蛋白質的化學修飾

1、概 念 從廣義上說：凡通過化學基團的引入或除去，而使蛋白質共價結構發(fā)生改變，都可以稱為蛋白質的化學修飾。 包括兩個方面：（1）側鏈基團的改變；(2）主鏈結構的改變，前者屬于化學修飾的范疇，而后者則屬于基因重組和定點突變的方法。 蛋白質化學修飾的意義改變蛋白質的藥代動力學調節(jié)蛋白質的穩(wěn)定性以及活性改變蛋白質的空間構象化學修飾的原理影響蛋白質化學修飾反應進程的因素有：1 蛋白質功能基的反應性（親核性）1.1 基團之間的氫鍵及靜電作用1.2 基團之間的空間位阻2 修飾劑的反應性2.1 選擇吸附2.2 靜電相互作用2.3 位阻因素化學修飾的方法學1 試劑的選擇 水解穩(wěn)定性； 蛋白質的修飾位點，反應類型

2、以及專一性； 修飾劑的大??； 連接鍵的穩(wěn)定性、毒性和抗原性； 修飾后是否需要進一步的分離； 是否適于建立快速、方便的分析方法； 是否能夠簡便經濟的合成或購買反應條件的選擇 考慮因素包括pH、反應溫度、反應介質以及緩沖液組成 允許反應順利進行 不能造成蛋白質的不可逆變性 有利于專一性修飾蛋白質 修飾反應的類型酰化及其相關反應烷基化反應氧化還原反應芳香環(huán)取代反應蛋白質的PEG修飾 聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)修飾又稱分子的PEG化(PEGalation),是目前蛋白質化學修飾最重要的技術之一,是用來解決或緩解蛋白和多肽在藥用過程中存在的諸多問題的有效途徑。PEG是由乙

3、二醇單體聚合而成的線性高分子材料,分子組成為HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH; PEG鏈還可以與馬來酸酐進一步共聚形成梳狀的PEG衍生物,簡稱PM。 PEG分子中存在的大量乙氧基能夠與水形成氫鍵,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余的羥基通過適當方式活化后可與各類蛋白分子相偶聯(lián)。 由于PEG無毒,具有良好生物相容性和血液相容性,使它成為一種被廣泛使用的生物修飾材料。對于各種具有藥用潛能的蛋白來說,采用PEG修飾的目的主要有以下三個方面:(1)增加穩(wěn)定性,延長血漿半衰期;(2)降低免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。1 增加穩(wěn)定性和延長血漿半衰期 一些

4、以注射方式使用的藥用蛋白,由于在血液中存留的時間過短,在很大程度上限制了其正常藥效的發(fā)揮。通過PEG修飾,一方面增加了分子量,降低了腎臟的排泄速率;另一方面,偶聯(lián)的PEG鏈在蛋白分子表面產生空間位阻效應,減弱了血液中各種水解酶對蛋白的水解作用,從而有效地延長了蛋白在循環(huán)系統(tǒng)內的保留時間。2降低抗原性和免疫原性 通過PEG修飾來消除免疫反應活性,將異源性蛋白轉化為非免疫原性的藥用蛋白,主要是利用無免疫原性的PEG分子鏈與蛋白表面的基團相偶聯(lián),進而在蛋白表面形成一道屏障,將暴露的抗原結合位點屏蔽起來。分子構型獨特的梳狀PEG具有更強的屏蔽功能,因而在這方面的應用更為普遍。3降低毒副作用 通過基因重

5、組技術獲得的大規(guī)模生產的TNF-a,IL-2 和IFN-g等是一類很有前途的抗腫瘤新藥。但由于它們的血漿半衰期短,為達到顯著的臨床治療效果不得不加大使用劑量,這就常常引起嚴重的毒副作用。近年來發(fā)現(xiàn),利用PEG修飾技術對這些蛋白進行處理后,能夠大大增加其血漿穩(wěn)定性,降低使用劑量;或在大的使用劑量下降低毒副作用。近年來,PEG修飾已成為提高其抗腫瘤效能、降低毒副作用的有效手段。PEG對蛋白藥物修飾的研究及應用進展 蛋白藥物的PEG修飾已卓有成效，國際知名的制藥公司已經或正在積極推進蛋白藥物的PEG修飾，1991年第一種用PEG修飾的蛋白藥物PEG-ADA被FDA批準上市，近幾年上市的有PEG-IF

6、N、PEG-G-CSF、PEG-生長抑素。目前處于臨床前研究的PEG修飾的蛋白藥物有幾十種，處于臨床實驗的有：超氧化物歧化酶（即將上市，Enzon公司）、白介素-2（期，Chiron公司）、水蛭素（期，BASF AG公司）、抗-TNF-a抗體片段（期，Pharmacia公司）、牛血紅蛋白（期，Enzon公司）、抗-PDGF抗體片段（期，Celltech公司）。 TNF-a是一種頗有價值的腫瘤治療藥物,它具有協(xié)同的抗腫瘤效能:一方面直接表現(xiàn)為對腫瘤細胞的細胞毒作用;另一方面可激活宿主的抗腫瘤應答并選擇性地引起腫瘤組織內部的微循環(huán)障礙。但是, TNF-a在體內的清除速率很快,要產生明顯的抗腫瘤效果

7、需要非常大的使用劑量,由此常引發(fā)一系列嚴重的毒副作用,包括發(fā)熱、組織炎癥和組織損傷,甚至是致命的內毒素性休克樣綜合征。要將其轉化為一種有效的抗腫瘤藥物必須有效地降低毒副作用,PEG修飾正是為達到這一目的。研究表明,利用mPEG 5000對TNF-a進行化學修飾,通過對修飾條件的優(yōu)化處理,不僅能夠有效減少毒副作用,還可提高其抗腫瘤活性。當賴氨酸殘基被修飾的程度分別為29%和56%時,其抗腫瘤活性分別增加了4倍和100倍。與天然TNF-a相比,修飾產物的分子量明顯增大,延長了藥物的有效作用時間,降低了毒副作用,促進了它作為抗腫瘤藥物的應用。PEG修飾蛋白及其應用被修飾蛋白種類修飾目的用途無基質牛血紅蛋白延長血漿半衰期,降低腎毒性血液代用品SOD延長血漿半衰期降低免疫原性清除氧自由基治療關節(jié)炎L-ASNase降低免疫原性治療白血病Bovine降低免疫原性血漿擴容劑IL-2增加水力動力學半徑治療腫瘤TNF-a增加抗腫瘤效能,降低毒副作用治療腫瘤抗腫瘤抗體腫瘤定位治療腫瘤-葡糖苷酸酶抗體增加穩(wěn)定性,改善