趨化因子受體CCR5胞外段重組蛋白的克隆、表達(dá)、純化及鑒定

1、趨化因子受體CCR5胞外段重組蛋白的克隆、表達(dá)、純化及鑒定【關(guān)鍵詞】因子lning,expressin,purifiatinandidentifiatinfR5extraellulardainrebinantprtEin【Abstrat】AI:TnstrutaprkarytiexpressinvetrfR5extraellulardainrebinantprteinandtpurifyandidentifyit.ETHDS:TbtainainaidsequenefR5extraellulardains,thefurpeptidesfR5Nter,EL1,EL2andEL3erebinedusi

2、ngthesftlinkerandnaedrR5.RR5geneassynthesizedardingtdnE.lipreferred.ThegeneaslnedintthevetrpET22b+andtheaiprteinasexpressedinE.li.Theexpressinprdutaspurifiedandthenidentifiedithesternblt.RESULTS:edevelpedapurifiatinpressfrR5frinlusinbdies.Thepredureinludedashingandslubilizatinfinlusinbdy,purifiatinb

3、ySepharylS300andrefldingbySepharylS100.TheresultfesternbltshedthespeifibindingfR5Abithaiprtein.NLUSIN:PurifiedrebinantprteinrR5isbtainedsuessfully,hihanbeusedasaandidateantigenfrR5autvainethallengeHIV1infetin.【Keyrds】R5;PADRE;inlusinbdies;reflding;autvaine;HIV1infetin【摘要】目的：構(gòu)建趨化因子受體5(R5)胞外段重組蛋白(命名為：

4、rR5)原核表達(dá)載體，并進(jìn)展誘導(dǎo)表達(dá).對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)展純化和鑒定.方法：截取R5胞外構(gòu)造4個片段NTer，EL1,EL2和EL3的氨基酸序列，應(yīng)用柔性linker分別串聯(lián)，模擬R5胞外構(gòu)造，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子人工合成基因.運(yùn)用基因重組方法在大腸桿菌中進(jìn)展表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化、復(fù)性后進(jìn)展esternblt鑒定.結(jié)果：目的蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)包涵體洗滌、變性溶解，SepharylS300凝膠過濾層析及SepharylS100凝膠柱復(fù)性獲得了純化的蛋白質(zhì)，目的蛋白能與R5Ab特異性結(jié)合.結(jié)論：獲得了大量純化的rR5重組蛋白，可作為研制R5自體蛋白疫苗以阻斷HIV1感染的候選抗原蛋白.【關(guān)鍵詞】

5、R5;人工手動HTL表位；包涵體;復(fù)性;自體疫苗;HIV1感染0引言趨化因子受體5(R5)是HIV1感染初期病毒進(jìn)入體內(nèi)最重要的輔助受體1，近幾年來，以R5為靶點的抗HIV1策略倍受關(guān)注，通過小分子拮抗劑、單克隆抗體及基因干預(yù)等不同手段減弱或降低細(xì)胞外表R5的功能到達(dá)對抗HIV1感染的目的2-5.其中以R5為靶向的自體疫苗開拓了艾滋病疫苗研究的新途徑6.R5自體疫苗通過誘導(dǎo)機(jī)體自身產(chǎn)生針對自身分子R5的抗體進(jìn)而與細(xì)胞外表的R5結(jié)合，降低細(xì)胞外表的R5的數(shù)量，減少了HIV1病毒感染的時機(jī)，到達(dá)預(yù)防HIV1感染的效果.我們構(gòu)建人R5胞外段重組蛋白表達(dá)載體，對獲得的重組蛋白純化、復(fù)性.為構(gòu)建R5自體

6、蛋白疫苗提供實驗根據(jù).1材料和方法1.1材料各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶TaKaRa公司；DL2000DNAarker大連寶生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒上海博亞生物技術(shù)；蛋白arker羊抗鼠二抗華美公司；小鼠抗人R5AbRD公司.其他試劑均為國產(chǎn)分析純.原核表達(dá)載體pET22b(+)質(zhì)粒為本室保存.宿主菌為大腸桿菌BL21.5L發(fā)酵罐B.Braun公司.4高速離心機(jī)、凍干機(jī)Bekan公司.凝膠柱填料SepharylS300，SepharylS100及純化設(shè)備AershaPharaiaBiteh公司.1.2方法1.2.1R5胞外段基因的合成分析SissPr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫R5的構(gòu)

7、造，截取R5胞外4個片段NTer,EL1,EL2,EL3的氨基酸序列，分別為NTer:DYQVSSPIYDINYYTSEPQKINVKQIAAR(31)；EL1：YAAAQDFGNTQ(14)；EL2:RSQKEGLHYTSSHFPYSQYQFKNFQTLK(30)；EL3:NTFQEFFGLNNSSSNRLDQA(22).應(yīng)用柔性linker氨基酸序列為GGGGS分別串聯(lián)，獲得模擬R5胞外片段的氨基酸序列(命名為：rR5)，按照已公布的人R5的基因序列，于5端插入Nde酶切位點,3端引進(jìn)終止密碼子TGA并插入Sal酶切位點，根據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子，送交上海生工生物技術(shù)公司合成目的基因.1.

8、2.2pET22b(+)/rR5表達(dá)載體的構(gòu)建將含有合成目的基因的質(zhì)粒pU57經(jīng)Nde和Sal雙酶切后，回收360bp左右的小片段，同時用Nde和Sal雙酶切pET22b(+)，回收大片段.建立連接體系，16連接過夜.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和DNA測序正確后獲得含有rR5基因原核表達(dá)載體，命名為pET22b(+)/rR5.1.2.3pET22b(+)/rR5原核載體的表達(dá)pET22b(+)/rR5轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21細(xì)胞，挑取含重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21單菌落并接種于5L含100g/L氨芐青霉素Ap的新穎LB培養(yǎng)液中,37搖床培養(yǎng)過夜,次日以1100接種于含100

9、g/LAp的新穎LB培養(yǎng)液中,37繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)菌密度到達(dá)A600n=0.40.6,1l/LIPTG誘導(dǎo)，4h后收菌，小規(guī)模培養(yǎng)及誘導(dǎo)后離心搜集菌體,SDSPAGE檢測目的蛋白的表達(dá)和存在形式.1.2.4工程菌的發(fā)酵從活化的LB平板上挑選單菌落接種于含LB的試管中,37培養(yǎng)10h,轉(zhuǎn)種至含200LLB的三角瓶中,37培養(yǎng)過夜.次日將種子液接種于5L發(fā)酵罐.控制發(fā)酵溫度37，轉(zhuǎn)速250450r/in、通氣量35L/in，pH7.3.培養(yǎng)至A600n=8時,1l/LIPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h,終止發(fā)酵,搜集菌體、稱質(zhì)量，-20冰箱保存?zhèn)溆?取少量菌體處理后用SDSPAGE檢測目的蛋白的表達(dá).1.2.

10、5目的蛋白包涵體的別離和洗滌取10g發(fā)酵菌體,按1g濕菌質(zhì)量對7L的比例,用裂解緩沖液STE(50l/LTrisHl,pH8.0,50l/LNal,1l/LEDTA)重懸,-20過夜.次日于室溫水浴中融化,溶菌酶法裂菌，400超聲破菌，其中超聲5s,間隔10s,共進(jìn)展100次.12000g4離心20in,棄上清,沉淀用包涵體洗滌液A(10L/LTritnX100,1l/LEDTA,10g/LD，50l/LTrisHl，pH8.5,100l/LNal)重懸,12000g4離心20in,棄上清.再用包涵體洗滌液B50l/LTrisHl，pH8.5,2.5l/L尿素,100l/LNal,5l/L巰基

11、乙醇,1l/LEDTA重復(fù)洗滌3次,直至離心后的上清液澄清為止.最后用包涵體洗滌液(50l/LTrisHl，pH8.5,1l/LEDTA)洗滌1次后離心，離心條件不變.1.2.6表達(dá)產(chǎn)物變性條件下的純化經(jīng)洗滌的包涵體以100g/L溶于緩沖液50l/LTrisHl，pH8.5,5l/L巰基乙醇,1l/LEDTA,8l/L尿素中,4攪拌過夜,12000g4離心30in,搜集上清,即為目的蛋白粗提液.SepharylS300凝膠柱為1.680,以工作液(8l/L尿素,50l/LTrisHl，pH8.5,1l/LEDTA，100l/LNal)充分平衡后,目的蛋白粗提液2L上柱,以工作液洗脫,流速1L/

12、in,分步搜集并測定蛋白質(zhì)含量,以SDSPAGE確定目的蛋白所在位置,搜集純度較高的洗脫組分.1.2.7表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性以工作液(50l/LTrisHl,1l/LEDTA，100l/LNal，pH8.5)充分平衡后,取SepharylS100凝膠(1.660)過濾目的蛋白樣品，用SepharylS300凝膠柱工作液調(diào)整蛋白樣品濃度為20g/L,用蛋白復(fù)性液(50l/LTrisHl,1l/LEDTA,100l/LNal,1.25l/LGSH,0.25l/LGSSG,pH8.5)洗脫，流速0.5L/in,分部搜集,測定蛋白質(zhì)含量,SDSPAGE確定目的蛋白所在位置,搜集純度較高的洗脫組分,目的蛋白洗

13、脫峰直接對水透析，4，24h，其中換液3次.透析后樣品于4，12000g/in離心30in，凍干上清，搜集樣品.HPL檢測蛋白純度.1.2.8表達(dá)產(chǎn)物esternblt鑒定目的蛋白經(jīng)SDSPAGE轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,以10g/LBSA室溫封閉過夜后,用小鼠抗人R5Ab(11000稀釋)孵育膜,室溫3h，TBST洗膜310in,再以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體(11000稀釋)孵育膜,室溫3h;TBST洗膜3次,用DAB顯色液顯色510in,觀察結(jié)果.2結(jié)果2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)/rR5經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde和Sal酶切鑒定，得到的片段與預(yù)期大小相一致.質(zhì)粒測序結(jié)

14、果與理論設(shè)計完全一致圖1.2.2目的蛋白的表達(dá)在14ku處有明顯的新生條帶，和目的蛋白質(zhì)預(yù)測的分子質(zhì)量一致圖2，說明在大腸桿菌中這種重組蛋白質(zhì)的表達(dá)成功.薄層掃描顯示目的蛋白表達(dá)量為30%.圖1重組質(zhì)粒pET22b(+)/rR5酶切鑒定圖2目的蛋白在大腸桿菌BL21中的高效表達(dá)圖3SepharylS300凝膠過濾洗脫圖譜2.3工程菌的發(fā)酵及目的蛋白的純化經(jīng)工程菌發(fā)酵，收菌量約為40g/L.圖3中最頂峰為SepharylS300凝膠過濾目的蛋白質(zhì)所在峰.經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后,凝膠上除目的蛋白質(zhì)帶外不存在其他條帶,薄層掃描顯示目的蛋白質(zhì)純度達(dá)90%以上.圖4為SDSPAGE分析結(jié)果.圖4Sephar

15、ylS300凝膠過濾后洗脫峰SDSPAGE結(jié)果分析2.4目的蛋白的復(fù)性目的蛋白樣品經(jīng)SepharylS100凝膠柱復(fù)性后，SDSPAGE分析結(jié)果如圖5.圖5復(fù)性后rR5的SDSPAGE分析2.5esternblt鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的菌體和純化的蛋白在14ku處出現(xiàn)一明顯條帶，相對分子質(zhì)量與理論計算值相符合，而對照菌體未出現(xiàn)顯色帶圖6，說明該表達(dá)產(chǎn)物能與R5Ab特異性結(jié)合.3討論AIDS主要由HIV1病毒感染并在體內(nèi)快速繁殖，導(dǎo)致宿主白細(xì)胞的大量破壞所致.傳統(tǒng)的以HIV病毒為靶向的疫苗設(shè)計由于其高變異性致使治療以及預(yù)防AIDS均未獲得很好的效果.鑒于R5特定突變基因型具有抗HIV感染的才能，其功能的減

16、弱和缺失對機(jī)體并沒有太大的影響，多種影響R5表達(dá)或干擾R5功能活動的藥物,如應(yīng)用R5小分子拮抗劑、R5抗體、siRNA、反義RNA、核酸酶等，均可在一定程度上通過降低細(xì)胞外表R5數(shù)量進(jìn)而降低HIV進(jìn)入白細(xì)胞的速率.因此R5可作為一種可利用的新的靶點來進(jìn)展HIV疫苗設(shè)計和藥物開發(fā)5.圖6目的蛋白rR5的esternblt鑒定我們在設(shè)計R5自體蛋白分子的過程中，考慮到R5作為七次跨膜受體，在與HIV結(jié)合發(fā)揮輔助受體功能的過程中，胞外4個片段均發(fā)揮相應(yīng)的作用.應(yīng)用計算機(jī)對R5抗原表位進(jìn)展預(yù)測,發(fā)現(xiàn)抗原表位主要位于NTer和EL2,也是R5發(fā)揮輔助受體功能的兩個主要片段，但為使自體疫苗誘導(dǎo)的抗血清更好

17、地阻斷HIV與R5受體的結(jié)合，我們截取R5胞外4個片段用Linker連接，模擬R5受體膜外構(gòu)造用作自身抗原分子.實驗中，目的蛋白是以包涵體形式存在，包涵體的純化和復(fù)性一直是蛋白質(zhì)純化中的一個普遍性難題，由于R5是一個跨膜分子，因此對重組目的蛋白的純化和復(fù)性相比照擬困難，在嘗試了幾種蛋白質(zhì)純化和復(fù)性方法的根底上，總結(jié)了rR5的蛋白質(zhì)純化方案，即在確定目的蛋白質(zhì)以包涵體形式存在的根底上，首先挑選高表達(dá)的菌種，其次優(yōu)化表達(dá)條件和發(fā)酵工藝.采用溶菌酶和超聲雙重裂菌，對包涵體充分洗滌后，應(yīng)用適當(dāng)?shù)淖冃詣舛热芙獍w，選用適宜的凝膠孔徑，應(yīng)用凝膠柱層析成功地對蛋白質(zhì)進(jìn)展了純化和復(fù)性.此方法可以借鑒到分子

18、質(zhì)量相近的蛋白質(zhì)的純化和復(fù)性.應(yīng)用凝膠柱進(jìn)展重組蛋白的純化和復(fù)性，方法簡單實用，且經(jīng)濟(jì)費(fèi)用較低，為大規(guī)模消費(fèi)重組蛋白奠定了根底.在自體疫苗的構(gòu)建過程中，常常引入一些蛋白載體或特定多肽借以進(jìn)步抗原分子的免疫原性，來打破機(jī)體的免疫限制，誘導(dǎo)出特異的高滴度抗體.結(jié)合文獻(xiàn)和以往構(gòu)建疫苗抗原試驗的結(jié)果，我們擬在今后的實驗中應(yīng)用不同的蛋白載體耦聯(lián)rR5免疫動物，以進(jìn)步重組R5抗原分子的免疫原性.【參考文獻(xiàn)】1AthisnREJ,GslingFS.ultipleextraellulareleentsfR5andHIV1entry:DissiatinfrrespnsethekinesJ.Siene,1996，274:1924-1926.2AgraalL,VanHrnAZ,EdardA,etal.Speifiinhibi