異體脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合纖維蛋白BMP修復(fù)兔橈骨缺損

1、異體脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合纖維蛋白BMP修復(fù)兔橈骨缺損【摘要】討論以纖維蛋白復(fù)合脫蛋白松質(zhì)骨作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BP)的載體修復(fù)兔節(jié)段性骨缺損。方法于36只青紫藍(lán)兔兩側(cè)橈骨干處造成1.5缺損，采用三種方法進(jìn)展處理：A組，植入脫蛋白松質(zhì)骨、纖維蛋白、BP的復(fù)合物；B組，植入脫蛋白松質(zhì)骨；組，空白對照。術(shù)后2、4、8、12、16周進(jìn)展放射學(xué)、組織學(xué)和電鏡檢查。結(jié)果A組骨缺損區(qū)在成骨活潑程度、骨再生量和再生髓腔構(gòu)造等方面均顯著優(yōu)于B組，使骨缺損得到了較徹底的修復(fù)。B、兩組均不能產(chǎn)生骨性愈合。結(jié)論脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合纖維蛋白是較理想的BP載體材料，以三者的復(fù)合物修復(fù)骨缺損可到達(dá)滿意效果。【關(guān)鍵詞】脫蛋白松質(zhì)骨纖

2、維蛋白BP組織工程骨缺損修復(fù)AbstratbjetiveTrepairsegentalbnedefetiththepsitefdeprtEinisedanellusbne,bnerphgenetiprtein(BP)andfibrin.ethdBnedefetserereatedin36NeZealandrabbitsnthebilateralradiiandtreatediththreekindsfiplantatins:A,psitefdeprteinisedanellusbne,BPandfibrin;B,fdeprteinisedanellusbne;,blankntrl.Thedef

3、etserebservedbyentgengraphy,ptialirspy,andeletrn-irspyat2,4,8,12,16eeks.ResultThedefetstreatedithAiplantatinregenerateduhrenebneandbridgedearlierthanthedefetstreatedithBiplantatinandgtpletelyrepaired16eeksafterperatin.ThedefetsithBandiplantatinuldntgetsseustissuehealing.nlusinThepsitefdeprteinisedan

4、ellusbne,bnerphgenetiprtein(BP)andfibrinanbeeffetivelyusedtrepairsegentalbnedefet.Keyrds：deprteinisedanellusbne;fibrin;bnerphgenetiprtein(BP);tissueengineering;bnedefet;repair骨具有再生和修復(fù)才能，因腫瘤切除、外傷、骨異常生長所造成的骨缺損，在單純依靠骨自行修復(fù)無法愈合的情況下，那么需采用手術(shù)治療。自體骨移植是一種較好的治療方法，已被廣泛應(yīng)用于臨床。但其來源有限，不能滿足臨床需求，而且對患者造成創(chuàng)傷，于是人們把目光轉(zhuǎn)向能促

5、進(jìn)組織或細(xì)胞生長、分化和增殖的材料。本實驗就異體脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合纖維蛋白、BP修復(fù)兔橈骨缺損的方法和機(jī)制進(jìn)展討論，以評價復(fù)合材料作為骨組織工程材料的作用。1材料和方法1.1植入材料的制備外表皮質(zhì)骨，制成直徑約0.50.50.5大小松質(zhì)骨顆粒，用流動自來水反復(fù)沖洗骨粒45h，致無血漬浸出為止，將其放入蒸餾水三角瓶中，搖床上震動45h。其間每30in換蒸餾水一次，再將其放入超聲波清洗機(jī)中反復(fù)進(jìn)展清洗，每次30in，清洗35次，自然晾干后，將其放入甲醇與氯仿(11)混合液中，不時攪拌，12h更換混合液，倒棄混合液，蒸餾水沖洗骨粒3次，自然晾干。用0.6l/LHL脫鈣5in，蒸餾水沖洗3次，自然晾干，

6、轉(zhuǎn)入30%過氧化氫中，不時攪拌，12h更換過氧化氫液一次，處理24h，蒸餾水沖洗3次，自然晾干，轉(zhuǎn)入-80深低溫冰箱冷凍保存。別離出血清，置-30冰箱凍存過夜，次日轉(zhuǎn)入4冰箱緩慢融解，待徹底融解后，于4條件下離心，搜集冷沉淀。冷沉淀用冷凍枯燥機(jī)凍成干粉，再用重蒸水溶解，配成120gl的纖維蛋白原溶液?？菰餀C(jī)枯燥，裝入培養(yǎng)皿中，1.0106rads60輻照(蘭州輻照中心)，將100g提取的小牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶于10L的4l/L的鹽酸胍溶液中，參加10g異體松質(zhì)骨顆粒，4，充分?jǐn)嚢杌靹蛞后w與固體成分，置冷凍枯燥機(jī)內(nèi)抽真空、透析、凍干24h，分裝。1.2試驗方法選用青紫藍(lán)兔36只，體質(zhì)量23kg不等

7、，雌雄不限，隨機(jī)分為3組。在無菌手術(shù)室中，速眠新-麻醉滿意后，常規(guī)去毛、消毒、鋪巾。取前臂縱行切口，長約34，行雙側(cè)橈骨中段截骨，造成15的骨和骨膜缺損，分別按組植入材料。詳細(xì)分組見下表。創(chuàng)口縫合，肢體不做固定。將其分籠飼養(yǎng)，自由活動。術(shù)后肌注慶大霉素預(yù)防感染。分別于術(shù)后4、8、12、16周取材，每次3只。表1試驗分組情況表左側(cè)右側(cè)數(shù)量A脫蛋白松質(zhì)骨/rhBP/纖維蛋白復(fù)合物脫蛋白松質(zhì)骨/rhBP/1.3觀察指標(biāo)1.3，1X線檢查各組動物于手術(shù)當(dāng)日和取材日拍雙側(cè)尺、橈骨正側(cè)位片，觀察各組內(nèi)及組間術(shù)后不同時間的骨缺損愈合情況?？菰?，鍍膜，電鏡觀察。2結(jié)果2.1X線檢查A組術(shù)后4周骨缺損兩端有少量

8、密度較低的骨痂形成，缺損區(qū)呈大片云霧狀影，密度低于骨干；術(shù)后8周新骨橋接骨缺損，密度均勻，形成連續(xù)性骨痂；術(shù)后12周骨皮質(zhì)已完好形成，髓腔未完全形成；術(shù)后16周骨性連接形成，髓腔再通。B組術(shù)后4周缺損區(qū)大片云霧狀影，密度低于骨干，兩斷端有骨痂形成；術(shù)后8周缺損區(qū)密度增高，密度仍低于骨干；術(shù)后12周新骨橋連接骨缺損，密度不均勻，骨皮質(zhì)不連續(xù)；術(shù)后16周無骨性連接形成，髓腔未形成。組術(shù)后4周骨缺損兩端有少量骨痂形成；術(shù)后8周骨缺損兩端有少量骨痂形成，無骨性連接；術(shù)后12周骨缺損兩端有少量骨痂形成，無骨性連接；術(shù)后16周骨缺損兩端有少量骨痂形成，無骨性連接。2.2組織學(xué)檢查HE染色A組：術(shù)后2周骨缺

9、損兩端可見骨痂形成，移植物周圍見反響性細(xì)胞；術(shù)后4周宿主結(jié)締組織、纖維組織長入植骨材料周邊，可見肉芽組織，少量炎癥細(xì)胞，有少量軟骨形成，見少量成骨細(xì)胞；術(shù)后8周植骨材料有吸收表現(xiàn)，新生軟骨連接成片，可見成骨細(xì)胞，有較多編織骨形成；術(shù)后12周植骨材料周圍已根本吸收完全，由軟骨細(xì)胞及編織骨替代，可見板狀骨形成及少量骨髓組織；術(shù)后16周植骨材料已根本吸收完全，僅中間有少量剩余，軟骨細(xì)胞已被板狀新生骨代替，可見骨髓組織形成，髓腔再通。HE染色B組：術(shù)后2周骨缺損兩端可見骨痂形成，移植物周圍見反響性細(xì)胞；術(shù)后4周植骨材料周圍肉芽組織形成，可見少量炎癥細(xì)胞，無明顯新生軟骨及骨形成，可見少量成骨細(xì)胞及成軟骨

10、細(xì)胞；術(shù)后8周植骨材料周圍可見軟骨細(xì)胞，部分成島狀，無新生骨形成；術(shù)后12周植骨材料周圍已根本吸收，可見島狀軟骨，少量新生編織骨無板狀骨及骨髓形成；術(shù)后16周植骨材料已根本吸收，僅少量剩余，可見大量新生編織骨和新生軟骨，有板狀骨形成，可見少量骨髓組織。HE染色組：術(shù)后2周骨缺損兩端可見骨痂形成，移植物周圍見反響性細(xì)胞；術(shù)后4周骨缺損兩端，有少量骨痂形成，可見肉芽組織及驗證細(xì)胞；術(shù)后6周骨缺損兩端骨痂形成；術(shù)后8周骨缺損兩端有少量新生軟骨；術(shù)后12、16周骨缺損兩端有少量新生編織骨及板狀骨形成，無骨髓組織。2.3掃描電鏡檢查A組術(shù)后16周材料己完全吸收，可見新生骨小梁，外表可見小的滋養(yǎng)血管。2.

11、4大體標(biāo)本A、B、組術(shù)后16周均取大體標(biāo)本觀察圖片：A組術(shù)后16周可見骨缺損已骨性愈合；B組術(shù)后16周，可見骨缺損有少量骨性連接，骨皮質(zhì)不連續(xù)，尚有0.5缺損；組術(shù)后16周，骨折缺損未愈合圖14。3討論松質(zhì)骨經(jīng)脫蛋白、脫脂、脫鈣等處理后形成大小不等、互相交通、外表粗糙、開放的孔隙和高度的空隙間連接，這增加了細(xì)胞材料間的接觸面積，對種子細(xì)胞的早期黏附以及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)、代謝產(chǎn)物運(yùn)送和血管化均非常有利，合適新生骨組織的長入。將其與BP、VEGF復(fù)合，植入宿主體內(nèi)后多點成骨，效果滿意。但由于組織相容性抗原差異，新穎移植會誘發(fā)宿主的免疫排擠反響，導(dǎo)致愈合過程延遲甚至失敗。本實驗采取了脫蛋白、脫脂、凍干、

12、深低溫冷凍、60輻照等方法，抑制組織相容性抗原，植入體內(nèi)不會刺激宿主產(chǎn)生抗HLA抗體，臨床應(yīng)用不需組織配型。術(shù)后各組傷口均未出現(xiàn)紅腫、滲出，傷口愈合好，組織學(xué)切片也未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)出良好的組織相容性。圖1aA組術(shù)后2周骨缺損兩端可見骨痂形成，移植物周圍反響性細(xì)胞圖1bA組術(shù)后4周宿主結(jié)締組織、纖維組織長入植骨材料周邊，可見肉芽組織，少量炎癥細(xì)胞，無明顯骨形成，有少量軟骨形成圖1A組術(shù)后6周植骨材料周圍炎癥細(xì)胞、肉芽組織已吸收，植骨材料周圍骨小梁內(nèi)可見成軟骨細(xì)胞及新生軟骨，部分成島狀，植骨材料無明顯吸收表現(xiàn)，有少量編織骨形成圖1dA組術(shù)后8周植骨材料有吸收表現(xiàn)，新生軟骨連接成片，可見成

13、骨細(xì)胞，有較多編織骨形成圖1e、fA組術(shù)后12周植骨材料周圍已根本吸收完全，由軟骨細(xì)胞及編織骨替代，可見板狀骨形成及少量骨髓組織圖1gA組術(shù)后16周植骨材料已根本吸收完全，僅中間有少量剩余，軟骨細(xì)胞已被板狀新生骨代替，可見骨髓組織形成，髓腔再通圖2aA組橈骨缺損造模圖2bA組術(shù)后4周，骨缺損兩端有少量密度較低的骨痂形成，缺損區(qū)呈大片云霧狀影，密度低于骨干圖2術(shù)后8周新骨橋接骨缺損，密度均勻，形成連續(xù)性骨痂圖2d術(shù)后12周骨皮質(zhì)已完好形成，髓腔未完全形成圖2e術(shù)后16周骨性鏈接形成，髓腔再通圖3aA組術(shù)后16周大體圖片，可見骨缺損已骨性愈合圖3bB組術(shù)后16周大體圖片，可見骨缺損有少量骨性連接，

14、骨皮質(zhì)不連續(xù)，尚有05缺損圖3組術(shù)后16周大體圖片，骨折缺損未愈合圖4aA組16周電鏡照片可見材料已吸收，外表有較多骨細(xì)胞，可見小的滋養(yǎng)血管圖4bA組16周電鏡可見新生骨小梁纖維蛋白作為粘合劑已在外科臨床廣泛應(yīng)用，并具有抗原性低，降解吸收性好，促進(jìn)血管化和骨傳導(dǎo)等多種特性和生理功能3，同時其還具有良好的可塑性，可以根據(jù)需要制成各種形狀。新穎制備的纖維蛋白凝膠具有一定的抗壓性和彈性，植入缺損區(qū)后不必采取固定或支撐措施；另外纖維蛋白與BP復(fù)合的工藝簡單4。實驗結(jié)果說明，植入復(fù)合物的骨缺損區(qū)在成骨活動的活潑程度、骨再生量和再生髓腔構(gòu)造等方面均顯著優(yōu)于對照組，并使骨缺損得到了較徹底的修復(fù)。IsgaiN

15、等5將培養(yǎng)后的牛骨膜細(xì)胞與FG混合植入裸鼠背部皮下，12周時形成了新骨，而單純FG無新骨形成，證明了其具有骨誘導(dǎo)才能。陳克明等6也證實了纖維蛋白膠作為骨組織工程載體的可行性。目前纖維蛋白膠主要在可注射型組織工程骨中應(yīng)用。Kaaura等7報道，BP與纖維蛋白復(fù)合后骨誘導(dǎo)活性顯著進(jìn)步。纖維蛋白是一種低抗原的生物大分子材料，易于降解，可塑性良好，在多方面符合骨組織材料載體的理想條件。骨折的修復(fù)是一個復(fù)雜的過程，受多種激素，全身及部分生長因子調(diào)控，對骨的形成和生長起到重要作用。BP即骨形態(tài)發(fā)生蛋白，來源于骨及骨源性細(xì)胞的特異性生長因子，其靶細(xì)胞為血管周圍的周細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞及多能干細(xì)胞。BP作用于靶細(xì)胞后，可使間充質(zhì)細(xì)胞聚集，定向分化為具有不同功能特點的生骨細(xì)腦，通過軟骨內(nèi)骨化及膜內(nèi)骨化而成骨。Urist8等提出誘導(dǎo)成骨理論以后，人們認(rèn)識到以BP為主的一系列骨生長因子的作用，作者按照其提出的方法制備了BP，經(jīng)過屢次成骨性能研究證實其活性好、且穩(wěn)定。人們在應(yīng)用修復(fù)骨缺損修復(fù)的研究時，常將它與一些能充當(dāng)其