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文檔簡(jiǎn)介
1、一、概述1、生物藥物生物藥物是指運(yùn)用生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等的研究成果,從生物體、生物組織、細(xì)胞、體液等,綜合利 用物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)和藥學(xué)等學(xué)科的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制 品。2、生物技術(shù)制藥采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造一些條件,借助某些微生物、植物或動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。3、生物技術(shù)藥物采用DNA重組技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)或其它生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)、治療性抗體或核酸類藥物。4、生物技術(shù)以生命科學(xué)為基礎(chǔ),利用生物體或生物組織、細(xì)胞及其組分的特性和功能,設(shè)計(jì)構(gòu)建具有預(yù)期性狀的 新物種或新品系,并與工程相結(jié)合,利用這樣的新物種品系進(jìn)行加工生產(chǎn),為社會(huì)提供商品和服
2、務(wù)的 一個(gè)綜合性技術(shù)體系。5、生物技術(shù)的內(nèi)容基因、細(xì)胞、酶、發(fā)酵、生化、蛋白質(zhì)、抗體、糖鏈工程和海洋生物技術(shù)。6、生物技術(shù)的相關(guān)學(xué)科生物學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)化學(xué)生物化學(xué)、無(wú)機(jī)、有機(jī)、分析、物理化學(xué)工程學(xué)化學(xué)工程、電子工程醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)學(xué)。7、生物技術(shù)的應(yīng)用1、醫(yī)藥利用基因治療人類疾病的技術(shù)取得了突破性進(jìn)展,原來(lái)用于治療單基因缺陷的遺傳病的治療技術(shù),現(xiàn)在已快速擴(kuò)展到癌癥、愛(ài)滋病、乙型肝炎、心血管病,此外,診斷試劑、酶試劑、動(dòng)植物醫(yī)藥產(chǎn)品、 核酸類藥物也取得了很大進(jìn)展。2、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的新品種,大幅度提高產(chǎn)量和質(zhì)量。3、食品氨基酸天冬氨酸、半胱氨酸,有機(jī)酸蘋果酸、酒石酸,做食品添加劑
3、,香料,葡萄糖,果糖,淀粉酶。4、工業(yè)農(nóng)藥、香料、飼料、工業(yè)酶、有機(jī)酶、皮革工業(yè)脫毛軟化、絲綢脫膠、加酶洗衣粉。5、環(huán)境凈化利用微生物或酶處理廢物和廢水。6、能源微生物發(fā)酵產(chǎn)甲烷一沼氣。二、生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史生物技術(shù)是人類對(duì)生物資源微生物、動(dòng)植物的利用、改造并為人類服務(wù)的技術(shù),它的發(fā)展已有幾千年的歷史,將其發(fā)展過(guò)程按技術(shù)特征可分為三個(gè)階段。1、傳統(tǒng)生物技術(shù)階段出現(xiàn)在公元前幾千年,直到 20世紀(jì)30年代,主要是釀造技術(shù),當(dāng)時(shí)人們只知道釀 造技術(shù),但不知道這些技術(shù)的內(nèi)在原因,1680年出現(xiàn)了顯微鏡,人們才知道有微生物的存在,1857年用實(shí)驗(yàn)方法證明了酒精發(fā)酵與酵母菌有關(guān),并最終確征為酶,到此才揭開(kāi)了
4、發(fā)酵現(xiàn)象的奧秘。該階段的產(chǎn)品:乳酸、酒精、丙酮、丁醇、檸檬酸、淀粉酶。該階段生產(chǎn)的特點(diǎn):過(guò)程簡(jiǎn)單,大多數(shù)屬于兼氣發(fā)酵或外表培養(yǎng),生產(chǎn)設(shè)備要求不高,產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,屬于初級(jí)代謝產(chǎn)物。2、近代生物技術(shù)階段 20世紀(jì)40年代,第二次世界大戰(zhàn)的爆發(fā),急需療效好、毒副作用小的抗細(xì)菌感染藥物,出現(xiàn)了青霉素,產(chǎn)量低,產(chǎn)品價(jià)格昂貴,隨著發(fā)酵新技術(shù)的出現(xiàn),又相繼發(fā)現(xiàn)了鏈霉素、紅霉素、金霉素等藥物。 該階段的主要產(chǎn)品:抗生素、維生素、管體、氨基酸;食品工業(yè)的工業(yè)酶制劑、食用氨基酸、酵母、啤酒;化工業(yè)的酒精、丙酮、丁醇、沼氣;農(nóng)林業(yè)的農(nóng)藥;環(huán)境保護(hù)業(yè)的生物治理污染。該階段生物技術(shù)的特點(diǎn):1、產(chǎn)品類型多,初級(jí)氨基酸
5、、酶、有機(jī)酸;次級(jí)抗生素;生物轉(zhuǎn)化管體。2、生物技術(shù)要求高,純種、無(wú)菌、通氣、產(chǎn)品質(zhì)量要求也高。3、生產(chǎn)設(shè)備規(guī)模大,500立方米,2000立方米。4、技術(shù)發(fā)展速度快,青霉素,200單位每毫升,8萬(wàn)單位每毫升,形成了交叉學(xué)科生化工程。3、現(xiàn)代生物技術(shù)標(biāo)志,1953年美國(guó)Watson和英國(guó)的Crick共同提出了 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),揭開(kāi)了生命科學(xué)劃時(shí)代的一頁(yè),此后,又相繼出現(xiàn)了一系列新發(fā)現(xiàn)和新進(jìn)展,遺傳中心法則,破譯遺傳密碼,基因重組,單克隆抗體,DNA測(cè)序。產(chǎn)品見(jiàn)表1-1。動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。該階段產(chǎn)品種類很多,胰島素、干擾素、生長(zhǎng)激素等。動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。該階段產(chǎn)品種類很多,胰島素、干擾素、
6、生長(zhǎng)激素等。該階段生物技術(shù)的內(nèi)容包括:1、重組DNA技術(shù)及其它轉(zhuǎn)基因技術(shù);2、細(xì)胞和原生質(zhì)體融合技術(shù);3、酶或細(xì)胞的固定化技術(shù);4、植物脫毒和快速繁殖技術(shù);5、動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù);6、動(dòng)物胚胎工程技術(shù);三、醫(yī)藥生物技術(shù)新進(jìn)展7、現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)高密度發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、新型發(fā)酵技術(shù);8、現(xiàn)代生物反應(yīng)工程和別離工程技術(shù);9、蛋白質(zhì)工程技術(shù);10、海洋生物技術(shù)。近10年是生物技術(shù)迅速發(fā)展的時(shí)期,主要有四個(gè)方面的進(jìn)展。1、基礎(chǔ)研究不斷深入重組DNA,新基因的克隆和基因表達(dá)調(diào)控的研究全面展開(kāi),分子生物學(xué)理論和技術(shù)兩大體系已基本完成, 生物學(xué)中的中心法則所表達(dá)的遺傳信息的轉(zhuǎn)移規(guī)律奠定了遺傳工程的理論基礎(chǔ),有關(guān)
7、基因表達(dá)的各種研究 結(jié)果又豐富和發(fā)展了中心法則, DNA測(cè)序,為對(duì)付不治之癥提供了可能性。人類基因組計(jì)劃的研究目標(biāo)就是要定位所有的基因和測(cè)定它們的核甘酸序列,人類基因組大約有10萬(wàn)個(gè)基因,30億個(gè)核甘酸對(duì),完成這項(xiàng)研究是一項(xiàng)空前浩大的工程,它的實(shí)施對(duì)人類了解自身和醫(yī)學(xué)發(fā)展有劃時(shí) 代的意義。與疾病相關(guān)的基因有約5000個(gè),一些重要的遺傳病基因已被別離并測(cè)序。3、新產(chǎn)品不斷出現(xiàn)自20世紀(jì)80年代以來(lái),僅美國(guó)、日本開(kāi)發(fā)的生物新技術(shù)新藥物便達(dá)200多種,大都是重組蛋白質(zhì)藥物和重組DNA藥物。世界范圍內(nèi),銷路最好的生物技術(shù)藥物,臨床應(yīng)用時(shí)間比較長(zhǎng),療效比較好,毒副作用比較小,干擾素, 抗病毒、抗癌,有種
8、屬特異性,動(dòng)物干擾素對(duì)人無(wú)效,最初收集大量血液,提取白血球再與誘導(dǎo)物作用來(lái) 生產(chǎn),現(xiàn)在用基因重組技術(shù)把干擾素基因插入大腸桿菌來(lái)生產(chǎn)。白介素與機(jī)體免疫功能有關(guān),白介素-2促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化增殖。乙型肝炎疫苗,預(yù)防乙肝。集落刺激因子,可減輕化療時(shí)副作用,可用于愛(ài)滋病、 白血病。腫瘤壞死因子,可損傷癌細(xì)胞。研制更新一代的藥物和更新的應(yīng)用方法,集落刺激因子和白介素 的基因構(gòu)建到酵母細(xì)胞中,使之產(chǎn)生融合蛋白質(zhì),藥效增強(qiáng)。生產(chǎn)方法從利用重組DNA的微生物生產(chǎn)轉(zhuǎn)向利用動(dòng)植物來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物,構(gòu)建新型多價(jià)活疫苗。3、新試劑、新技術(shù)不斷出現(xiàn)細(xì)胞工程及基因工程的應(yīng)用產(chǎn)生了新的醫(yī)療技術(shù)一細(xì)胞移植和基因治療。細(xì)胞移植
9、用于骨髓移植,治療白 血病、淋巴病,免疫缺陷,再生障礙性貧血及放療、化療后的腫瘤病人,基因治療目前仍在實(shí)驗(yàn)階段,可 用于遺傳病、癌癥、愛(ài)滋病的治療,心臟內(nèi)直接注入外來(lái)基因,兩三周長(zhǎng)出新血管,關(guān)鍵點(diǎn)是如何將有用 基因引入靶組織中,并使之在合適的地方、合適的時(shí)間表達(dá)合適量的活性多肽或蛋白質(zhì)。生物試劑的開(kāi)發(fā),單克隆抗體,專一性強(qiáng),由鼠源性轉(zhuǎn)向人源性,應(yīng)用:基礎(chǔ)研究,診斷,體內(nèi)顯像定位, 食品和環(huán)境檢測(cè),體內(nèi)治療和導(dǎo)向治療。工業(yè)上利用單抗進(jìn)行親和層析高效純化天然基因工程基因,單抗 可與放射性核素、酶、熒光素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,用于檢測(cè)和治療。病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和某些腫瘤的診斷, 免疫學(xué),激素、酶和環(huán)境污染
10、因子的檢測(cè),顯像定位,單抗與抗癌藥物偶合后,減少副作用,加大藥量。4、新型生物反應(yīng)器和新別離技術(shù)不斷出現(xiàn)傳統(tǒng):攪拌式生物反應(yīng)器改進(jìn):塑料袋、填充床、氣升式、流化床、固定床、袋式、膜式、中空纖維、固定化培養(yǎng)。攪拌形狀改進(jìn):漿式、棒式、船帆式、籠式通氣。1000升。四、我國(guó)的醫(yī)藥生物技術(shù)我國(guó)起步晚,20世紀(jì)80年代初,把生物技術(shù)定為科技和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要新領(lǐng)域之一,85年制定了生物技術(shù)發(fā)展政策,89年制定了 90-2000年和2020年發(fā)展綱要。20世紀(jì)70年代,起步時(shí)是固定化酶的研究,固定化細(xì)胞, 80年代初期,開(kāi)發(fā)研究乙型肝炎基因工程疫苗, 基因工程干擾素,國(guó)內(nèi)投入大量資金建立30個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域
11、國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,可生產(chǎn)活性多肽類藥物、干擾素、白介素、心鈉素等多種生物藥物。五、醫(yī)藥生物技術(shù)發(fā)展展望20世紀(jì)生物技術(shù)是科研階段,產(chǎn)業(yè)初期。21世紀(jì)將進(jìn)入大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化,研究成果轉(zhuǎn)變成產(chǎn)品。三大類藥物:生物、化學(xué)、中藥。發(fā)展比較迅速的醫(yī)藥生物技術(shù)有四個(gè)領(lǐng)域:1、利用新發(fā)現(xiàn)的人類基因,開(kāi)發(fā)新型藥劑完成人類基因組計(jì)劃會(huì)發(fā)現(xiàn)許多新基因,而且很多與疾病有關(guān)或直接參與疾病的形成,找到了目的基因一也就是需要修復(fù)的基因可以幫助我們利用基因工程來(lái)尋找新藥或基因治療的方法,21世紀(jì)50%-70%的新藥來(lái)自基因工程的研究。2、新型疫苗的研制疫苗在許多疾病的預(yù)防、治療中起著其他藥物無(wú)法代替的作用,現(xiàn)在正在進(jìn)行愛(ài)滋病及2
12、0多種基因型癌癥疫苗的研制,用于防治癌癥、愛(ài)滋病、關(guān)節(jié)炎、貧血、骨質(zhì)疏松、百日咳、乙肝等疾病。3、基因工程活性肽淋巴因子,生長(zhǎng)因子,激素,酶,都屬于活性多肽。由兩條以上肽鏈組成,很強(qiáng)的生物活性,常以微量存在于人體基因工程方法生產(chǎn)應(yīng)用:1在體外和離體研究中作為細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充劑2基礎(chǔ)研究對(duì)象3作為研究其他現(xiàn)象免疫的一種輔助劑4診斷劑5生物治療的研究開(kāi)發(fā) 腦啡肽、胃腸肽。4、其他疾病早期診斷,PCR單克隆抗體 轉(zhuǎn)基因材料 外源基因在植物中表達(dá),腦啡肽,干擾素,生長(zhǎng)激素,轉(zhuǎn)血 紅蛋白基因的煙草植物生產(chǎn)人造血漿。一、生物藥物的來(lái)源1、生物藥物的定義生物藥物是指運(yùn)用生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等的研究成果,從生物
13、體、生物組織、細(xì)胞、體液等,綜合利 用物理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、生物技術(shù)和藥學(xué)等學(xué)科的原理和方法制造的一類用于預(yù)防、治療和診斷的制 品。2、生物藥物的原料來(lái)源天然的生物材料:人體、動(dòng)植物、微生物和各種海洋生物。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,有目的人工制得的生物原料成為當(dāng)前生物制藥原料的重要來(lái)源,如用基因工程技術(shù)制得的微生物或細(xì)胞。生物藥物原料的選擇、預(yù)處理與保存方法。1、原料選擇原則 有效成分含量高,原料新鮮,來(lái)源豐富、易得,產(chǎn)地較近,原料中雜質(zhì)含量少,成本 低。2、預(yù)處理與保存 預(yù)處理:就地采集后去除結(jié)締組織、脂肪組織等不用的成分,將有用成分保鮮處 理,收集微生物原料時(shí),要及時(shí)將菌體與培養(yǎng)液分開(kāi),進(jìn)行保
14、鮮處理。保存方法:冷凍法,適用于所有生物原料,-40 C;有機(jī)溶劑脫水法,丙酮,適用于原料少、價(jià)值高,有機(jī)溶劑對(duì)原料生物活性無(wú)影響;防腐劑保鮮,常用乙醇、苯酚等,適用于液體原料,如發(fā)酵液、提取液。二、生物藥物的特性1、藥理學(xué)特性1、治療的針對(duì)性強(qiáng) 細(xì)胞色素c用于治療組織缺氧所引起的一系列疾病。2、藥理活性高 注射用的純ATP可以直接供給機(jī)體能量。3、毒副作用小、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂類等生物藥物本身就直接取自體內(nèi)。4、生理副作用時(shí)有發(fā)生 生物體之間的種屬差異或同種生物體之間的個(gè)體差異都很大,所以用藥時(shí)會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)。2、生產(chǎn)、制備中的特殊性1、原料中的有效物質(zhì)含量低激素、酶
15、在體內(nèi)含量極低。2、穩(wěn)定性差 生物藥物的分子結(jié)構(gòu)中具有特定的活性部位,該部位有嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu),一旦結(jié)構(gòu)破壞,生物活性也就隨著消失。酶,很多理化因素使其失活。3、易腐敗 生物藥物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,易染菌、腐敗。生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)低溫、無(wú)菌。4、注射用藥有特殊要求 生物藥物易被腸道中的酶所分解所以多采用注射給藥,注射藥比口服藥要求更 嚴(yán)格,均一性、安全性、穩(wěn)定性、有效性。理化性質(zhì)、檢驗(yàn)方法、劑型、劑量、處方、儲(chǔ)存方式。3、檢驗(yàn)上的特殊性由于生物藥物具有生理功能,因此生物藥物不僅要有理化檢驗(yàn)指標(biāo),更要有生物活性檢驗(yàn)指標(biāo)。第一節(jié)概述生物技術(shù)的核心是基因工程,基因工程技術(shù)最成功的成就是用于生物治療的新型生物藥物的研
16、制。之前, 許多在疾病診斷、治療和預(yù)防中有重要價(jià)值的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋 白、酶類、凝血因子等以及某些疫苗,由于材料來(lái)源困難或制造技術(shù)問(wèn)題而無(wú)法研制出產(chǎn)品,即使應(yīng)用 傳統(tǒng)技術(shù)從動(dòng)物器官中提取出來(lái),也因?yàn)樵靸r(jià)太高而使患者負(fù)擔(dān)不起。而應(yīng)用基因工程技術(shù)就可以從根本 上解決上述問(wèn)題,它的應(yīng)用使人們?cè)诮鉀Q癌癥、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等方面中取得明顯效果,它為上 述疾病的預(yù)防、治療和診斷提供了新型疫苗、新型藥物和新型診斷試劑。利用基因工程生產(chǎn)的藥物主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽:免疫性蛋白,各種抗原和單克隆抗體;細(xì)胞因子, 干擾素、白介素、生長(zhǎng)因子;激素,胰島素、生長(zhǎng)激素;酶類,尿
17、激酶、鏈激酶超氧化物歧化酶。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn):1、大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽,為臨床使用提供有效的保障;2、可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì),以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究,從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍;3、可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì);4、內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處,可通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除;5、可獲得新型化合物,擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源。第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程基因工程技術(shù)就是將重組對(duì)象的目的基因插入載體,拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞,構(gòu)建成工程菌,實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合,并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)?;?/p>
18、因工程藥物制造的主要程序是:目的基因的克?。粯?gòu)建DNA重組體;將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌;工程菌的發(fā)酵;外源基因表達(dá)產(chǎn)物的別離純化;產(chǎn)品的檢驗(yàn)等。通常將基因工程藥物的生產(chǎn)分為上游和下游技術(shù)。上游階段是研究開(kāi)發(fā)必不可少的基礎(chǔ),它主要是別離目 的基因,構(gòu)建工程菌,主要在實(shí)驗(yàn)室完成。下游階段是從工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)到產(chǎn)品的別離純化、質(zhì)量控 制,該階段是將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化。制備基因工程藥物的一般程序:獲得目的基因 組建重組質(zhì)粒 構(gòu)建基因工程菌培養(yǎng)工程菌 產(chǎn)物別離純化 除菌過(guò)濾 半成品檢定 成品檢定 包裝基因的表達(dá)系統(tǒng)有原核生物系統(tǒng)和真核生物生物系統(tǒng)。選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白
19、質(zhì)的功 能,其次是表達(dá)量的多少和別離純化的難易。下游下工技術(shù)主要包括工程菌大規(guī)模培養(yǎng)最正確參數(shù)確實(shí)定、新型生物反應(yīng)器的研制、高效別離介質(zhì)及裝 置的開(kāi)發(fā)、別離純化的優(yōu)化控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)、生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造、 電子電腦的優(yōu)化控制等。第三節(jié)目的基因的獲得對(duì)于原核生物,其基因總量不大,可以選用合適的限制性核酸內(nèi)切酶切下目的基因,而對(duì)于真核生物不能 進(jìn)行直接別離。真核細(xì)胞中基因總量較大,從染色體中直接別離純化目的基因極為困難,另外,真核基因 一般都有內(nèi)含子,如果以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng),即使別離出真核基因,由于原核細(xì)胞缺乏mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng),真核基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA也不
20、能被加工、拼接成為成熟的 mRNA ,因此不能直接克隆真核基因。 克隆真核基因常用的方法有逆轉(zhuǎn)錄法和和學(xué)合成法。一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先別離純化目的基因的mRNA,再反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ) DNA,然后進(jìn)行互補(bǔ) DNA的克隆表達(dá)。從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA,以其為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì) mRNA的互補(bǔ)DNA,再以互補(bǔ)DNA為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶或 DNA聚合酶作用下,最終合成編碼該蛋白質(zhì)的雙鏈DNA序列,該序列不含內(nèi)含子。1、mRNA的純化細(xì)胞內(nèi)含有三種 RNA, mRNA占RNA總量的2%-5%,相對(duì)分子量大小不一致,別離也有很大的困難,但是 mRNA的3末端常含有一多
21、聚腺甘酸組成的末端,長(zhǎng)達(dá) 20-250個(gè)腺甘酸,足以吸W于寡聚胸甘酸名千維素上,從而可以用親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA上另I離出來(lái),可得到純度較高的mRNA。2、互補(bǔ)DNA第一鏈的合成mRNA的3末端常含有一多聚腺甘酸序列,可用寡聚脫氧胸甘酸為引物,在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下,開(kāi)始互補(bǔ)DNA的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP,在反應(yīng)中以及反應(yīng)后可通過(guò)測(cè)定放射性標(biāo)記的dNTP摻入量,計(jì)算出互補(bǔ) DNA的合成效率,在凝膠電泳后,進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小,探 索最正確反應(yīng)條件。3、互補(bǔ)DNA第二條鏈的合成先用堿解或核酸酶酶解的方法除去互補(bǔ)DNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈,
22、然后以互補(bǔ)DNA第一鏈為模板合成第二鏈,并用核酸酶 S1專一性切除單鏈DNA。4、互補(bǔ)DNA克隆載體有兩種質(zhì)粒和噬菌體,根據(jù)重組后插入的互補(bǔ) DNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì),又 將載體分為表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體。互補(bǔ)DNA插入片段小于10千堿基對(duì),可選用質(zhì)粒載體,如大于10千堿基對(duì)則選用噬菌體作為載體。二、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以采用人工化學(xué)合成法合成,其先決條件是已知目的基因的核甘酸序列,或已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列,按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列。用化學(xué)方法合成目的基因不同部位的兩條鏈的寡核甘酸短片段,再退火成為兩端形成粘末端的DNA雙鏈片段,然后將這
23、些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火使連接成較長(zhǎng)的 DNA片段,再用連接酶連接成完整的基因。人工化學(xué)合成的限制:1、不能合成太長(zhǎng)的基因,50-60個(gè)堿基對(duì);2、人工合成堿基對(duì)時(shí),遺傳密碼的簡(jiǎn)并會(huì)為選擇密碼子帶來(lái)很大的困難;3、費(fèi)用較高。第四節(jié)基因表達(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程。進(jìn)行基因表達(dá),我們所關(guān)心的是目的 基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性,產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的別離純化。一、宿主細(xì)胞的選擇宿主細(xì)胞應(yīng)滿足以下要求:1、容易獲得較高濃度的細(xì)胞;2、能利用廉價(jià)易得的原料;3、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素;4、發(fā)熱量低,需氧低,適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài);5、容易進(jìn)行代謝調(diào)控
24、;6、容易進(jìn)行 DNA重組技術(shù)操作;7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高,產(chǎn)物容易提取。宿主細(xì)胞的種類及特點(diǎn) 宿主可分為兩大類: 原核細(xì)胞一大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、鏈霉菌; 真核細(xì)胞一酵母菌、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞。1、原核細(xì)胞1、大腸桿菌生長(zhǎng)迅速、對(duì)其研究比較深入,所以常用,特點(diǎn):表達(dá)基因工程產(chǎn)物的形式多種多樣,有細(xì)胞內(nèi)不溶性表 達(dá)包含體、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等,極少數(shù)還可以分泌到細(xì)胞外表達(dá)。限制:沒(méi)有信號(hào)肽,所以產(chǎn)品多為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物,提取時(shí)需破碎細(xì)胞,這樣細(xì)胞質(zhì)內(nèi)其他蛋白質(zhì)也釋放出來(lái), 造成提取困難,由于分泌力不足,真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體,表達(dá)產(chǎn)物必須在下游處理過(guò)程中經(jīng) 過(guò)變性和復(fù)性處理才
25、能恢復(fù)其生物活性。2、枯草芽抱桿菌分泌能力強(qiáng)可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中,不形成包含體,但該菌也不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化,另 外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶,會(huì)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行降解。3、鏈霉菌主要特點(diǎn):不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中,具有糖基化能力。2、真核細(xì)胞1、酵母特點(diǎn):是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核微生物,基因組小,僅為大腸桿菌的4倍,世代時(shí)間短,有單倍體、雙倍體兩種形式。繁殖迅速、可以廉價(jià)地大規(guī)模培養(yǎng),沒(méi)有毒性。能將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞 外,表達(dá)產(chǎn)物能糖基化。2、絲狀真菌特點(diǎn):有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力,能正確進(jìn)行翻譯后加工,而且糖基化方式與高等真核生物相似。
26、3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn):產(chǎn)物可分泌到胞外,細(xì)胞培養(yǎng)液成分完全可控制,使產(chǎn)物純化較容易,表達(dá)產(chǎn)物能糖基化,接近或 類似與天然產(chǎn)物;動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢,生產(chǎn)率低,培養(yǎng)條件苛刻,費(fèi)用高,培養(yǎng)液濃度較稀。綜上所述,目前使用最廣泛的宿主仍然是大腸桿菌和釀酒酵母。因?yàn)閷?duì)它們的遺傳背景研究得比較清楚, 建立了許多適合于它彳門的克隆載體和DNA導(dǎo)入方式,并且許多外源在這兩種宿主菌中得到表達(dá)成功。二、大腸桿菌中的基因表達(dá)1、載體根據(jù)真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn),表達(dá)載體應(yīng)具備以下條件:1、載體能夠獨(dú)立復(fù)制,有復(fù)制起點(diǎn),有嚴(yán)緊型和松弛型,嚴(yán)緊型伴隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制,在宿主細(xì)胞中拷貝少1-3;松弛型的復(fù)制可不依賴
27、與宿主細(xì)胞,在宿主細(xì)胞中拷貝多達(dá)3000個(gè)。2、應(yīng)有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記,利于外源基因的克隆、鑒定和篩選。3、應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子,能為達(dá)成桿菌的RNA聚合酶所識(shí)別。4、應(yīng)具有阻遏子,使啟動(dòng)子受到控制,只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。5、應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子,以便使 RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因,而不轉(zhuǎn)錄其他無(wú)關(guān)的基因,同時(shí)很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。6、所產(chǎn)生的mRNA必須有翻譯的其始信號(hào)。2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素外源基因在宿主中的表達(dá)受許多因素影響的,所以在建立表達(dá)體系時(shí)要綜合考慮各種因素的作用,建立一 個(gè)合適的表達(dá)體系,從而使外源基因得到最大的表達(dá)量,獲
28、得最多的表達(dá)產(chǎn)物。1、外源基因的拷貝數(shù)外源基因是克隆到載體上的,所以載體在宿主中的拷貝數(shù)就直接與外源基因的表達(dá)相關(guān),應(yīng)將外源基因克隆到高拷貝的質(zhì)粒載體上,這對(duì)于提高外源基因的總體表達(dá)水平非常有利。2、外源基因的表達(dá)效率啟動(dòng)子的強(qiáng)度一在轉(zhuǎn)錄水平上直接影響基因的表達(dá)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性、SD序列和起始ATG的間距、密碼子的組成等都會(huì)不同程度地影響外源基因的表達(dá)。3、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性表達(dá)的外源基因,其產(chǎn)物會(huì)受到宿主細(xì)胞內(nèi)降解該蛋白質(zhì)的酶的作用,使得實(shí)際產(chǎn)量很低??刹捎靡韵路?法來(lái)提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性:組建融合基因,產(chǎn)生融合蛋白;利用大腸桿菌的信號(hào)肽或某些真核多肽中自 身的信號(hào)肽,把真核基因產(chǎn)物運(yùn)
29、輸?shù)桨麧{周質(zhì)的空隙中,而使外源蛋白不易被酶降解;采用位點(diǎn)特異性突 變的方法,改變真核蛋白二硫鍵的位置,從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性;選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì) 胞。4、細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的大量表達(dá),必然會(huì)影響宿主細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝,有些產(chǎn)物對(duì)宿主還會(huì)有毒害作 用,將細(xì)胞殺死,為了減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷,同時(shí)還得提高外源基因的表達(dá)水平,可以采取當(dāng)宿主細(xì) 胞大量生長(zhǎng)時(shí),抑制外源基因的表達(dá)。即將細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段,使表達(dá)產(chǎn)物不會(huì) 影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng),當(dāng)宿主細(xì)胞的生物量到達(dá)飽和時(shí),再進(jìn)行基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)合成,以減低宿主細(xì)胞的 代謝負(fù)荷;另外,將宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒
30、的復(fù)制分開(kāi),當(dāng)宿主細(xì)胞迅速生長(zhǎng)時(shí),抑制重組質(zhì)粒的復(fù) 制,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)量累積到一定水平后,再誘導(dǎo)細(xì)胞中重組質(zhì)粒的復(fù)制,增加質(zhì)??截悢?shù)。5、工程菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)條件使外源基因大量表達(dá)。3、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式三種:融合蛋白、非融合蛋白、分泌型。1、融合蛋白融合蛋白的氨基端是原核序列,竣基端是真核序列,這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的。優(yōu)點(diǎn):基因操作簡(jiǎn)便、蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定、不易被細(xì)菌酶類所降解、容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。缺點(diǎn):只能做抗原作用,原核多肽序列可能會(huì)影響真核蛋白的免疫原性。可再切割成兩個(gè)多肽鏈。2、非融合蛋白表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成:細(xì)菌或噬菌體的啟
31、動(dòng)子一細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點(diǎn)一真核基因的起始 密碼子一結(jié)構(gòu)基因一終止密碼。要求核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列與翻譯起始密碼之間的距離要合適,稍有不適就 會(huì)影響表達(dá)效率。優(yōu)點(diǎn):能夠較好地保持原來(lái)的蛋白活性;缺點(diǎn):容易被蛋白酶破壞,氨基末端常常帶有甲硫氨酸,在人體內(nèi)用藥時(shí)可能會(huì)引起人體免疫反應(yīng)。3、分泌型將外源基因接到信號(hào)肽之后,使之在胞質(zhì)內(nèi)有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯,當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)后時(shí),被信號(hào)肽酶識(shí)別切割,從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。特點(diǎn):一些可被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中是穩(wěn)定的;由于有些蛋白質(zhì)能按一定的方式折疊, 所以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)無(wú)活性的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)時(shí)卻具有活
32、性;蛋白質(zhì)信號(hào)肽和編碼序列之間能被切割,因 而分泌后的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不含起始密碼所編碼的甲硫氨酸。產(chǎn)量不高,信號(hào)肽不被切割或不在特定位置上切 割。三、酵母中的基因表達(dá)1、載體酵母載體是可以攜帶外源基因在在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制,并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單 位。從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多,因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行的, 只有在最后階段在轉(zhuǎn)入酵母中。酵母載體有兩類:普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體。普通表達(dá)載體,只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成,特別是對(duì)其氮末端氨基酸是否 有增減并無(wú)嚴(yán)格要求。精確表達(dá)載體,要求在啟動(dòng)子或前導(dǎo)肽編碼序列的適
33、當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點(diǎn),以利于接入外源基因,并使它 在表達(dá)和加工后氮末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同,既無(wú)多余的氨基酸,也無(wú)缺失的氨基酸。2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素1、外源基因的拷貝數(shù)拷貝數(shù)要適當(dāng),高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體可使外源基因高效表達(dá),但會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)量的降低,單拷貝的質(zhì)粒 載體對(duì)細(xì)胞的最大生長(zhǎng)沒(méi)有影響,能到達(dá)較高效的表達(dá)。2、外源基因的表達(dá)效率與啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、終止序列有關(guān)。要使外源基因在酵母中表達(dá)必須將外源基因克隆到酵母軍表達(dá)載體 的啟動(dòng)子和終止子之間,構(gòu)成表達(dá)框架。分泌信號(hào)包括信號(hào)肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列,它幫助后 面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞,并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切
34、斷表達(dá)產(chǎn)物與前導(dǎo)肽之間的肽鍵,產(chǎn) 生正確的表達(dá)產(chǎn)物。終止序列保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)牟课唤K止和加上多聚腺甘酸尾巴,這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。3、外源蛋白的糖基化外源蛋白在分泌過(guò)程中發(fā)生糖基化。4、宿主菌株的影響宿主菌株應(yīng)具備以下要求:菌體生長(zhǎng)力強(qiáng);菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱;菌體性能穩(wěn)定;分泌能力強(qiáng)。 四、動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn):產(chǎn)物可分泌到細(xì)胞外,培養(yǎng)液成分可人工調(diào)控,產(chǎn)物純化比較容易,產(chǎn)物是糖基化 的,接近或類似于天然產(chǎn)物;但動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢,單位體積生產(chǎn)率低,培養(yǎng)條件苛刻,費(fèi)用高,培養(yǎng)液濃 度較小。第五節(jié) 基因工程菌的穩(wěn)定性基因工程菌在傳代過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)
35、定的現(xiàn)象,有分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,分裂不穩(wěn)定是指工程 菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象;質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上喪失或堿基重排、 缺失所致工程菌性能的改變。一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因常見(jiàn)的是分裂不穩(wěn)定,與兩個(gè)因素有關(guān):含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率;這兩種菌的比生長(zhǎng)速率差 異的大小。含低拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較大,增加工程菌中的質(zhì)??截悢?shù)能提高質(zhì) 粒的穩(wěn)定性。含高拷貝質(zhì)粒的工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率較低,但是大量外源質(zhì)粒的存在使含質(zhì)粒 菌的生長(zhǎng)速率明顯低于不含質(zhì)粒菌,而不含質(zhì)粒菌一旦產(chǎn)生,能較快地取代含質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢(shì)菌,因而 對(duì)這類菌進(jìn)一步提高質(zhì)???/p>
36、貝數(shù)反而會(huì)增加含質(zhì)粒菌的生長(zhǎng)負(fù)勢(shì)。質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法:將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋,均勻涂布于不含抗性標(biāo)記抗生素的平板培養(yǎng)基上,培養(yǎng)10-12小時(shí),然后隨機(jī)挑出100個(gè)菌落接種到含抗性標(biāo)記抗生素的平板上,培養(yǎng) 10-12小時(shí),統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出 的菌落數(shù),每一樣品應(yīng)取 3次重復(fù)的結(jié)果,計(jì)算出比值,該比值反映了質(zhì)粒的穩(wěn)定性。二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法采用兩階段法,第一階段先使菌體生長(zhǎng)至一定密度,第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。在培養(yǎng)基中加入選擇 性壓力如抗生素等,以抑制質(zhì)粒喪失菌的生長(zhǎng)。適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞揭部墒构こ叹L(zhǎng)速率具有優(yōu)勢(shì),調(diào)控溫 度、pH、培養(yǎng)基組分、溶解氧,通過(guò)間歇供氧和改變稀釋速率都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)
37、定性。第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程主要包括:1、通過(guò)搖瓶操作了解工程菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件,分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體細(xì)胞的影響;2、通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案以及順序。一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器中后,培養(yǎng)一段時(shí)間,然后間歇或連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基,使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)。為保持基 因工程菌生長(zhǎng)所需的良好環(huán)境,延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,獲得高密度菌體,通常把溶氧控制和補(bǔ)料措施結(jié)合起來(lái), 根據(jù)生長(zhǎng)規(guī)律來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率。2、連續(xù)培養(yǎng)將種子接入反應(yīng)器后,培養(yǎng)一段時(shí)間,到一定菌濃,開(kāi)動(dòng)蠕動(dòng)泵,同時(shí)進(jìn)料和出料,控制一定稀釋速率, 由于基因工程菌不穩(wěn)定,可將生長(zhǎng)階段和基因表達(dá)
38、階段分開(kāi),進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng),關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘 導(dǎo)水平、稀釋率、細(xì)胞比生長(zhǎng)速率。3、透析培養(yǎng)利用膜的半透性使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基別離,通過(guò)去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其對(duì)生產(chǎn)菌的不利影響。4、固定化培養(yǎng)基因工程菌固定化后,質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高。便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng),特別是對(duì)于分泌型菌更為有利。二、基因工程菌的發(fā)酵工藝基因工程菌培養(yǎng)目的是為了使外源基因大量表達(dá),盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的污染,外源基因的高效表達(dá),不僅涉及宿主、載體和克隆基因之間的相互關(guān)系,而且也其所處的環(huán)境也密切相關(guān)。不同的發(fā)酵條件,代謝途徑也不相同,對(duì)下游的純化工藝就會(huì)造成不同的影響。1、培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生
39、長(zhǎng)速率,又要保持重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性,使外源基因能夠高效表達(dá)。使用不同的碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)有較大的影響,如葡萄糖做碳源菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多,甘油做碳源菌體得率較大。酪蛋白水解物做氮源有利于產(chǎn)物的合成與分泌。無(wú)機(jī)磷在許多初級(jí)代謝的酶促反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子,在低磷濃度下,盡管最大菌濃較低,但產(chǎn)物產(chǎn)率和產(chǎn)物濃度都較高。啟動(dòng)子只有在低磷酸鹽時(shí)才被啟動(dòng)。2、接種量的影響接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期,量小,延長(zhǎng)菌體延遲期,不利于外源基因的表達(dá);量大,有利 于對(duì)基質(zhì)的利用,可以縮短生長(zhǎng)延遲期,并使產(chǎn)生菌能迅速占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境,減少污染時(shí)機(jī),但會(huì)使菌 體生長(zhǎng)過(guò)快,代謝產(chǎn)物累積過(guò)多,反而會(huì)抑制后
40、期菌體的生長(zhǎng)。3、溫度的影響溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子的合成上。復(fù)制,可通過(guò)控制復(fù)制來(lái)改變基因拷貝數(shù),影響基因的表達(dá);轉(zhuǎn)錄,可通過(guò)影響RNA聚合酶的作用或修飾 RNA聚合酶,來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。酶促反應(yīng)。4、溶解氧的影響菌體在大量擴(kuò)增過(guò)程中,進(jìn)行耗氧的氧化分解代謝,采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法可以改善培養(yǎng)過(guò)程中的氧供給,提高活菌產(chǎn)量。在發(fā)酵前期采用較低轉(zhuǎn)速,即可滿足菌體生長(zhǎng),在培養(yǎng)后期,提高攪拌轉(zhuǎn)速才能滿足菌體繼續(xù)生長(zhǎng)的要求。這樣既節(jié)約能源又可滿足各個(gè)不同階段菌體生長(zhǎng)的要求。5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)期后期升溫誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞快速繁殖,直
41、到細(xì)胞密度到達(dá)109個(gè)每毫升為止,這時(shí)菌群數(shù)目倍增,對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧的需求量急增,營(yíng)養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。6、pH的影響兩階段培養(yǎng)工藝,培養(yǎng)前期著重于優(yōu)化工程菌的最正確生長(zhǎng)條件,培養(yǎng)后期著重于優(yōu)化外源基因的表達(dá),生長(zhǎng)最正確期 pH6.8-7.4,外源蛋白表達(dá)時(shí) pH 6.0-6.5。第九節(jié)基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程藥物的特點(diǎn):用活細(xì)胞作為表達(dá)體系,所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對(duì)分子量較大,并有復(fù)雜的結(jié) 構(gòu),許多藥物是參與一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì),所以任何藥物在性質(zhì)或劑量上的偏差,都可 能造成嚴(yán)重的后果,從原料開(kāi)始每一步都要進(jìn)行嚴(yán)格的控制。一、原料的質(zhì)量控制原料的質(zhì)量控制是為了保
42、證編碼藥品的DNA序列的正確性,以及產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。根據(jù)質(zhì)量控制的要求,應(yīng)了解以下特征:目的基因的來(lái)源、克隆的經(jīng)過(guò)、并用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核 甘酸序列等予以確證、應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組分復(fù)制子、啟動(dòng)子的來(lái)源與 功能、構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜、抗生素抗性標(biāo)志物、提供宿主細(xì)胞的名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié) 果及其生物學(xué)特性,需闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài),如是否整合到染色體上 及在其中的拷貝數(shù),并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后遺傳穩(wěn)定性,提供插入基因與表達(dá)載體倆側(cè)端控制區(qū)內(nèi) 的核甘酸序列,詳細(xì)表達(dá)在生產(chǎn)過(guò)程中,啟動(dòng)與控制克隆基因在宿主細(xì)胞表達(dá)的方
43、法與水平等。二、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制儲(chǔ)存中,要求種子克隆純而穩(wěn)定;培養(yǎng)中,工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定,始終無(wú)突變;在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中,表 達(dá)穩(wěn)定;始終能排除外源微生物的污染。生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng),并證明種子批不含致癌因子,無(wú)細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染,并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)。原始種子批需確證克隆基因DNA序列,詳細(xì)表達(dá)種子批來(lái)源、方式、保存以預(yù)計(jì)使用期,保存與復(fù)蘇的方法和材料,并控制微生物污染;提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性 數(shù)據(jù),依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性,確定在高允許傳代數(shù);培養(yǎng)過(guò)程中,應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整 性及宿主細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)后的基因型特征;依宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與
44、產(chǎn)品恒定性,規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間,并定期評(píng)價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。三、純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù),確證提純分子批間保持一致性;外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)都在規(guī)定的限度以下。在精制過(guò)程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)。四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制藥物質(zhì)量控制包括以下要求:產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致性。利用多學(xué)科的技術(shù)生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)。1、產(chǎn)品的鑒別肽圖分析:用酶法和化學(xué)方法降解目的蛋白,對(duì)生成的肽段進(jìn)行別離分析,檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化的最有效方法。靈敏、高效。高效液相色譜和毛細(xì)管電
45、泳。氨基酸成分分析:小于 50個(gè)氨基酸分析結(jié)果較可靠。部分氨基酸序列分析:氨基端15個(gè)氨基酸。重組蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定和相對(duì)分子量測(cè)定:濃度,凱氏定氮法、雙縮月尿法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外光譜法。分子量,凝膠過(guò)濾法完整和 SDS-PAG法亞基。蛋白質(zhì)二硫鍵分析:維持蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的重要共價(jià)鍵。2、純度分析包括目的蛋白質(zhì)含量測(cè)定和雜質(zhì)限量分析。1、目的蛋白,根據(jù)理化性質(zhì)和生物學(xué)特性。常用復(fù)原性及非復(fù)原性SDS等電聚焦、各種高效液相、毛細(xì)管電泳等。應(yīng)用兩種以上方法。2雜質(zhì),包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。蛋白類,宿主細(xì)胞蛋白,采用免疫方法和電泳相結(jié)合;非蛋白類, 病毒、細(xì)菌等微生物、熱源質(zhì)、內(nèi)毒素
46、、致敏原及DNA。利用微生物學(xué)方法檢測(cè)無(wú)菌。熱源質(zhì)檢測(cè)用家兔注射。3、生物活性測(cè)定10 需要?jiǎng)游矬w內(nèi)實(shí)驗(yàn)和通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體外效價(jià)測(cè)定。重組蛋白質(zhì)是一種抗原,可用放射免疫分析法或酶 標(biāo)法測(cè)定其免疫學(xué)活性。體內(nèi)生物學(xué)活性的測(cè)定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué)模型,體 外生物活性測(cè)定有細(xì)胞計(jì)數(shù)法等。4、穩(wěn)定性考察是評(píng)價(jià)藥品要效性按安全性的重要指標(biāo),也是確定藥品儲(chǔ)藏條件和使用期限的主要依據(jù)。對(duì)溫度、氧化、 光照、離子濃度和機(jī)械剪切等環(huán)境因素都很敏感。5、產(chǎn)品一致性的保證生產(chǎn)周期長(zhǎng),影響因素多,必須對(duì)每一步都進(jìn)行嚴(yán)格的控制。五、產(chǎn)品的保存目的產(chǎn)物受多種因素的影響而失活,保存時(shí)要防止變性、降解
47、、保護(hù)活性中心。1、液態(tài)保存低溫保存:對(duì)熱敏感。在穩(wěn)定pH條件下保存:防止變性。高濃度保存:高濃度時(shí)比較穩(wěn)定。加保護(hù)劑保存:糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑等。有些需要加鹽,加2-疏基乙醇在真空或惰性氣體中保存。2、固體保存固體蛋白質(zhì)比液體穩(wěn)定,在室溫或冰箱中保存比較穩(wěn)定,長(zhǎng)期保存最好制成干粉或結(jié)晶。六、基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用1、提高抗生素產(chǎn)量工業(yè)使用的抗生素產(chǎn)生菌都是通過(guò)物理或化學(xué)方法誘變后得到的,如果利用基因工程技術(shù)有目的地定向改 造基因,提高基因的表達(dá)水平以改造菌種的生產(chǎn)能力效果會(huì)更好。可進(jìn)行以下幾方面的工作。1、將產(chǎn)生菌基因隨即克隆到原株直接篩選高產(chǎn)菌在克隆菌株中,增加某
48、一與產(chǎn)量有關(guān)的基因劑量,使產(chǎn)量得到提高。2、增加參與生物合成限速階段基因的拷貝數(shù)抗生素生物合成途徑中的某個(gè)階段可能是整個(gè)合成中的限速階段,識(shí)別位于合成途徑中的限速瓶頸,并設(shè) 法導(dǎo)入能提高這個(gè)階段酶系的基因拷貝數(shù),如果增加的中間產(chǎn)物不對(duì)合成途徑中某個(gè)步驟產(chǎn)生反饋抑制, 就有可能增加最終抗生素的產(chǎn)量。3、通過(guò)調(diào)節(jié)基因的作用調(diào)節(jié)基因的作用可增加或降低抗生素的產(chǎn)量,正調(diào)節(jié)基因可能通過(guò)一些正調(diào)控機(jī)制對(duì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行正向調(diào) 節(jié),加速抗生素的產(chǎn)生,負(fù)調(diào)節(jié)基因可能通過(guò)一些負(fù)調(diào)控機(jī)制對(duì)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié),降低抗生素的產(chǎn) 量,因此,增加正調(diào)節(jié)基因或降低副調(diào)節(jié)基因的作用,可增加抗生素的產(chǎn)量。4、增加抗性基因抗性基因
49、可通過(guò)其產(chǎn)物滅活胞內(nèi)或胞外的抗生素,保護(hù)自身免受所產(chǎn)生的抗生素的殺滅作用,有些抗性基 因的產(chǎn)物還直接參與抗生素的合成,抗性基因經(jīng)常和生物合成基因連鎖,而且它們的轉(zhuǎn)錄有可能也是緊密 相連的,是激活生物合成基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的必須成分??剐曰虮仨毷紫冗M(jìn)行轉(zhuǎn)錄,建立抗性后,生物合成 基因的轉(zhuǎn)錄才能進(jìn)行??股氐漠a(chǎn)生與菌種對(duì)其自身抗生素的抗性密切相關(guān)??股氐纳a(chǎn)水平是由抗生 素生物合成酶和對(duì)自身抗性的酶所共同確定,這就為通過(guò)提高菌種自身抗性水平來(lái)改進(jìn)菌種,提高抗生素 產(chǎn)量提供了依據(jù)。2、改善抗生素組分許多抗生素產(chǎn)生菌可產(chǎn)生多組分抗生素,由于這些組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似,而其生物活性有時(shí)卻相差很大,這
50、給有效組分的發(fā)酵、提取和精制帶來(lái)了很大不便。隨著對(duì)抗生素生物合成途徑和深入了解及基因重組技術(shù)的不斷發(fā)展,應(yīng)用基因工程技術(shù)可以定向地改造抗生素產(chǎn)生菌,獲得只產(chǎn)生有效組分的菌種。3、改進(jìn)抗生素生產(chǎn)工藝11 抗生素的合成一般對(duì)氧的供給較為敏感,不能大量供氧往往是高產(chǎn)發(fā)酵的限制因素。為了使細(xì)胞處于有氧 呼吸狀態(tài),傳統(tǒng)方法是:改變最適操作條件;降低細(xì)胞生長(zhǎng)速率;培養(yǎng)密度。提高供氧水平只能從設(shè)備和 操作角度考慮,提高溶氧水平或氣液傳質(zhì)系數(shù),提高發(fā)酵罐中無(wú)菌空氣的通入量,并采用各種攪拌裝置, 使空氣分散,滿足菌體生長(zhǎng)的要求。空氣的壓縮、冷卻或過(guò)濾、攪拌都要消耗大量的能源,結(jié)果并不理想。 進(jìn)入液相的氧分子需要
51、穿過(guò)幾層膜才能到達(dá)菌體,進(jìn)入菌體后,還要經(jīng)物理擴(kuò)散才能到達(dá)產(chǎn)生能量的呼吸 細(xì)胞器。如在菌體內(nèi)導(dǎo)入與氧有親和力的血紅蛋白,呼吸細(xì)胞就能容易的獲得足夠的氧,降低細(xì)胞對(duì)氧的 敏感程度,利用它改善發(fā)酵過(guò)程中溶氧的控制程度。利用基因重組技術(shù)克隆血紅蛋白基因到抗生素產(chǎn)生菌 中,在細(xì)胞中表達(dá)血紅蛋白,可以從提高細(xì)胞自身代謝功能入手解決溶氧供求矛盾。4、產(chǎn)生雜合抗生素不同抗生素合成基因重組;生物合成途徑中某個(gè)酶基因的突變;在生物合成途徑中引入一個(gè)酶基因;利用 底物特異性不強(qiáng)的酶催化形成新產(chǎn)物?;蚬こ炭贵w的類型有 1.人-鼠嵌合抗體;2.改形抗體;3.小分子抗體;4.雙功能抗體;5.抗體融合蛋白第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞
52、的形態(tài)和生理特點(diǎn)一、動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)動(dòng)物細(xì)胞屬于真核細(xì)胞,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,分化精確,不同細(xì)胞執(zhí)行不同的功能,例如神經(jīng)細(xì)胞具有很長(zhǎng)的分支, 很多的纖維,以便接受和傳遞刺激,紅細(xì)胞呈扁圓盤狀,增大其接觸面等。但細(xì)胞在離體培養(yǎng)時(shí)形態(tài)會(huì)發(fā) 生變化,根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩類:貼壁依賴型和貼壁非依賴型,或貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì) 胞。1、貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)必須要有給以貼附的支持物外表,細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該外表上生長(zhǎng)和繁殖,細(xì)胞在外表上生長(zhǎng)時(shí)有兩種形態(tài),成纖維樣細(xì)胞型和上皮樣細(xì)胞型。成纖維樣細(xì)胞型主要來(lái)源于中胚層組織細(xì)胞心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞成骨細(xì)胞等,上皮樣細(xì)胞型主要來(lái)源于 外胚層和
53、內(nèi)胚層組織細(xì)胞,皮膚細(xì)胞、腸管上皮細(xì)胞,在培養(yǎng)過(guò)程中,隨著培養(yǎng)條件的變化細(xì)胞形態(tài)也會(huì) 發(fā)生改變。2、懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)不依賴支持物外表,在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng),如淋巴細(xì)胞等。3、兼性貼壁細(xì)胞根據(jù)生長(zhǎng)條件的不同可貼壁也可懸浮生長(zhǎng),中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞。第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得一、要求最初要求生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞必須是原代細(xì)胞,以后放寬至二倍體細(xì)胞即可,即使是經(jīng)過(guò)多次傳代也可用,但是非二倍體細(xì)胞是絕對(duì)禁止使用的,因?yàn)閾?dān)憂異倍體細(xì)胞的核酸會(huì)影響到人的正常染色體,有致癌的危險(xiǎn),由于二倍體細(xì)胞傳代不會(huì)超過(guò) 50代,所以使用受到限制。后來(lái)發(fā)現(xiàn)異倍體也可使用,并未對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響, 并且可無(wú)限使用,對(duì)工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了極大的
54、方便。二、獲得原代細(xì)胞、已建立的二倍體細(xì)胞系及可無(wú)限傳代的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。1、原代細(xì)胞直接取自動(dòng)物組織、器官,經(jīng)過(guò)粉碎、消化后獲得的細(xì)胞懸液。需大量動(dòng)物,費(fèi)錢費(fèi)勞力。2、二倍體細(xì)胞原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選和克隆,從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。特點(diǎn):二倍體;有明顯的貼壁和接觸抑制特性;有限的增殖能力;無(wú)致瘤性。3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系12 通過(guò)轉(zhuǎn)化形成,變成了異倍體,有無(wú)限增殖能力。轉(zhuǎn)化可自發(fā),在傳代過(guò)程中自己轉(zhuǎn)變成可無(wú)限增殖的細(xì)胞;也可人為轉(zhuǎn)化,采用某些試劑處理,或從動(dòng)物的腫瘤組織中建立的細(xì)胞系。優(yōu)點(diǎn):無(wú)限傳代、倍增時(shí)間短、對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子的要求低,適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)
55、。三、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性WI-38 :人二倍體細(xì)胞系,成纖維細(xì)胞,能產(chǎn)生膠原,倍增時(shí)間為24小時(shí),有限壽命50代,用于制備疫苗。MRC-5:人二倍體細(xì)胞系,成纖維細(xì)胞,有限壽命 42-46代,用于制備疫苗。CHO-K1:從中國(guó)地鼠卵巢中別離的上皮樣細(xì)胞,用于構(gòu)建工程菌。BHK-21:從地鼠幼鼠的腎臟中別離。成纖維樣細(xì)胞,用于構(gòu)建工程菌,可生產(chǎn)疫苗。Vero:從非洲綠猴腎中別離,貼壁依賴的成纖維細(xì)胞,用于制備疫苗。Namalwa :從淋巴瘤病人別離,生產(chǎn)干擾素。SP20-Ag14:從抗羊紅細(xì)胞活性的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系融合獲得,生產(chǎn)單克隆抗體。四、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選生產(chǎn)中常采用融
56、合細(xì)胞或基因工程構(gòu)建的工程菌1、真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建常用病毒或質(zhì)粒載體, 用桿狀病毒作載體的優(yōu)點(diǎn):該病毒基因是雙鏈的容易進(jìn)行重組;插入7-8千堿基對(duì)不影響正常病毒的形成;可用外源基因更換部分病毒基因,仍具有感染力;有很強(qiáng)的啟動(dòng)子;用光學(xué)顯微鏡可見(jiàn),容易挑選陽(yáng)性克??;可直接表達(dá)外源基因。構(gòu)建穿梭質(zhì)粒載體的基本成分:允許載體在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列;含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控元件;能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記;有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。2、基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞的篩選融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法。最常用磷酸鈣沉淀和電穿孔法。磷酸鈣沉淀法,將溶解的 DNA加在磷酸氫
57、二鈉溶液中,再逐漸加入氯化鈣溶液,當(dāng)磷酸氫二鈉和氯化鈣形成磷酸鈣沉淀時(shí),DNA被包裹在當(dāng)中,形成 DNA磷酸鈣共沉淀。當(dāng)沉淀物與細(xì)胞外表接觸時(shí),通過(guò)細(xì)胞吞噬作用將DNA導(dǎo)入其中。優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單、可進(jìn)行共轉(zhuǎn)化,可將不含選擇性標(biāo)記的DNA和含選擇性標(biāo)記的DNA放在一起進(jìn)行形成混合的共沉淀物,一起導(dǎo)入細(xì)胞。電穿孔法,借助電穿孔儀產(chǎn)生的高壓脈沖電場(chǎng),使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)可逆性的小孔,外源DNA即可進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化效率較高,但進(jìn)入的 DNA拷貝數(shù)較低。依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇性標(biāo)記采用相應(yīng)的篩選系統(tǒng):HAT、GPT G418、MTX篩選相應(yīng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞;對(duì)選出的細(xì)胞要進(jìn)行克隆和亞克隆使其純化。五、細(xì)胞庫(kù)的建立除原代
58、細(xì)胞外,其他細(xì)胞株、細(xì)胞系,包括二倍體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、融合細(xì)胞和工程細(xì)胞都需建立細(xì)胞庫(kù)保存。用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù),原始細(xì)胞庫(kù)和生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)。原始細(xì)胞庫(kù)應(yīng)有詳細(xì)檔案:1、該細(xì)胞系的歷史:來(lái)源、動(dòng)物的年齡和性別、細(xì)胞別離的方法和所用的培養(yǎng)材料。2、該細(xì)胞的特性:形態(tài)、生長(zhǎng)特性。3、對(duì)各種有害因子的檢查結(jié)果,細(xì)菌、真菌、支原體和各種病毒。生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞來(lái)源與原始細(xì)胞庫(kù),然后經(jīng)擴(kuò)增達(dá)一定數(shù)量后,再分裝形成細(xì)胞庫(kù)。第四節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基一、動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)所需條件1、所有的與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對(duì)無(wú)菌,防止污染;2、必須有足夠的營(yíng)養(yǎng)保證,絕對(duì)不可有有害的物質(zhì)
59、,防止有害離子;3、保證有食量的氧氣供給;4、需隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中的有害產(chǎn)物;5、有良好的適于生存的外界環(huán)境,滲透壓、離子濃度和酸度;6、及時(shí)分種,保持合適的細(xì)胞密度。二、動(dòng)物培養(yǎng)基的種類和組成天然、合成和無(wú)血清培養(yǎng)基。131、天然培養(yǎng)基:血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。2、合成培養(yǎng)基:組成穩(wěn)定可、大量生產(chǎn)供給。成分為氨基酸細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料、維生素維持細(xì)胞生命活動(dòng)的低分子活性物質(zhì),形成酶的輔基或輔酶、糖類碳源、無(wú)機(jī)鹽保持細(xì)胞的滲透壓并參與代謝、其他前體和氧化復(fù)原劑。合成培養(yǎng)基中除了各種營(yíng)養(yǎng)成分外,還需添加5%-10%的小牛血清。3、無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基在天然或合成培養(yǎng)基的
60、基礎(chǔ)上添加激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素。無(wú)血清培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn):提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性,防止了血清差異所帶來(lái)的細(xì)胞差異;減少了由血清帶來(lái) 的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn);供給充足、穩(wěn)定;細(xì)胞產(chǎn)品易于純化;防止了血清中某些因 素對(duì)有些細(xì)胞的毒性;減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾,便于結(jié)果分析。添加小牛血清的作用:1、提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的各種生長(zhǎng)因子和激素;2、提供有利于細(xì)胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子; 3、提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白;4、提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的脂肪酸和微量元素。第五節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式和操作方式一、動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法根據(jù)
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