動物細胞原代培養(yǎng)

1、實驗一 動物細胞原代培養(yǎng)1一、實驗目的 1掌握動物細胞培養(yǎng)的無菌操作技術。2. 掌握動物細胞原代培養(yǎng)的基本方法。2二、實驗原理 原代培養(yǎng)( primary culture )是指取自體內的新鮮組織、細胞，在體外條件下生長至傳代之前細胞培養(yǎng)階段，是細胞培養(yǎng)的最初和必經階段。原代培養(yǎng)方法主要有組織塊貼壁培養(yǎng)法和分散細胞培養(yǎng)法。組織塊貼壁培養(yǎng)法是將切成小塊的組織貼附在適宜的支持物上，細胞從組織塊邊緣游離、生長，形成單層細胞即為原代培養(yǎng)細胞。分散細胞培養(yǎng)法是通過酶消化或機械分離，使組織分散成單個細胞，然后開始首次培養(yǎng)的方法。3三、實驗材料 1動物材料 出生2周內的大鼠。2實驗試劑 （1）D-Hanks

2、 液（2）75%乙醇（3）0.05% 型膠原酶液（4）DMEM培養(yǎng)基（5）小牛血清（6）雙抗溶液（7）0.4%臺盼藍染液43實驗器材超凈工作臺、倒置相差顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、水浴鍋、離心機、眼科剪、眼科鑷、移液器及槍頭、培養(yǎng)皿、燒杯、細胞培養(yǎng)瓶、吸管、離心管、血球計數(shù)板、載玻片、蓋玻片、200目不銹鋼篩網(wǎng)、酒精燈、75酒精棉球、記號筆等。5四、實驗方法與步驟 1取1只大鼠，頸椎脫臼法處死，浸入75%乙醇消毒。2. 將小鼠置于超凈臺中的大培養(yǎng)皿中，背部朝上，用75%酒精棉球擦拭其整個背部皮膚。3用眼科鑷提起小鼠腰部皮膚，用眼科剪橫向剪開皮膚，稍用力將剪開的皮膚拉向兩端，暴露腰部。更換解剖器械，剪

3、開腰部的肌肉、被膜，取出腎臟，置于培養(yǎng)皿中。4. 更換解剖器械，去除腎被膜，去除腎盂，用含有雙抗的D-Hanks液清洗3次，剪取腎皮質部分，移入小燒杯中，加入少量D-Hanks液，剪成1mm3左右的組織塊。用D-Hanks液清洗3次，吸去上清液，盡量去除血細胞。65向組織塊中加入0.05% 型膠原酶消化液，37水浴振蕩消化5分鐘后，用吸管吹打數(shù)次，吸取上清于離心管中，4冰箱保存，向剩余組織塊中添加膠原酶消化液，繼續(xù)37水浴振蕩消化，每隔5分鐘，用吸管反復吹打，收集上清液，直至組織塊完全消化。全部上清液在4、800rpm 條件下離心5分鐘，棄去上清液，向沉淀中加入培養(yǎng)液，吹打成懸液。6. 用20

4、0目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，去除較大組織塊，濾液在4、500rpm 條件下離心5分鐘，棄去上清液。向沉淀中加入3mL含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，重懸細胞。7用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)及其存活率，將細胞以（35）105個/mL密度接種于25mL培養(yǎng)瓶中，每瓶加入細胞懸液3mL。在培養(yǎng)瓶上標注組織來源、實驗者姓名和實驗日期。將培養(yǎng)瓶移入37的5% CO2培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)。8. 逐日觀察細胞的生長狀態(tài)。2天后進行換液，去除懸浮在培養(yǎng)液中的無活性細胞。待細胞鋪滿瓶底，可進行傳代培養(yǎng)。7五、實驗結果1. 分離細胞培養(yǎng)法實驗中，細胞12小時貼壁，24小時可見細胞從小細胞團周邊生長，23天可長成單層，細胞呈扁

5、平不規(guī)則多邊形，鵝卵石樣排列。8六、注意事項1原代培養(yǎng)過程中所使用的解剖器械、培養(yǎng)基、溶液、器皿等要經過高壓滅菌或過濾除菌后方可使用。2解剖動物和取材的各個步驟應更換解剖器械，以免細胞被污染。3. 在CO2培養(yǎng)箱中，若選用的培養(yǎng)瓶螺旋蓋不帶有濾膜，則應將瓶蓋擰松，保持通氣狀態(tài)。4實驗過程中，實驗人員要嚴格遵守無菌操作流程。動作要輕柔，安裝吸頭、打開或封閉瓶口等操作應在火焰近處并經過燒灼后進行。操作時，避免講話、咳嗽，以防唾沫或呼出氣流造成污染。取用液體前不宜過早開蓋，使用完畢應立即封閉瓶口。吸取液體或細胞懸液時，應專管專用，一旦吸管前端接觸了手或其他污染物時應更換，吸出后殘留的液體不可重新加入原瓶，以防污染擴大或造成培養(yǎng)物間的交叉污染。5. 實驗結束后，應將實驗廢液或廢物及時移出無菌