸未被溶劑蒸汽飽和，在色譜過程中，濾紙會從溶劑中吸收水分，溶劑也會從濾紙表面揮發(fā)，從而改變?nèi)軇┫到y(tǒng)的組成，嚴重時紙上會出現(xiàn)不同水平的溶劑前沿，嚴重影響色譜效果。平衡一般在密閉的色譜缸內(nèi)進行。 （4）展開 平衡結(jié)束后，將濾紙靠樣品點的一端浸入溶劑中，溶劑液面距原線距離約1cm，此時即開始展開。當(dāng)溶劑前沿到達濾紙另一端0.5-1cm處時，展開結(jié)束，取出濾紙，在溶劑前沿處做一標記，晾干或用冷風(fēng)吹干。 （5）顯色 為了顯示色譜斑點位置，可根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)不同，采用顯色劑顯示或紫外光顯示。 (1) 顯色劑顯示： 被分離物質(zhì)與顯色劑生成有顏色的化合物，顯示斑點位置。常用噴霧法 、浸漬法或涂刷法。 (

40、2) 紫外光顯示：有些物質(zhì)有紫外光吸收性質(zhì)，如核苷酸類物質(zhì)。有些物質(zhì)受紫外光照射會發(fā)出熒光，如維生素B1、B2等，可在紫外光照射下觀察到被分離物質(zhì)的斑點。 （6）定性分析 色譜后的斑點顯示出來后，計算出各斑點的Rf值，就可以對物質(zhì)進行定性。 （7）定量分析 對被分離的物質(zhì)進行定量的方法很多，常用的有： 剪洗比色法：將斑點剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摵?，通過分光光度計進行比色定量。 直接比色法：用特制的分光光度計直接測量濾紙上斑點顏色的濃度，畫出曲線，由曲線所包含的面積可求出待測物的含量。 面積測量法：實驗證明，圓形或橢圓形斑點的面積與物質(zhì)含量的對數(shù)成正比。所以，可用測量斑點面積的方法求得物質(zhì)的含量。

41、 六、非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除 DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。熱原質(zhì)的去除 熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（脂多糖），去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透；脂多糖是陰離子，可用陰離子交換層析除去；脂多糖是疏水性的，可用疏水層析法。病毒的去除 層析或過濾可將病毒去除。七、選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇分泌型表達產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮，可用沉淀和超濾法。細胞內(nèi)可溶性表達：親和層析或離子

42、交換色譜。周質(zhì)表達：滲透壓休克法。不溶性表達：離心分離。根據(jù)分離單元之間的銜接選擇先將最多的雜質(zhì)去除，將費用最高、最費時的分離單元放在最后階段。沉淀、超濾、吸附離子交換色譜、親和色譜凝膠層析。選擇合適的分離次序。根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則：具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；盡可能減少組成工藝的步驟；各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)；工藝過程中盡可能少用試劑；工藝所用時間要短；工藝和技術(shù)必須高效收率高易操作能耗；具有較高的安全性；第七節(jié) 變性蛋白的復(fù)性包含體是指細菌表達的蛋白在細胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、

43、外膜蛋白等，無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。優(yōu)點：包含體具有富集目標蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對宿主毒性小。一、包含體形成的原因表達產(chǎn)率過高。 重組蛋白的氨基酸組成：含硫氨基酸。重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成包含體。重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白 。蛋白質(zhì)本身固有的溶解度。蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致包含體的形成。 二、包含體的分離和溶解包含體的分離：重組菌破碎離心沉淀低濃度的變性劑，去垢劑洗滌。包含體的溶解：強變性劑，強去垢劑。鹽酸胍，脲，TritonX-100 ，SDS，巰基乙醇，EDTA等。三、包含體蛋白復(fù)性的方法理想的復(fù)

44、性方法的特點： 活性蛋白質(zhì)的回收率高。 正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊蛋白分離。 折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。 折疊復(fù)性方法易于放大。 復(fù)性過程耗時少。1.稀釋、透析復(fù)性法降低重組蛋白的濃度，減少聚集降低變性劑，去垢劑的濃度2.封閉蛋白的疏水簇促進復(fù)性3.凝膠過濾層析復(fù)性4.小分子添加劑促進的復(fù)性5.分子伴侶或折疊酶促進的復(fù)性6.人工分子伴侶促進復(fù)性第八節(jié) 基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制 基因工程是利用活細胞作為表達系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可造成嚴重危害。 宿主細胞中表達的外源基因，在轉(zhuǎn)錄、翻譯、精制、工藝放大過程中都可能發(fā)生變

45、化，故從原料以及制備全過程都必須嚴格控制條件和鑒定質(zhì)量。藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP） FDA/SFDA 國家藥監(jiān)局一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點產(chǎn)品安全性評價產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)嚴格控制條件二、 生物材料的質(zhì)量控制 原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性：明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列確證； 應(yīng)提供表達載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)制子、啟動子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記物； 應(yīng)提供宿主細胞的名

46、稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性。須闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細敘述在生產(chǎn)過程中啟動與控制基因在宿主細胞中表達的方法及水平等。三、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。四、純化工藝過程的質(zhì)量控制產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基

47、成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測方法。五、目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制生物活性物質(zhì)的質(zhì)量控制主要包括以下幾項要求:產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。1.生物活性測定 需通過動物體內(nèi)試驗和通過細胞培養(yǎng)進行體外效價測定。2.理化性質(zhì)的測定 電泳方法: SDS、等電聚焦、免疫電泳。 免疫學(xué)方法: 放射免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫(ELISA) 受體結(jié)合試驗。 高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、末端序列分 析、圓二色譜、核磁共振。非特異性鑒別特異性鑒別相對分子質(zhì)量測定等電點測定肽圖分析氨基酸組

48、成分析部分氨基酸序列分析蛋白質(zhì)二硫鍵分析3. 蛋白質(zhì)含量及純度的分析 染色劑法、SDS、等電聚焦、各種HPLC、 毛細管電泳4.雜質(zhì)檢測蛋白類雜質(zhì) 殘留宿主細胞蛋白采用免疫分析的方法。非蛋白類雜質(zhì) 病毒、細菌等微生物、熱原、內(nèi)毒素、致敏源及DNA。常用檢測方法：雜質(zhì)和污染物 檢 測 方 法內(nèi)毒素 鱟試劑、家兔熱原法宿主細胞蛋白 免疫分析、SDS、CE其它蛋白雜質(zhì) 免疫分析、SDS、 HPLC、CE殘余DNA DNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異 肽譜、HPLC、 IEF、 CE甲酰蛋氨酸 肽譜、HPLC、 IEF、 CE蛋氨酸氧化 肽譜、HPLC、 質(zhì)譜、氨基酸分析產(chǎn)物變性或聚和脫氨基 SD

49、S、IEF、HPLC、CE、質(zhì)譜、 凝膠過濾雜質(zhì)和污染物 檢 測 方 法單克隆抗體 SDS、免疫分析氨基酸取代 氨基酸分析、肽譜、質(zhì) 譜、CE微生物 微生物學(xué)檢查支原體 微生物學(xué)檢查病毒 微生物學(xué)檢查5.穩(wěn)定性考查 是藥品有效性安全性的重要指標，是藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。6.產(chǎn)品一致性的保證六、產(chǎn)品的保存液態(tài)保存低溫保存在穩(wěn)定的PH下保存高濃度保存加保護劑保存固態(tài)保存低溫冷凍干燥機第九節(jié)基因工程產(chǎn)品制造實例 干擾素（interferon，IFN）是人體細胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個類型。型干擾素在分為1b、2a、2b等亞型。一、基因工程菌的組建誘生的白細胞 提取全RNA 通過寡dT-纖維素柱 蔗糖密度梯度 獲得寡A的mRNA 離心提取12s 的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 雙鏈cDNA接上dT或dG尾 pBR322質(zhì)粒 pBR322質(zhì)粒加上dA或dC 退火獲的雜交質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 擴增雜交質(zhì)粒 篩選抗青霉素但對氨芐 用雜交翻譯法挑選 青霉素敏感細菌