肝癌干細(xì)胞差異表達(dá)miRNA的篩選及鑒定

1、肝癌干細(xì)胞差異表達(dá) miRNA的篩選及鑒定Screen and identification of differentially expressed miRNAs in liver cancer stem cells and oval cells ZHOU Guang-jun ，SHI Kun，ZHAWen-zhang，MUXiang-ming. The Fist Peoples Hospital of Yancheng City, Yancheng 224000,China【】 Objective To determine differentially expressed miRNAs of

2、 liver cancer stem cells and oval cells.Methods Liver cancer stem cells and oval cells were isolated from the livers of human cancer patients. The difference in miRNAsexpression between liver cancer stem cells and oval cells was detected by both microarrays and Northern blot.Results Forteen miRNAsin

3、 liver cancer stem cells were expressed 1.5 fold above the levels in oval cells, three miRNAs in liver cancer stem cells were expressed 1.5 fold below the levels in oval cells. The expression of six selected miRNAswas further validated by Northern blot and three were confirmed.Conclusion The express

4、ion of a number of miRNAs in liver cancer stem cells and oval cells may suggest the potential roles of these miRNAs and applicability as diagnostic and prognostic signatures in liver cancer.腫瘤干細(xì)胞( tumor stem cells,TSC )是近年來實(shí)體腫瘤 研究的熱點(diǎn)， 對實(shí)體瘤認(rèn)識產(chǎn)生了重大影響。 肝癌、腦惡性腫瘤、 乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了TSC并且其表面標(biāo)記特征與生長特征等也得到一

5、定闡述1。TSC具備高度增殖能 力與自我更新能力， 也具備多向分化的潛能， 是一種特殊類型的 干細(xì)胞。TSC通過不均一分裂，一個(gè)TSC分裂形成一個(gè)新的TSC 和另一個(gè)可最終分化為包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞的子細(xì)胞， 其結(jié)果是維持TSC數(shù)目穩(wěn)定并產(chǎn)生腫瘤。TSC的特性包括極強(qiáng)的 致瘤能力與自我更新并多向分化， 并且有高耐藥的特征。 目前認(rèn) 為，TSC來源于正常成體干細(xì)胞1 o肝癌是TSC研究的熱點(diǎn)之一。肝癌也越來越被設(shè)想為一種干 細(xì)胞疾病。近年來，本課題組人員從大鼠肝癌中分離、培養(yǎng)并純 化出一些有干細(xì)胞特性的細(xì)胞， 有強(qiáng)的致瘤能力，與TSC比較接 近，并且對這些細(xì)胞的增殖能力，轉(zhuǎn)移能力，細(xì)胞生長

6、特征，細(xì) 胞周期分析等生物學(xué)特征也進(jìn)行了初步的研究24o人們稱肝癌中的TSC為肝癌干細(xì)胞。隨著miRNA研究的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)某些miRNA在干細(xì)胞的自 我更新的維持和哺乳動(dòng)物早期發(fā)育起關(guān)鍵作用5。本文采用miRNAs芯片技術(shù)和Northern印跡，篩選并鑒定肝癌干細(xì)胞中差 異表達(dá)miRNA可望為肝癌的基因治療提供全新的靶標(biāo)和策略，為肝癌的發(fā)病機(jī)制和診斷治療研究提供了新的思路。1 材料與方法1.1材料MEM培養(yǎng)基購自Hyclone ,胰酶購自Sigma,胎牛 血清為杭州四季青公司產(chǎn)品， 瓊脂糖購自北京邦定生物公司， 甲 醛購自北京化工廠，美國臺盼藍(lán)染液購自華美生物工程 XX公司， OV6 CKI

7、9、自蛋白和甲胎蛋白抗體來自武漢博士德公司。硝酸 纖維素膜購自 Millipore 公司。實(shí)驗(yàn)方法和步驟1.2.1 肝癌手術(shù)標(biāo)本選取 取 3例肝癌患者手術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)。卵圓細(xì)胞培養(yǎng)、 分離與鑒定 取標(biāo)本中肝臟正常組織，組織塊法分離、培養(yǎng)大鼠卵圓細(xì)胞。鑒定方法：（1）測定細(xì)胞的大小及形態(tài)學(xué)觀察；（ 2）免疫細(xì)胞熒光鑒定，抗體包括 OV6、 CKI9、自蛋白和甲胎蛋白等。肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)、分離與鑒定 取處于對數(shù)生 長期的肝癌細(xì)胞，有限稀釋法單克隆分離、培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞；裸 鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其成瘤能力后， 觀察高成瘤能力， 有分化能力的 腫瘤細(xì)胞即為肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。測量肝癌干細(xì)胞及卵圓細(xì)胞 m

8、icroRNA 表達(dá)譜并進(jìn)行驗(yàn)證 取上面培養(yǎng)中的肝癌干細(xì)胞及卵圓細(xì)胞，利用microRNA芯片比較兩種細(xì)胞表達(dá)microRNA差異情況。microRNA芯片采用博 奧生物XX公司的產(chǎn)品，該芯片含人類 238個(gè)microRNA,包括目 前已經(jīng)研究成熟的絕大部分 microRNA。根據(jù)不同個(gè)體表達(dá) microRNA差異情況，找出肝癌干細(xì)胞相對穩(wěn)定表達(dá)的特征 microRNA,如果篩選后特征 microRNA仍然較多，適當(dāng)增加樣本 量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 Northern blot 進(jìn)一步驗(yàn)證特征 microRNA。125 Northern印跡1.75%瓊脂糖煮沸溶解，冷卻到60 C, 加7 ml 10 x

9、MSE緩沖液、11.5 ml甲醛，加水定容至 70 ml，混 勻后倒入盛膠槽。等膠凝固后,去掉梳子和膠布,將盛膠槽放入1X MSE緩沖液的電泳槽。使 RNA變性，RNA4.5 ml, 10 x MSE緩 沖液20 ml、甲醛3.5 ml，去離子甲酰胺10 ml。55 C加熱15 min, 冰浴冷卻。加2 ml 5 x載樣緩沖液，上樣，同時(shí)加RNA標(biāo)記物。60伏電泳過夜。取出凝膠，水中浸泡2次，每次5 min。室溫下將膠浸到 50 mmol/L NaOH 和 10 mmol/L NaCl 中 45 min，水解 高分子RNA以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。室溫下將膠浸到 0.1 mmol/L Tris HCl(pH

10、7.5)中 45 min,使膠中和。20 x SSC洗膠 1 h。20 x SSC中 過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。取出硝酸纖維素膜，80 C真空烘烤2 h。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各分組所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x s)表示，用 Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)，兩組 間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) a 0.05。2 結(jié)果2.1 RNA 提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果 Trizol 一步法提取細(xì)胞中的 總RNA通過異丙醇沉淀法濃縮 RNA用分光光度計(jì)定量，樣品總RNA的OD260/OD280直在1.82.0之間。甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶清晰，28S： 18S RNA條帶亮度接近2 : 1,RNA 完好無降

11、解，質(zhì)量符合miRNAs芯片的質(zhì)量要求（見表1）。表1 RNA濃度和純度測定2.2肝癌干細(xì)胞和卵圓細(xì)胞差異表達(dá)miRNAs芯片數(shù)據(jù)分析提取卵圓細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的總RNA利用microRNA芯片比較兩種細(xì)胞表達(dá)miRNA差異情況。此芯片共包括人類238個(gè)microRNA,包括目前已經(jīng)研究成熟的絕大部分microRNA。根據(jù)數(shù)據(jù)中上下調(diào) 1.5 倍篩選得到肝癌干細(xì)胞較卵圓細(xì)胞表達(dá)上調(diào) 的miRNA共有14個(gè)，下調(diào)的 miRNA有3個(gè)，最高表達(dá)變化達(dá) 7 倍。表達(dá)差異顯著的 miRNA共有17個(gè)。具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的 17種miRNA中，has-miR Plus 屬于尚未被 miRBase數(shù)據(jù)庫所記

12、 錄，暫不列入研究范圍；SV40-miR及hsv1-miR為病毒性miRNA也不列入研究范圍。2.3 Northern 分析為了排除由于miRNA在芯片雜交前進(jìn)行 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所造成的假陽性，筆者選擇了 6個(gè)miRNAs進(jìn)行Northern 雜交給予驗(yàn)證。包括 5 個(gè)高表達(dá)的 miRNAs：miR-520h、 hsa-miR-199a-3p 、hsa-miR-122 、miR-365、hsa-let-7f-2*和 1個(gè)低表達(dá)的miRNA miR-129。結(jié)果表明，與卵圓細(xì)胞相比較， 肝癌干細(xì)胞中 hsa-let-7f-2 表達(dá)升高約 5倍, hsa-miR-199a-3p 、 hsa-miR-12

13、2 表達(dá)升高約 6倍,與芯片結(jié)果符合率為 50%（圖 1）。 其中 hsa-let-7f-2 被證明與干細(xì)胞關(guān)系密切, hsa-miR-122、 hsa-miR-199a-3p 與肝癌關(guān)系密切。注：采用 Northern 印跡技術(shù)對芯片篩選出的表達(dá)有顯著差異的 miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) hsa-let-7f-2(a)、hsa-miR-199a-3p(b)、hsa-miR-122 (c)在肝癌干細(xì)胞中的表達(dá)較卵圓細(xì)胞明 顯升高，*P : 68。但微小RNA在肝癌干細(xì)胞中的作用尚無 報(bào)道。作為機(jī)體內(nèi)源性 RNA miRNA很艮可能在肝癌起到重要的調(diào) 控作用。在研究中，人們對人 ESC細(xì)胞中的36種

14、miRNA進(jìn)行了 文庫性的克隆，之后研究了這些 miRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其 中一些miRNA會在ESC細(xì)胞中特異性出現(xiàn)，其基因表達(dá)量在細(xì)胞 發(fā)育的過程中會逐漸下降。這些結(jié)果表明了，miRNA對于哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞的發(fā)育起到了至關(guān)重要的作用。 此外，之前的研究 還發(fā)現(xiàn)這些miRNA具有高度的保守型9o對于干細(xì)胞的自我 更新和未分化狀態(tài)的維持具有重要意義， 可作為胚胎發(fā)育早期和 未分化干細(xì)胞的分子標(biāo)記物。miRNAs對干細(xì)胞的繼續(xù)分化增殖 也具有顯著的調(diào)節(jié)作用。在干細(xì)胞分化發(fā)育的過程中，miRNA的表達(dá)會出現(xiàn)變化， 而這種變化可以下調(diào)細(xì)胞內(nèi)阻止干細(xì)胞分化的 基因，此外，miRNA還可以激活一些特定的基因，這些基因可以 決定干細(xì)胞發(fā)育后的分化方向10。另外，miRNAs也可以起 到癌基因或調(diào)節(jié)癌基因表達(dá)的作用。miRNAs控制了細(xì)胞的生長、 分化和凋亡，因此，這些 miRNAs表達(dá)的失調(diào)與腫瘤發(fā)生有關(guān) 11 13。本研究采用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌干