第一專題 生物大分子的結構與功能

1、第一專題 生物大分子的結構與功能第1頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 第一章 核酸的結構和功能 Structure and Function of Nucleic Acid第2頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 目 錄第一節(jié) 核酸的種類、分布和化學組成第二節(jié) 核酸的分子結構第三節(jié) 核酸的理化性質(zhì)及其應用第四節(jié) 核酸的制備、測定及研究技術第3頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日核 酸 (nucleic acid) 核酸是一類重要的生物大分子，擔負著生命信息的儲存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學、分子生物學的重要研究領域，是基因工程

2、操作的核心分子。第4頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進展1868年 Fridrich Miescher從膿細胞中提取“核素” 1944年 Avery等人證實DNA是遺傳物質(zhì)1953年 Watson和Crick提出DNA雙螺旋結構模型1966年 Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1975年 Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶;Sanger建立DNA測序方法1981年 T.Cech發(fā)現(xiàn)了核酶1985年 Mullis發(fā)明PCR 技術1990年 美國啟動人類基因組計劃(HGP) 1999年 中國獲準加入人類基因組計劃2001年 美、英等國完成人類基因

3、組計劃基本框架第5頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第一節(jié) 核酸的種類、分布和化學組成一、核酸的生物學功能二、核酸的種類和分布三、核酸的化學組成第6頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日一、核酸的生物學功能orand肺炎球菌轉化實驗第7頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日蛋白質(zhì)翻譯轉錄逆轉錄復制復制DNARNA生物學的中心法則第8頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日二、核酸的種類及分布( DNA)( RNA)脫氧核糖核酸 核糖核酸RNA主要存在于細胞質(zhì)中，約占90%，少量存在于細胞核。 RNA有三種：信使R

4、NA（mRNA），占總RNA 5%。 核糖體RNA （rRNA），占總RNA 80%。 轉移RNA （ tRNA），占總RNA 10-15%。真核98%核中（染色體中）核外線粒體（mDNA）葉綠體（ctDNA）原核擬核核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒第9頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日三、核酸的化學組成核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖元素組成： C H O N PA、G、C、U（RNA)A、G、C、T (DNA)核糖（RNA）脫氧核糖（DNA）第10頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日兩類核酸的基本化學組成 DNA RNA嘌呤堿腺嘌呤鳥嘌呤

5、腺嘌呤鳥嘌呤嘧啶堿胞嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶尿嘧啶戊糖D-2-脫氧核糖 D-核糖酸 磷酸 磷酸第11頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（一）戊糖組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為D-核糖。RiboseDeoxyribose第12頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日(二）堿基1. 嘌呤（Purine）123456978腺嘌呤AdenineA鳥嘌呤guanineG第13頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日2. 嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶cytosineC胸腺

6、嘧啶thymineTCH3第14頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 稀有堿基除上述5種基本的堿基外，核酸中還有一些含量甚少的堿基，通常稱為稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。N ,N -二甲基腺嘌呤：m2666A第15頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（三）核苷核苷 戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵12345(OH)12345(OH)第16頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日Adenosine Guanosine Cytidine Uridine核酸中的各種核苷第17頁，共156頁

7、，2022年，5月20日，6點44分，星期日幾種稀有核苷假尿嘧啶核苷 （）二氫尿嘧啶核苷 （DHU）2-O-甲基腺苷(Am)CH3CH3H3CHH5HH6A）（m2N ,N -二甲基腺嘌呤66第18頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（四）核苷酸腺嘌呤核苷酸（ AMP） Adenosine monophosphate脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP） Deoxyadenosine monophosphate鳥嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）OHH第19頁，共15

8、6頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日PPPPPPPP腺嘌呤核苷酸（AMP）鳥嘌呤核苷酸（GMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）第20頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 （五）細胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸環(huán)化核苷酸輔酶類核苷酸第21頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日AMPADPATP 1.多磷酸核苷酸第22頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日2.環(huán)化核苷酸OPOOHOA (G)O

9、OOHCH2HHHHcAMP(cGMP)的結構第23頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日3.輔酶類核苷酸NADP+NAD+第24頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日Vit B2FMNAMPFAD第25頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第二節(jié) 核酸的分子結構一、DNA的分子結構二、RNA的分子結構第26頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日一、DNA的分子結構（一）DNA 一級結構（二）DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則（三）DNA的二級結構（四）DNA的三級結構 第27頁，共156頁，2022年，5月20

10、日，6點44分，星期日（一）DNA 一級結構 DNA的一級結構是由數(shù)量極其龐大的四種脫氧核苷酸，dAMP,dGMP,dCMP,dTMP通過35-磷酸二酯鍵連接起來的線形或環(huán)形多核苷酸鏈。 DNA分子中核苷酸的排列順序叫做DNA的一級結構，簡稱為堿基序列。 一級結構的走向規(guī)定為53。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列順序，因此攜帶有不同的遺傳信息第28頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日55333 -5 磷酸二酯鍵核酸分子中核苷酸之間的共價鍵第29頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日一級結構表示法：結構式，線條式，字母式53結構式5 pApTpCpG

11、pCpT-OH 3 字母式A T P5 P C PG PC PT P OH 3 線條式第30頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二）DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則Chargaff首先注意到DNA堿基組成的某些規(guī)律性，在年總結出DNA堿基組成的規(guī)律：1. 同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同；2. 同一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變； 3. 幾乎所有的DNA，無論種屬來源如何，其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相同A =T，鳥嘌呤摩爾含量與胞嘧啶摩爾含量相同G =C，總的嘌呤摩爾含量與總的嘧啶摩爾含量相同AG=CT。4. 不同生物

12、來源的DNA堿基組成不同，表現(xiàn)在AT/GC比值的不同。這些結果后來為DNA的雙螺旋結構模型提供了一個有力的佐證。第31頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（三）DNA二級結構雙螺旋結構第32頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日1. DNA雙螺旋結構的研究背景堿基組成分析Chargaff 規(guī)則：A = TG C 堿基的理化數(shù)據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵配對較合理DNA纖維的X-光衍射圖譜分析第33頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日2. DNA雙螺旋結構模型要點 （Watson, Crick, 1953）（1） DNA分子由兩條反向

13、平行的多核苷酸鏈構成雙螺旋結構。兩條鏈圍繞同一個“中心軸”形成右手螺旋，螺旋表面有一條大溝和一條小溝。（2）嘌呤堿和嘧啶堿層疊于螺旋內(nèi)側，堿基平面與縱軸垂直，堿基之間的堆積距離為0.34nm 。磷酸與脫氧核糖在外側，彼此之間通過磷酸二酯鍵連接，形成DNA的骨架。糖環(huán)平面與中軸平行。第34頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日2. DNA雙螺旋結構模型要點 （Watson, Crick, 1953）（3）雙螺旋的直徑為2nm，順軸方向每隔0.34nm有一個核苷酸,兩個核苷酸之間的夾角為36，因此，沿中心軸每旋轉一周有10個核苷酸。（4）一條多核苷酸鏈上的嘌呤堿基與另一條鏈上的

14、嘧啶堿基以氫鍵相連，匹配成對，配對的原則是A= T之間形成二個氫鍵，G C之間形成三個氫鍵。因此， DNA的一條鏈為另一條鏈的互補鏈。第35頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 堿基的配對 A T C G第36頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日3. DNA雙螺旋結構的穩(wěn)定因素 氫鍵 堿基堆集力帶負電荷的磷酸基與帶正電荷的陽離子形成離子鍵第37頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日4. DNA雙螺旋結構的多態(tài)性Z-DNAB-DNAA-DNA三種DNA雙螺旋構象比較A B Z外型 粗短 適中 細長螺旋方向 右手 右手 左手螺旋直徑

15、2.3nm 2.0nm 1.8nm螺距 2.8nm 3.4nm 4.5nm堿基夾角 33 36 60每圈堿基數(shù) 11 10 12堿基對間垂直距離0.255nm 0.34nm 0.37nm堿基對傾角 20 0 7 大溝 很窄很深 很寬較深 平坦小溝 很寬、淺 窄、深 較窄很深第38頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日5. 三鏈 DNADNA三鏈間的堿基配對T-A-TC-G-CDNA分子內(nèi)的三鏈結構 多聚嘌呤多聚嘧啶 DNA分子內(nèi)的三鏈結構第39頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（四）DNA的三級結構DNA雙螺旋進一步扭曲成三級結構。第40頁，共156

16、頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日1. DNA的超螺旋結構某些小病毒、細菌的質(zhì)粒、噬菌體、真核生物線粒體和葉綠體以及某些細菌染色體中的DNA為雙鏈環(huán)形，其三級結構為麻花狀超螺旋形式。第41頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日L=25,T=25,W=0松弛環(huán)形1152010523L=23,T=23,W=0解鏈環(huán)形15101520231510152025L=23,T=25,W=2負超螺旋121482316131510152023右手旋轉擰松兩周后的線形DNADNA超螺旋的形成超螺旋的拓撲學公式：L=T+W第42頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星

17、期日超螺旋狀態(tài)的定量描述公式1： L=T+W L連環(huán)數(shù)，DNA雙螺旋中一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)。 TDNA分子中的螺旋數(shù) W超螺旋周數(shù)或扭曲數(shù)公式2： =（L-L0）/L0 超螺旋度 L0松馳態(tài)DNA連環(huán)數(shù)如上述超螺旋DNA的L=23 L0=25， =-0.08L=25,T=25,W=0松弛環(huán)形1152010523L=23,T=25,W=2負超螺旋12148231613第43頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日DNA超螺旋結構整體或局部的拓撲學變化及其調(diào)控對于DNA復制和RNA轉錄過程具有關鍵作用。 DNA超螺旋結構形成的意義第44頁，共156頁，2022年，

18、5月20日，6點44分，星期日2. DNA在真核生物細胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構成，其基本單位是 核小體(nucleosome)。核小體的組成 DNA：約200bp 組蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4各2分子第45頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日核小體的直徑10-11nm，DNA分子在組蛋白核心外面纏繞約1.8圈，有大約160bp。連接核小體的DNA片段約為32-34bp第46頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖第47頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日二、RNA的分子結構（一

19、）RNA一級結構 和類別（二） tRNA 的分子結構（三） rRNA的分子結構（四）mRNA的分子結構第48頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（一）RNA的類別和一級結構 信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白質(zhì)合成中起模板作用； 核糖體RNA（ribosoal RNA，rRNA）：與蛋白質(zhì)結合構成核糖體（ribosome）,核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所； 轉移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白質(zhì)合成時起著攜帶活化氨基酸的作用。第49頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 RNA分子中各核苷之間的連接方式（3-5磷酸

20、二酯鍵）和排列順序叫做RNA的一級結構OHOHOH53 RNA與DNA的差異 DNA RNA糖 脫氧核糖 核糖堿基 AGCT AGCU 不含稀有堿基 含稀有堿基第50頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二) tRNA 的分子結構二級結構特征： 單鏈 三葉草葉形 四臂四環(huán)三級結構 特征： 在二級結構基礎上進一步折疊扭曲形成倒L型第51頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日tRNA 的二級結構 三葉草形DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TC環(huán)CCA35 氨基酸臂 DHU環(huán) 反密碼環(huán) 額外環(huán) TC環(huán)第52頁，共156頁，2022年，5月20日，6

21、點44分，星期日tRNA的三級結構 倒L形第53頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日*真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNArRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）（三） rRNA的分子結構第54頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 結構特征：單鏈，螺旋化程度較tRNA低 與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能5S RNA的二級結構第55頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（四）mRNA的分子結構hnRNA 內(nèi)含子(intron)mRNA * mRNA成熟

22、過程 外顯子(exon)第56頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日* mRNA結構特點：1. 大多數(shù)真核mRNA的5末端均在轉錄后加上一個7-甲基鳥苷，同時第一個核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子結構：m7GpppNm-。2. 大多數(shù)真核mRNA的3末端有一個多聚腺苷酸(polyA)結構，稱為多聚A尾。第57頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日帽子結構帽子結構帽子結構OCH3第58頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日mRNA由核內(nèi)向胞質(zhì)的轉移mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的調(diào)控 帽子結構和多聚A尾的功能第59頁，共156頁，2022年，

23、5月20日，6點44分，星期日* mRNA的功能 把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞 細胞質(zhì)細胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉錄轉錄后剪接轉運mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細胞 第60頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日其他小分子RNA除了上述三種RNA外，細胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 snmRNAs第61頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日

24、第三節(jié) 核酸的理化性質(zhì)及其應用一、核酸的一般性質(zhì)二、核酸的紫外吸收性質(zhì)三、核酸的變性、復性和分子雜交第62頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日一、核酸的一般性質(zhì)1、性狀：DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末。2、粘性：核酸的水溶液粘度很大，DNA分子粘度大于RNA。核酸變性后，粘度下降。第63頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日3、溶解性：RNA和DNA都是極性的化合物，兩者都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機溶劑。它們的鈉鹽易溶于水。 核酸的提取？第64頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日4、核酸的酸堿性質(zhì) 核酸的磷酸

25、基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點偏酸性。DNA的pI約為45，RNA的pI約為2.02.5，在pH78電泳時泳向正極。 第65頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日二、核酸的紫外吸收性質(zhì)1、光吸收： 紫外吸收波段：240290nm 最大吸收峰：260nm2、變性后的光學性質(zhì)：（1）增色效應： 與天然DNA相比，變性DNA因其雙螺旋結構破壞，使堿基充分外露，因此，紫外吸收增加，這種現(xiàn)象叫增色效應。（2）減色效應： 若變性DNA復性形成雙螺旋結構后，其紫外吸收降低，這種現(xiàn)象叫減色效應。第66頁，共156頁，20

26、22年，5月20日，6點44分，星期日DNA的紫外吸收光譜天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123第67頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日OD260的應用1. DNA或RNA的定量RNA濃度（ug/mL）=OD2600.022XLX稀釋倍數(shù)DNA濃度（ug/mL）=0.02XLOD260X稀釋倍數(shù)式中：OD260為260nm波長處光密度值；L為比色杯的光程，一般為1cm；0.022為每毫升溶液含1微克RNA的光密度； 0.02為每毫升溶液內(nèi)含1微克DNA鈉鹽時的光密度。第68頁，共156頁，2022

27、年，5月20日，6點44分，星期日2.判斷核酸樣品的純度DNA純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品: OD260/OD280 = 2.0第69頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日三、核酸的變性、復性和分子雜交（一）變性（二）復性（三）核酸的分子雜交第70頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日(一）變性1、DNA變性的概念：指DNA分子中的雙螺旋結構解鏈為無規(guī)則線性結構的現(xiàn)象。2、DNA變性的本質(zhì)：維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結構的改變。3、導致DNA變性的因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、

28、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲醛等，均可引起核酸分子變性第71頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日DNA的變性過程加熱部分雙螺旋解開 無規(guī)則線團 鏈內(nèi)堿基配對第72頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日4、變性后其它理化性質(zhì)變化： OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸堿滴定曲線改變生物活性喪失第73頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日Tm：熔解溫度 DNA的變性發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中光吸收達到最大吸收一半時的溫度稱為該DNA的熔點或熔解溫度，用Tm表示。 DNA的Tm值一般在70 85之

29、間。某些DNA的Tm值60801001 .01 .41 .2100%A260t 0CTmTmTm123第74頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日DNA的Tm值與下列的因素有關：1、 DNA的均一性:均一性愈高的樣品，熔解過程的溫度范圍愈小。2、 G-C的含量： （ G-C）%=（tm-69.3）x2.443、介質(zhì)離子強度：介質(zhì)離子強度較低，DNA的tm也低。第75頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二）復性 DNA復性(renaturation)：變性DNA在適當條件下，又可使兩條彼此分開的鏈重新締合成為雙螺旋結構，這一現(xiàn)象稱為復性。熱變性的DNA

30、經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing) 。第76頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第77頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（三）分子雜交當兩條不同來源的DNA鏈或DNA鏈與RNA鏈之間存在互補順序時，在復性時可發(fā)生堿基互補配對形成局部雙螺旋區(qū)，稱分子雜交 Southern 雜交（Southern bolting）Northern 雜交（Northern bolting）Western 雜交 （Western bolting）第78頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日分子雜交的原理示意圖第79頁，共156

31、頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 核酸雜交技術是目前研究核酸結構、功能常用手段之一。用來檢驗核酸的缺失、插入；制備特定的探針（probe）通過雜交技術可進行基因的檢測和定位研究。第80頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日核酸雜交及其應用示意圖.變性、復性和雜交 粗細線分別代表不同DNA。 A是雜化雙鏈.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內(nèi)是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡.粗線代表探針 粗線上的X表示放射性標記第81頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切

32、割瓊脂糖電泳轉移至硝酸纖維素膜上與放射性標記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉移DNA吸附有DNA片段的膜第82頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第83頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第四節(jié) 核酸的制備、測定及研究技術一、核酸制備的一般原則 二、核酸的制備三、核酸的測定方法四、核酸的研究技術第84頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日一、核酸制備的一般原則 因為遺傳信息全部貯存在核酸的一級結構中，故完整的一級結構是保證核酸結構與功能研究的基礎。第85頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44

33、分，星期日（一）核酸制備時應遵循兩個原則：保證核酸一級結構的完整性；排除其它分子的污染。 第86頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二）核酸的純度要求 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時，應去除RNA，反之亦然。第87頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（三）核酸制備的注意事項 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞； 減少化學物質(zhì)對核酸的降解(避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞)

34、； 防止核酸的生物降解。細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結構。其中DNA酶需要二價陽離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素； 第88頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機械剪切力，其次是高溫。 機械剪切力包括強力高速的溶液振蕩、攪拌，細胞突然置于低滲液中；DNA樣品的反復凍融等。這些操作細節(jié)在實驗操作中應加倍注意。

35、機械剪切作用的主要危害對象是大分子量的線性DNA分子，如真核細胞的染色體DNA等。高溫，如長時間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過程中常規(guī)操作溫度為04以降低核酸酶的活性從而減少對核酸的生物降解。第89頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日I.材料準備II.破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.核酸溶解在適量緩沖液或水中破碎細胞提取純化二、核酸的制備第90頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日(一）核酸制備的一般方法和原理1、核酸酶的抑制和抑制劑 降低溫度，改

36、變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當然，幾個條件并用更好。 對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。 對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設法抑制RNase更重要。第91頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日DNase抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。第92頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日RNase抑制 操

37、作要帶手套 所有器皿要嚴格消毒 試劑處理 低溫操作 在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑第93頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日2、核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負電荷，結合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂； 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來； 3對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、 三異丙基萘磺酸鈉第94頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日3、核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑蛋白

38、質(zhì)變性劑的作用：（1）使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。（2）使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。（3）某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細胞的作用。如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC第95頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日4、核酸提取的一般過程（1）破碎細胞 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。 動物：液氮處理后用勻漿器破碎。 細胞器DNA：首先純化細胞器。 以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑第96頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（2）抽提核酸除去雜質(zhì) a首先使脫氧核糖核蛋白

39、、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離； b使核酸與蛋白質(zhì)分離； c除去脂類； d多糖的除去。第97頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（3）核酸的純化根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。第98頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（4）核酸質(zhì)量的鑒定DNA純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品: OD260/OD280 = 2.0a.應用OD260：b.瓊脂糖凝膠電泳第99頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（5）核酸樣品的保存核酸保存的

40、主要條件是溫度和介質(zhì) 溫度： -70是長期保存的良好溫度，為一次性保存。 -20保存。 保存介質(zhì)： TE緩沖溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0第100頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二）注意事項 材料準備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集第101頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二）注意事項 細胞裂解材料應適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧?/p>

41、解預處理方式：植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶K細菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠第102頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二）注意事項 核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質(zhì)的方法第103頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二）注意事項 核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），

42、有利于充分沉淀沉淀后應用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解 第104頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（三）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶切和PCR反應。原因DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應DNA中殘留有金屬離子對策重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）第105頁，共1

43、56頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（三）DNA提取常見問題問題二：DNA降解 原因材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融對策盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑含量細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融第106頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（三）DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少 原因實驗材料不佳或量

44、少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失對策盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；細菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒第107頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日三、核酸的測定方法第108頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日RNA濃度（ug/mL）=OD2600.022XLX稀釋倍數(shù)DNA濃度（ug/mL）=0.02XLOD260X稀釋倍數(shù)式中：OD260為260nm波長處光密度值；L為比色杯的光程，一般為1cm

45、；0.022為每毫升溶液含1微克RNA的光密度； 0.02為每毫升溶液內(nèi)含1微克DNA鈉鹽時的光密度。1、紫外吸收法第109頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日2、定糖法 RNA的測定：RNA分子中所含的核糖經(jīng)濃硫酸或濃鹽酸作用脫水生成糠醛，糠醛可與3，5-二羥甲苯（苔黑酚或地衣酚）反應生成綠色化合物，該化合物可在670-680nm波長下進行比色測定。 DNA的測定：DNA分子中的脫氧核糖在冰醋酸或濃硫酸存在下可與二苯胺反應生成蘭色化合物，該化合物可在595-620nm波長下進行比色測定。第110頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日3、定磷法 RNA

46、和DNA中都含有磷酸，可以進行磷的測定。純的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，測出核酸中的磷含量就可計算核酸的含量。測定時先將核酸用強酸消化成無機磷酸，后者與定磷試劑中的鉬酸反應生成磷鉬酸，在經(jīng)過還原作用而生成藍色的復合物，最后在650-660nm進行比色測定。第111頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日四核酸研究技術 （一）核酸的沉降特性 溶液中的核酸在引力場中可以下沉。在超速離心機造成的強大的離心力場中，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的超速離心用于：第112頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日1、測定核酸的浮力密度；2、測定溶液中核酸的構象，核

47、酸經(jīng)染料氯化銫密度梯度離心以后，在離心管里，沉降的速度由大到小依次為：超螺旋DNA、閉環(huán)質(zhì)粒DNA、開環(huán)及線型DNA，若樣品中含有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)沉降速度最小。3、核酸的制備。第113頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第114頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第115頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（二）核酸的凝膠電泳 凝膠電泳是當前核酸研究中最常用的方法，有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。第116頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第117頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期

48、日水平板電泳第118頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日（三）核酸的序列測定第119頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日DNA測序的基本戰(zhàn)略：設法產(chǎn)生帶標記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標記的片段起點相同、終點不同。通過PAGE電泳，能夠將相差一個核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據(jù)長短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNA片段就可讀出待測DNA的堿基序列。 第120頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日1.Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法測序） DNA的合成總是從5端向3端進行的。DNA的合成需要模板以及相應的引物鏈。DNA的

49、合成過程中，在合成的DNA鏈的3末端，依據(jù)堿基配對的原則，通過生成新的3,5磷酸二酯鍵，產(chǎn)生短的DNA鏈。具體測序工作中，平行進行四組反應，每組反應均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸；并在四組反應中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機地接入DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應的四組具有特定長度的、不同長短的DNA鏈。這四組DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測DNA的核苷酸序列,如下圖所示： 第121頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日模板CCGGTAGCAACT35引物5GG3酶反應dATPdCTP

50、dGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGGGCCATCGTTGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G T電泳方向GGCCATCGTTGAGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGTGGCCATCGGGCCATCGGCCATGGCCAGGCCGGC讀出模板互補序列AGTTGCTACC35讀出模板序列TCAACGATGG53酶法序列分析的原理第122頁，共156頁，

51、2022年，5月20日，6點44分，星期日第123頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日DNA的測序儀示意圖computer analysis成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機旋光鏡/棱鏡組件樣品槽凝膠中DNA移動方向輸入光學系統(tǒng)激光器第124頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第125頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日2.化學法（Maxam和Gilbert） 這一方法的基本步驟為:(1)先將DNA的末端之一進行標記(通常為放射性同位素32P；(2)在多組互相獨立的化學反應中分別進行特定堿基的化學修飾；(3)在修飾堿基位置化學法斷開D

52、NA鏈；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列,如下圖所示： 第126頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日DNA的化學測序示意圖 反應試劑G反應：硫酸二甲酯G+A反應：甲酸T+C反應：肼C反應：NaCl+肼第127頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日1、G反應：用硫酸二甲酯（DMS）使鳥嘌呤上的N7原子甲基化。甲基化的鳥嘌呤與脫氧戊糖之間的糖苷鍵在中性環(huán)境中加熱而斷裂，鳥嘌呤堿基脫落，多核苷酸骨架在鳥嘌呤處發(fā)生斷裂。2、G+A反應：用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得

53、不穩(wěn)定，再用哌啶使嘌呤脫落。3、T+C反應：用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基。4、C反應：當有NaCl存在時，只有C與肼發(fā)生反應，T不發(fā)生反應。斷裂的C可用哌啶除去。第128頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日3、測序技術進展同位素標記到熒光標記,平板電泳到毛細管電泳同位素標記平板電泳單色熒光標記平板電泳多色熒光標記毛細管電泳 ACGTACGT測序圖譜T A TTG CAT TG TC TGCATTG T CT第129頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日PCR是模擬體內(nèi)DNA復制條件，應用DNA聚合酶反應，特異性擴增某一DNA片段的技術。體

54、外程序化的DNA合成技術。（四）聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）第130頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 551、基本工作原理第131頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。第132頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日第133頁，共156頁，2022

55、年，5月20日，6點44分，星期日2、PCR反應體系引物（primer）酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）第134頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日PCR影響因素引物的長度、堿基組成和濃度、模板的濃度、鎂離子的濃度、退火溫度、延伸時間及循環(huán)周期數(shù)。第135頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 引物設計 對整個PCR擴增體系，引物的設計占有十分重要的地位。PCR效率和特異性取決于兩個方面。一是引物與模板的特異結合，二是多聚酶對

56、引物的有效延伸。引物設計的總原則就是提高擴增的效率和特異性。 第136頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日引物設計的一般原則：引物長度以15-25為宜。引物過短時會使特異性降低，過長時則成本增加，且也會降低特異性。引物堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象。引物G+C含量宜在45%-55%。引物內(nèi)部不應形成二級結構，兩個引物之間尤其在3末端不應有互補鏈存在。第137頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日引物的堿基順序不應與非擴增區(qū)域有同源性。要求在引物設計時采用計算機進行輔助檢索分析。引物3末端堿基：要求3末端與模板DNA一定要配對。3末端的末

57、位堿基最好選T、C、G，而不選A。引物5末端堿基：沒有嚴格的限制，只要與模板DNA結合的引物長度足夠，其5末端堿基可以不與模板DNA匹配而呈游離狀態(tài)。第138頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日引物濃度 一般為10-100pmol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機率，這兩者還由于競爭使用酶，dNTP和引物，這一切均會使DNA合成產(chǎn)率下降。第139頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 模板的濃度靶序列：10 -10 拷貝基因組DNA：0.2-2g質(zhì)粒DNA：20ng25第140頁，共156頁，2022年，5月20日，6點44分，星期日 鎂離子濃度 范圍1.5-8mmol/L。一般為1.5mmol/L。鎂離子過量能增加非特異性擴增并影響產(chǎn)率。當樣品