航天誘變鳳仙花種子抗菌肽的分離純化及抗菌活性研究初報(bào)

1、航天誘變鳳仙花種子抗菌肽的別離純化及抗菌活性研究初報(bào)【關(guān)鍵詞】航天誘變;鳳仙花;抗菌肽;別離純化抗菌肽(AntiirbialPeptides，APs)，是生物界中廣泛存在的一類生物活性小肽，具有抗細(xì)菌或真菌作用，有些還具有抗原蟲、病毒或腫瘤細(xì)胞的功能1?？咕木哂袕V譜的抗菌作用，對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌具有抑制作用；可以殺傷動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，卻又不破壞動(dòng)物體內(nèi)的正常細(xì)胞2，3。因此，抗菌活性肽的開發(fā)與應(yīng)用研究已成為國內(nèi)外昆蟲學(xué)、植物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)。鳳仙花是一種較早開發(fā)的藥用植物。中醫(yī)認(rèn)為,鳳仙花子能通經(jīng)活血、軟堅(jiān)散結(jié)；根葉有散血通絡(luò)、祛風(fēng)止痛、解毒療瘡之成效。近年來，

2、研究發(fā)現(xiàn)鳳仙花還有抑菌、消炎和抗癌等作用。本試驗(yàn)采用的材料是普通鳳仙花種子搭載“神舟四號(hào)航天飛船繞太空運(yùn)行6天18小時(shí)后播種，由鳳仙花航天突變植株獲得的第四代種子(SP4)。研究47證實(shí)航天誘變鳳仙花種子，由于宇宙射線、交變磁嘗微重力和高真空等因素的影響，其染色體出現(xiàn)了大規(guī)模不規(guī)那么變異，可能導(dǎo)致基因突變，從而影響植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。因此，航天誘變鳳仙花抗菌肽的別離、純化具有重要的研究?jī)r(jià)值，對(duì)航天誘變育種、抗菌肽的大量消費(fèi)以及抗菌藥物的開發(fā)等具有實(shí)際意義，在國內(nèi)外尚屬首次。1材料航天誘變鳳仙花種子(SP4)由西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院湯澤生教授提供。供試菌株：枯草芽孢桿菌(Baillussub

3、tilis)和大腸桿菌(Esherihiali)由實(shí)驗(yàn)室保存；金黃色葡萄球菌(Staphylusaureus)購自于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心，綠膿桿菌(P.aeruginsa)由四川省綿陽市第三人民醫(yī)院呼吸科提供。2方法2.1粗提物的搜集及抑菌作用稱取適量航天誘變鳳仙花干種子，磨成粉末，采用磷酸緩沖液于4冰箱浸提24h后離心取上清液。沉淀反復(fù)浸提數(shù)次，合并上清液，于4采用硫酸銨80%飽和度鹽析搜集沉淀的蛋白質(zhì)，并透析脫鹽，獲得種子總蛋白質(zhì)。將種子總蛋白溶液用枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌做抑菌實(shí)驗(yàn)。2.2抗菌肽的初步純化采用illipre小型切向流超濾系統(tǒng)對(duì)脫鹽后的

4、蛋白質(zhì)進(jìn)展初步別離，選用使用截留量為50KD，10KD和5KD的膜包經(jīng)過3次分級(jí)別離，獲得了抗菌肽粗提物。將上述各提取物上樣18柱，以99.9%乙腈和0.1%三氟乙酸TFA為洗脫液，以3.0lin-1的流速進(jìn)展洗脫，紫外檢測(cè)儀器檢測(cè)其D210處的吸光值。搜集具有抑菌活性的樣品冷凍真空枯燥至粉末，20保存。同時(shí)參考孫雪文等8的方法，采用改良的Triine-SDS電泳系統(tǒng)檢測(cè)每步產(chǎn)品的分子量并進(jìn)展抑菌試驗(yàn)。2.3抗菌肽的純化用0.2的一次性濾頭對(duì)超濾別離出來的分子量小于5KD的小分子蛋白質(zhì)樣品進(jìn)展過濾，除去不溶性雜質(zhì)。再采用安捷倫18制備柱進(jìn)展抗菌肽的純化，流動(dòng)相99.9%乙腈與0.1%三氟乙酸T

5、FA，流速3.0lin-1，柱溫23。用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)為210n下測(cè)紫外吸收值。搜集各峰，冷凍真空枯燥至粉末。將凍干品稀釋后做抑菌試驗(yàn)，有抑菌活性的峰就含有抗菌肽。2.4抗菌肽抑菌活性的測(cè)定采用紙片法來進(jìn)展抑菌活性檢測(cè)。細(xì)菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基。菌種為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌。在直徑為10的平皿內(nèi)傾倒培養(yǎng)基；待平板冷卻，汲取調(diào)整好濃度的，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的供試菌懸液100l于平板上，用無菌涂布器均勻涂布于平板外表。每種供試菌涂布兩個(gè)平板，每個(gè)平板貼4張直徑為6的無菌紙片，其中兩片加滴加20l抗菌肽樣品，另外兩片滴加無菌水作對(duì)照。在37培養(yǎng)24h(綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌

6、的培養(yǎng)溫度為24)，測(cè)量各抑菌圈直徑，以表示抗菌活性。2.5抗菌肽的電泳檢測(cè)以分子量73，50，35，25，16，8，2kDa蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。因此本課題組參考孫雪文等8的方法，采用改良的Triine-SDS電泳系統(tǒng)，對(duì)提取的小分子多肽的分子量進(jìn)展檢測(cè)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1蛋白質(zhì)粗提結(jié)果由圖1可以看出，蛋白質(zhì)粗提物中含有多種蛋白質(zhì)，其中在29KD附近存在有染色較深的條帶，說明粗提物中含有小分子蛋白質(zhì)，且含量較高。圖1中條帶25是第1次超濾，用50KD的膜包截留得到的分子量小于50KD的蛋白質(zhì)。3.2抗菌肽超濾初步純化結(jié)果經(jīng)過超濾對(duì)種子總蛋白質(zhì)進(jìn)展初步別離，得到的分子量小于5KD的

7、小分子蛋白質(zhì)樣品進(jìn)展電泳檢測(cè)，分別用考馬斯亮藍(lán)和硝酸銀染色法對(duì)凝膠進(jìn)展染色，在2KD左右都可以清楚的看到一條明晰的小分子蛋白質(zhì)條帶，在圖上還出現(xiàn)了8KD以上的蛋白質(zhì)條帶，這是由于5KD超濾膜在截留的過程中，在壓力的作用下，5KD的膜包可以通過3倍分子量以上的蛋白質(zhì)。3.3抗菌肽純化結(jié)果對(duì)超濾得到的小分子蛋白質(zhì)采用高效液相再進(jìn)展別離純化。首先采用18制備柱來別離分子量小于5KD的蛋白質(zhì)，根據(jù)峰的情況，分段搜集別離出來的物質(zhì)，凍干，溶于無菌蒸餾水中。經(jīng)過Triine-SDS電泳和抑菌活性鑒定后發(fā)現(xiàn)，搜集的a-b段在2KD左右有條帶，也具有抑菌活性。由于超濾別離出來的小分子蛋白質(zhì)雜質(zhì)太多，需要進(jìn)一步

8、純化a-b段物質(zhì)。按照高效液相第1次制備的方法對(duì)搜集的a-b段進(jìn)展再純化，結(jié)果見圖2，可知第2次別離制備的蛋白質(zhì)相對(duì)較純，雜質(zhì)含量少。搜集主峰，然后進(jìn)展電泳及抑菌活性檢測(cè)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)主峰分子量在2KD左右，且具有抑菌活性。3.4電泳檢測(cè)結(jié)果對(duì)高效液相制備過程中，各步驟產(chǎn)品凍干粉溶解，進(jìn)展電泳鑒定其分子量。結(jié)果見圖2。電泳檢測(cè)說明此從航天誘變鳳仙花種子中提取的物質(zhì)分子量在2KD左右，帶型明晰，緊湊，結(jié)果非常理想。3.5抑菌活性檢測(cè)結(jié)果與分析抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果說明，從航天誘變鳳仙花種子中提取出的低分子量蛋白質(zhì)對(duì)金黃色葡萄桿菌、綠膿桿菌有明顯的抑菌作用，且抑菌作用持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；分別觀察48h和7

9、2h后，抑菌圈沒有被感染。對(duì)大腸桿菌抑菌效果不太明顯，抑菌圈較小，對(duì)枯草芽孢桿菌幾乎沒有抑菌作用。表1抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果略4討論本實(shí)驗(yàn)選用動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌(Staphylusaureus)、大腸桿菌(Esherihiali)、綠膿桿菌(P.aeruginsa)和植物源性枯草芽孢桿菌(Baillussubtilis)4種菌株來做抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)提取的低分子量蛋白質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有明顯的抑菌作用，但對(duì)大腸桿菌的抑菌作用比擬弱，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌作用不明顯。在接種的過程中發(fā)現(xiàn)，隨著低分子量蛋白質(zhì)溶液量的增加，抑菌圈從無到有，從小到大，因此證明種子中確實(shí)存在具有抗菌作用的分子量大約2

10、KD左右的小肽，即抗菌肽。但是其抗菌機(jī)制和抗菌譜還需要進(jìn)一步研究建立。通過對(duì)航天誘變鳳仙花種子總蛋白質(zhì)的粗提、別離和純化，經(jīng)電泳獲得了分子量在2KD左右的具有抗菌活性的小分子蛋白質(zhì)，推測(cè)航天誘變的鳳仙花種子中存在抗菌肽。1997年，Tailr等首次從鳳仙花種子中別離出4種對(duì)真菌和細(xì)菌表現(xiàn)出寬范圍的抑制作用，而對(duì)培養(yǎng)的人細(xì)胞沒有毒性的肽-Ib-AP1、Ib-AP2、Ib-AP3、Ib-AP4，而本實(shí)驗(yàn)室別離純化出來只有一種小肽。一方面說明，航天誘變鳳仙花種子中抗菌肽的基因可能已經(jīng)發(fā)生了改變，另一方面也可能由于這4種基因編碼的小肽分子量接近，在電泳時(shí)不易分開，要想徹底弄清該基因是否發(fā)生了突變還有待

11、于進(jìn)一步深化研究。本實(shí)驗(yàn)說明，從航天誘變鳳仙花種子中直接別離純化小分子抗菌肽，由于材料比擬少、別離純化過程繁瑣、本錢高、不易檢測(cè)以及容易失去活性等。因此，要獲得大量抗菌肽進(jìn)而研究其抗菌機(jī)制、理化性質(zhì)、分子構(gòu)造等，還需要采用基因工程技術(shù)構(gòu)建DNA文庫和抗菌肽基因工程菌，為挑選抗菌肽基因和大量消費(fèi)抗菌肽奠定基矗目前，鳳仙花抗菌肽對(duì)綠膿桿菌的抑菌活性并未見報(bào)道。綠膿桿菌是是傷口感染較常見的一種細(xì)菌，能引起化膿性病變其致病力較低但抗藥性強(qiáng)。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，航天誘變鳳仙花種子中純化出的小肽對(duì)綠膿桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，為以后開發(fā)肽類抗生素、特別是針對(duì)耐藥性細(xì)菌的藥物具有重大意義。同時(shí)也說明，在誘變的鳳仙

12、花種子中，抗菌肽的基因可能發(fā)生了突變，這種突變有可能增強(qiáng)了抗菌肽的活性，對(duì)以后研究誘變育種具有重要的應(yīng)用價(jià)值。【參考文獻(xiàn)】1胡云龍,趙學(xué)忠,屈賢明.抗菌肽的分子生物學(xué)研究進(jìn)展J.生物工程進(jìn)展,1997,17(3):14.2李恩民,劉維全,殷震.抗菌肽的特性及其應(yīng)用前景J.中國藥理學(xué)通報(bào),1998,14(3):209.3arshallSH,ArenasG.Antiirbialpeptides:AnaturalalternativetheialantibitisandaptentialfrappliedbitehnlgyJ.EletrniJurnalfBitehnlgy,2022,6(2):1542.4湯澤生,楊軍,趙燕,等.航天誘變鳳仙花SP1代花、果實(shí)和種子的研究J.西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2022,26(1):47.5李海濤,湯澤生,彭正松,等.航天誘變鳳仙花SP1代多分孢子現(xiàn)象的回歸分析J.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)