瓊脂稀釋法測定抗菌藥物最低抑菌濃度MIC資料全

1、瓊脂稀釋法測定抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)|瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50笆左右的定量MH瓊脂中，制成含 不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長的 瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優(yōu)點是可在一個平板上同時作多株菌MIC測定，結(jié) 果可靠，易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點是制備含藥瓊脂平板費時費力。培養(yǎng)基制備使用MH瓊脂，按商品說明書進(jìn)行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎(chǔ)加1%添加 劑；其它鏈球菌使用含5% (V/V)綿羊血的MH瓊脂(當(dāng)試驗磺胺藥時，使用溶解的馬血)。含藥瓊脂平板制備根據(jù)實驗設(shè)計，將已倍比稀釋的不同

2、濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解，并在4550笆水 浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度34mm。通常按1：9比例配制藥 物瓊脂平板，根據(jù)需要來選擇藥物濃度圍。配制好的含藥瓊脂平板應(yīng)裝入密封塑料袋中，置 28笆冰箱可貯存5天。接種物制備與接種制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液，再1： 10稀釋，以多點接種器吸取制備好菌 液(約12ul)接種于瓊脂平板表面，每點菌數(shù)約為104CFU，形成直徑為58mm的菌斑。 接種好后置35笆孵育1620h (甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬古霉素耐藥腸球菌孵育時間應(yīng)滿 24h)，觀察結(jié)果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細(xì)菌置5%二氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧

3、環(huán)境中孵 育。結(jié)果判斷將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。 在含甲氧芐胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見輕微細(xì)菌生長，與生長對照比較抑制80%以上細(xì)菌 生長的最低藥物濃度作為終點濃度。如果出現(xiàn)有2個以上菌落生長于含藥濃度高于終點水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平 板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗。原理：將抗菌藥物配制到瓊脂培養(yǎng)基中成：128 u g/ml 、 64 u g/ml 、 32 u g/ml 0.06 ug/ml對倍稀釋的濃度系列多點接種器將制備好的細(xì)菌菌懸液迅速點 種到瓊脂表面，經(jīng)35C16-20小時培養(yǎng)

4、肉眼觀察細(xì)菌生長，以未見細(xì)菌生長平板的 最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MlC)抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備1估算抗菌藥物最小稱量瓊脂稀釋法最高藥物濃度為128ug/ml藥物和培養(yǎng)基的體積比1:14,即藥物濃度將成15倍稀釋，因此保存液為128ug/mlX15 = 1920ug/ml如果1次用量為10ml ,則：抗菌藥物最小稱量=1920ug/ml*10ml抗菌藥物的效價抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備2抗菌藥物稀釋選擇合適的抗菌藥物稀釋液進(jìn)行藥物稀釋, 稀釋液需要量見下列公式：怦沈、蕓兒抗菌藥物實際稱量*效價稀釋液體積保存液濃度(i920ug/ml)抗菌藥物保存液的準(zhǔn)備3實際操作：先計算完成一批試驗需幾次完成,每次

5、用 量多少，然后可一起稱量,一起稀釋,然后 按每次需要量分裝在試管中，貼上標(biāo)簽，注 明藥物名稱，濃度,體積數(shù)及配制日期，置 與C-20C保存,備用。培養(yǎng)基需氧菌MH肉湯或瓊脂苛氧菌嗜血桿菌屬：Haemophilus test medium base + 補(bǔ)充園子SR158鏈球菌屬：MHA瓊脂+5%脫纖維羊血卡他莫拉菌屬：MHA瓊脂+5%脫纖維 羊血淋球菌：CC Agar Base+L53厭氧菌Wilkins chalgren anaerobe 瓊月旨菌液準(zhǔn)備1生長法：無菌環(huán)取4-5個苗落大小形態(tài)一致的菌落 頂部后接種于4-5mlMH肉湯內(nèi)35P培養(yǎng)4-6小時到對數(shù)生長期，亦可過 夜培養(yǎng)，但不允

6、許超過18小時用肉湯/生理鹽水枝正至0. 5麥?zhǔn)瞎軡舛?- 2X108CFU/ml菌液準(zhǔn)備2直接菌落懸浮法：從孵育了 18-24h新鮮培養(yǎng)物的平板上，用 無菌環(huán)取單個菌落接種于無菌肉湯/生理鹽水內(nèi) 校正至0. 5麥?zhǔn)瞎軡舛?-2X10FU/inl 推薦用于苛氧菌和簪在的MRS菌液準(zhǔn)備3對絕大多數(shù)細(xì)菌來說，上述用生長法或直 接菌落懸浮法制備的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳?液,應(yīng)該再用無菌肉湯或生理鹽水行1: 10 稀釋,此時菌液濃度l-2*107CFU/mL調(diào) 整好的菌液應(yīng)該在制備后的15分鐘內(nèi)完成 點種菌液準(zhǔn)備4如一次實驗需完成50株或100株細(xì)菌，則細(xì) 菌要編上工作序號1-50或1-100,并在結(jié)果

7、 記錄紙上要一一對應(yīng)寫上工作序號和菌種 編號瓊脂稀釋法藥敏平板的制備1配制融化的MH瓊脂或適合其他苛氧菌、厭 氧菌等特訊細(xì)菌的培養(yǎng)基，待冷卻到48- 5OC,澆制藥物平極.取滅菌的9 Omni平板12只，用記號筆在平板 底部作好“點種標(biāo)記”、“藥物名稱”.“藥物濃度”，濃度從0.06ug/(nl12811 g/ml,每種濃度1只平板共12個濃度系列。瓊脂稀釋法藥敏平板的制備2取11支無菌玻璃試管(13X 100mm),每支試 管標(biāo)記為：960, 480, 240, 120, 60, 30,15, 7. 5, 3. 75, 1.875, 0. 935 u g/m,并于上述每根管子中用 無菌移液管

8、加無菌稀釋液L 5ml瓊脂稀釋法藥敏平板的制備3將保存在-20C冰箱中的1920ug/ml濃度的抗 菌藥物保存液取出融化后，用無菌移液管吸取2. 5ml加入到128 u g/ml標(biāo)記的平板內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1. 5山1加入到960標(biāo)記的試管內(nèi)， 混勻后再吸取2. 51111加入到64 u g/ml標(biāo)記的平板 內(nèi)1ml移液管內(nèi)剩余的1. 5m 1再加入到480 u g/ml標(biāo)記 的玻璃試管內(nèi)；混勻后再吸取2. 5ml依次類推，直至最后個。,06 u g/ml標(biāo)記的平皿 內(nèi)加入1虬則抗備藥物稀釋完成瓊脂稀釋法藥敏平板的制備4準(zhǔn)備2只無藥的平板,作點種前和點種后質(zhì) 控對照所有藥物平板應(yīng)保持表面干

9、燥，不可有肉 眼可見的水珠（可在35 C孵箱內(nèi)倒置平板 開蓋烘干15-20分鐘）瓊脂稀釋法藥敏平板的制備5如果需使用的藥物平板為lOOXIOOnim的方平板， 則每根玻璃管內(nèi)需加入2. 5ml的抗菌藥物稀釋液； 每次無菌吸管吸取的抗菌藥物量應(yīng)該為4. 5m 1 每只方平板應(yīng)加入2nd抗菌藥物試液無菌吸管內(nèi)應(yīng)存留下2. 5ml與下一個濃度的玻璃 試管內(nèi)的2. 5ml稀釋液進(jìn)行充分混勻藥敏培養(yǎng)基應(yīng)加入28皿1測試菌液的點種1預(yù)先將點種針和點種板高壓滅菌，并在孵箱內(nèi)烘干 (52孔、100孔、或21孔)將已調(diào)整好濁度(l-2X107CFU/ml)的菌液用微量 加樣器將菌液依次加入菌液點種板小孔加 并作

10、好 與藥期羊敲相應(yīng)的點種標(biāo)記,一般每小孔內(nèi)應(yīng)加入 菌液270 uL 每批試驗均須保留有質(zhì)控菌位置和 無菌菌液位置用酒精棉球清潔多點接種器后，將點種針安裝在 多點接種器架子上，再將加好菌液的點種板安置 上多點接種器的點種板位置上測試菌液的點種2開啟多點接種器進(jìn)行點種，因每一才艮點種 針直徑約因此點種到藥物平板上每點 的菌液量約為2ul,所以接種量為IO, CFU/點種時應(yīng)先點種對照前的質(zhì)控平板，然后 從最低藥物濃度開始點種依次點種到藥物濃度最高的平板藥物平板的孵育上述接種好的平板應(yīng)在室溫下靜置至接種點上的 菌液被瓊脂完全吸收，再將藥敏平皿倒置，于 35C孵育16-20小時如葡萄球菌苯喳西林和甲氧

11、西林，則需33-35C, 絕對不能超過35C,孵育24小時、閱讀結(jié)果 萬古霉素藥敏試驗的腸球菌和葡萄球菌等需孵24 小時后，閱讀結(jié)果淋病奈瑟球菌需在5%CO2空氣環(huán)境中孵育20-24小 時，閱讀結(jié)果結(jié)果閱讀和判斷結(jié)果閱讀時，平板應(yīng)置于黑色不反光的表面上， 記錄的MIC是完全抑制細(xì)菌生長的最低抗生素濃度, 單個菌落或接種物所致的輕微的不清晰現(xiàn)象可忽 略不計，如果在MIC判斷終點附近持續(xù)存在或多個菌落，或 者低濃度不長，高濃度生長；或者有俗稱的跳管 現(xiàn)象，就應(yīng)該檢查試驗菌的純度，有否污染菌生 長，并盡可能重復(fù)試驗。按當(dāng)年的CLSI/NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。質(zhì)控菌株質(zhì)控菌株藥敏其他金黃色制枸球菌ATCC29213+大豚埃希菌ATCC25922+大腸埃希菌ATCC35218+產(chǎn)R內(nèi)酰胺醇肺炎克甫伯菌ATCC700603+產(chǎn)超廣譜B內(nèi)耽胺酶銅綠展單胞菌ATCC27853+質(zhì)控甬株質(zhì)控菌株藥敏其他肺炎說球菌ATCG49619糞腐球菌ATCC29212+檢測胸腺嗨臆流感嗜血桿南ATGC49766+氨卡四-林敏感株流感嗜血桿篇ATGC49247+產(chǎn)團(tuán)習(xí)