實(shí)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)

1、有用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培育手冊(cè)有用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培育手冊(cè)細(xì)胞培育是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下,使其生長(zhǎng)生殖,并維持其構(gòu)造和功能的一種培育技術(shù).細(xì)胞培育的培育物可以是單個(gè)細(xì)胞,也可以是細(xì)胞群.1、試驗(yàn)室設(shè)計(jì)物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培育室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清爽，枯燥和無(wú)煙塵。細(xì)胞培育室的設(shè)計(jì)原則一般是無(wú)菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培育于一室，而洗刷消毒在另一室。2、常用設(shè)施及設(shè)備大類。間放置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培育箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無(wú)菌物品等。常分析處理物洗刷消毒間：烤箱、

2、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。分析間：顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。3、培育器皿的三倍。器皿應(yīng)選擇透亮度好、無(wú)毒、利于細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面幾種。500ml250ml100ml 等幾種。胞傳代培育的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和觀看，瓶口要200ml100ml50ml25ml10ml 等幾種。培育皿：用于開(kāi)放式培育及其它用途。分直徑等幾種。吸管：常用的有長(zhǎng)吸管和短吸管兩類，長(zhǎng)吸管也稱刻度吸管。其吸管：常用的有長(zhǎng)吸管和短吸管兩類，長(zhǎng)吸管也稱刻度吸管。其改進(jìn)后管上部有球型刻度稱改進(jìn)吸管， 刻度吸管用于移動(dòng)液體。 常用 1ml 和1

3、0ml 兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。形態(tài)各樣，常用于細(xì)胞培育的離心管有大腹式尖底離心管和一般尖底離心管兩類。前者分別為 50ml30ml 、15ml ；后者則多為 10ml 和 5ml。其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。5、細(xì)胞培育目的與用途科學(xué)爭(zhēng)辯 :藥物爭(zhēng)辯開(kāi)發(fā)與根底爭(zhēng)辯1. 藥物爭(zhēng)辯與開(kāi)發(fā)藥篩選 :如化學(xué)合成藥物藥效爭(zhēng)辯 ,中藥有效成分篩選與鑒定等.滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等.基因工程藥物爭(zhēng)辯與開(kāi)發(fā) :如干擾素爭(zhēng)辯與開(kāi)發(fā) ,細(xì)胞生長(zhǎng)因子爭(zhēng)辯細(xì)胞工程藥物爭(zhēng)辯與開(kāi)發(fā) :生物活性多肽爭(zhēng)辯與開(kāi)發(fā) ,人參皂甙 ,紫杉醇等生物活性成分爭(zhēng)辯與開(kāi)發(fā) .單克隆抗體制

4、備 :包括診斷用單克隆抗體 ,治療用單克隆抗體 .根底爭(zhēng)辯藥物作用機(jī)理基因功能疾病發(fā)生氣理2, 生物制藥基因工程藥物生產(chǎn) :如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價(jià)值的一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子如干擾素 ,粒細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ,胸腺肽等 (3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)(4) 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn) :生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽 ,生物活性物質(zhì)等細(xì)胞培育根本條件1,適宜的細(xì)胞培育基適宜的細(xì)胞培育基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最重要的條件之一 ,培育基不僅供給細(xì)胞養(yǎng)分 和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的根底物質(zhì) ,而且還供給培育細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖的生存環(huán)境 .2,優(yōu)質(zhì)血清目前,大多數(shù)合成培育基都需要添加血清 .血清是細(xì)胞培育液中最重要的成分之一 ,含有

5、細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它養(yǎng)分成分.3,無(wú)菌無(wú)毒細(xì)胞培育環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒的操作環(huán)境和培育環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培育成功的首要條 件.在體外培育 的細(xì)胞由于缺乏對(duì)微生物和有毒物的防范力量,一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染 ,或者自身代謝物質(zhì)積存 ,可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡 .因此,在體外培育細(xì)胞時(shí) ,必需保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒 ,準(zhǔn)時(shí)去除細(xì)胞代謝產(chǎn)物.4,恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)溫度維持培育細(xì)胞旺盛生長(zhǎng) ,必需有恒定適宜的溫度 .5,適宜的氣體環(huán)境氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培育生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和 二氧化碳. 細(xì)胞培育基種類與根本成分細(xì)胞培育基的種類很多 ,按其來(lái)源分為合成培育基和自然培育基 (目前使用的

6、培育基絕大局部是合成培育基),按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培育基和液體培育基兩類.干粉培育基需由試驗(yàn)者 自己配制并滅菌,液體培育基由專業(yè)商家供給 ,用戶可直接使用,格外便利.每種細(xì)胞都有其適宜的培育基 ,合成培育基的主要成分有氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的根本單位 .不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異,但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成 ,必需依靠培育液供給 ,這幾種氨基酸稱為必需氨基酸 .其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸在缺少谷氨酰胺時(shí) ,細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡 .因此,各種培育液中都有較大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定 ,應(yīng)置于-20冰箱中保存,在使用前參加培育液內(nèi) .已含谷氨酰

7、胺的培育液在 4冰箱中儲(chǔ)存 2上時(shí),還應(yīng)重參加原來(lái)量的谷氨酰胺 .碳水化合物碳水化合物是細(xì)胞生長(zhǎng)主要能量來(lái)源 ,其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸無(wú)機(jī)鹽培育液中無(wú)機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡.此外,通過(guò)供給鈉,鉀和鈣離子 ,幫助細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞膜功能 .培育液的滲透壓是一個(gè)格外 320mOsm/kg.標(biāo)準(zhǔn)培育液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng) .特別留意:向培育液中參加其它物質(zhì)有可能會(huì)明顯轉(zhuǎn)變培育液的滲透壓 ,特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì) .向培育液中添加 HEPES時(shí)需按以下方法調(diào)整鈉離子濃度 .緩沖系統(tǒng)大多數(shù)細(xì)胞所需 pH 在 7.2 - 7.4. 但是,細(xì)胞培育最適 pH細(xì)胞種類不同而不同 .成纖維

8、細(xì)胞寵愛(ài)較高 pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4). 由于多數(shù)培育液靠碳酸氫鈉 (NaHCO3)CO2 體系進(jìn)展緩沖 ,因此,氣相中的 CO2 濃度應(yīng)與培育液中碳酸氫鈉濃度相平衡.假設(shè)氣相或培育箱空氣中 CO25%,3NaHCO31.97g/L;CO210%,NaHCO3HEPES 是pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖力量 ,但是格外昂貴,在高濃度時(shí)對(duì)一些細(xì)胞可能有毒 .HEPES(0.34g/L) 共用,以抵消因額外參加 HEPES 引起的滲透壓增加 .在這種培育條件下,細(xì)胞培育瓶的蓋子應(yīng)擰緊 ,以防止培育液中所需的少量碳酸鹽散

9、入空氣中.大多數(shù)培育液中含有酚紅作為 pH 指示劑,酸性培育液呈橙黃色 ,堿性維生素在細(xì)胞培育中 ,盡管血清是維生素重要來(lái)源 , 但是很多培育基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長(zhǎng) .其它成分在一些較為簡(jiǎn)單的培育液中還包括其它一些成分.如在雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM培育液,使用時(shí)還需要補(bǔ)加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-Me).2-Me對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有很重要的作用 .有人認(rèn)為它相當(dāng)于胎牛血清 ,有直接刺激細(xì)胞增殖作用 .2-Me的活性局部是硫氫基 ,其中一個(gè)重要作用是使血清中含硫的化合物復(fù)原成谷胱甘肽,能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖,為非特異性的激活作用 .同時(shí)避開(kāi)過(guò)氧化物

10、對(duì)培育細(xì)胞的損害 .另一個(gè)重要作用是促進(jìn)分裂原的反響和DNA合成,增加植物凝集素(PHA)對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用 ,已廣泛應(yīng)用于雜交瘤技術(shù) ,另外,也開(kāi)頭用于一些難以培育的細(xì)胞.2-Me 是一種小分子復(fù)原劑 ,極易氧化.分子量為 78.13,純的Me1.110-1.120(Do20), 常用終濃度510-5M.0.1M0.5ml.液體培育基保存液體培育基應(yīng)于 4冰箱避光保存 ,試驗(yàn)前放入 37體培育基有效期為 12 個(gè)月.液體培育基中的 L-谷氨酰胺會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而漸漸分解 .假設(shè)細(xì)胞生長(zhǎng)不良 ,可以再添加適量 L基保存:4冰箱避光保存 ,有效期 36血清細(xì)胞培育液中添加的血清有牛血清 ,

11、馬血清,人血清等 ,其中牛血清是最常用的血清 ,分為胎牛血清和生小牛血清 .胎牛血清是從母牛破腹取出小牛中分別出來(lái)的血清 ,如廠家能做到這一點(diǎn) ,生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大 .如小牛誕生后已哺乳 ,從這種小牛中取出的血清中可使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng) ,而不同批次的血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的力量也不同 ,尤其是對(duì)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng) ,某些批次血清可能含有毒性或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì) .因此,在購(gòu)置大量血清之前 ,必需對(duì)血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)力量進(jìn)展檢測(cè) ,然后再,然后大量購(gòu)置質(zhì)量好的同一批號(hào)的血清 ,并留意以下幾點(diǎn):需要長(zhǎng)期保存的血清必需儲(chǔ)存于 -20 - 70 低溫冰箱中.4冰箱中保存時(shí)間切勿

12、超過(guò) 110%,清在凍入低溫冰箱前 ,必需預(yù)留肯定體積空間 ,否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jī)隽?物,則可將血清參加培育液內(nèi)一起過(guò)濾 ,切勿直接過(guò)濾血清 .瓶裝血清解凍需承受逐步解凍法 :-20 至 - 70 低溫冰箱中的血清放入 4冰箱中溶解 1程中需不斷輕輕搖擺均勻 (留神勿造成氣泡 ),使溫度與成分均一 ,削減沉淀20進(jìn)入 37造成蛋白質(zhì)凝集而消滅沉淀 .熱滅活是指 56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清 .加熱過(guò)程中須規(guī)章?lián)u擺均勻 .此熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體成分 (complement) 滅活.除非必需,一般不建議作此熱處理 ,由于熱處理睬造成血清沉淀物顯著增多 ,肥大細(xì)胞和血小板釋放組

13、胺 , 增加吞噬作用 , 促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化 .切勿將血清在 37有效成分會(huì)破會(huì)而影響血清質(zhì)量 .血清中的沉淀物絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量 .可用離心 3000rpm, 5 分鐘去除,也可不用處理. 顯微鏡下“小黑點(diǎn)“:經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清 ,沉淀物的形成會(huì)顯著增多.有些沉淀物在顯微鏡下觀看象 “小黑點(diǎn)“,常誤認(rèn)為血清受污染 .一般狀況下,此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng) ,但假設(shè)疑心血清質(zhì)量 ,則應(yīng)馬上停頓使用,更換另一批號(hào)的血清 .細(xì)胞培育環(huán)境1,試驗(yàn)室設(shè)計(jì)細(xì)胞培育是一種無(wú)菌操作技術(shù) ,要求工作環(huán)境和條件必需保證

14、無(wú)微生物污染和不受 其它有害因素的影響 .細(xì)胞培育室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響 ,要求工作環(huán)境清潔 ,空氣清爽,枯燥和無(wú)煙塵.細(xì)胞培育室的設(shè)計(jì)原則一般是無(wú)菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè),常規(guī)操作和封閉培育于一室,而洗刷消毒在另一室 .2,常用設(shè)施及設(shè)備超凈工作臺(tái) :也稱凈化工作臺(tái) ,分為側(cè)流式 ,直流式和外流式三大類.置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培育箱 ,離心機(jī),倒置顯微鏡等 .緩沖間可放置電冰箱,冷藏器及消毒好的無(wú)菌物品等 .操作間:一般培育箱 ,離心機(jī),水浴鍋,定時(shí)鐘,一般天平及日常分析處理物洗刷消毒間 :烤箱,消毒鍋,蒸餾水處理器及酸缸等 .分析間:顯微鏡,計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等 .3

15、,培育器皿常用細(xì)胞培育器皿有培育瓶 ,培育板,培育皿等 .常預(yù)備量是使用量的三倍.器 皿應(yīng)選擇透亮度好 ,無(wú)毒,利于細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的材料 ,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品 .常用的器皿有下面幾種 .500ml,250ml, 100ml 等幾種.培育瓶:依據(jù)培育細(xì)胞種類要求不同培育瓶的形態(tài)各異,用于細(xì)胞傳代培育的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻 ,便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和觀看 ,瓶口要大小全都,口徑一般不小于 1cm,允許吸管伸入瓶?jī)?nèi)任何部位 ,規(guī)格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml 等幾種.培育皿:用于開(kāi)放式培育及其它用途 .分直徑 30mm,60mm,120mm 等幾種.吸管

16、:常用的有長(zhǎng)吸管和短吸管兩類 ,長(zhǎng)吸管也稱刻度吸管 .其改進(jìn)1ml10ml兩種.短吸管也叫滴管 ,分彎頭和直頭兩種 .離心管:離心管是細(xì)胞培育中使用最廣泛的器皿 ,依據(jù)用途不同形態(tài)各樣,常用于細(xì)胞培育的離心管有大腹式尖底離心管和一般尖底離心管 兩類.前者分別為 50ml,30ml,15ml; 后者則多為 10ml5ml.4,細(xì)胞培育溫度維持培育細(xì)胞旺盛生長(zhǎng) ,必需有恒定而適宜的溫度 .不同種類的細(xì)胞對(duì)培育溫度要求也不同 .人體細(xì)胞培育的標(biāo)準(zhǔn)溫度為 36.50.5,偏離這受力較對(duì)高溫強(qiáng) ,溫度上升不超過(guò) 39時(shí),細(xì)胞代謝與溫度成正比 ;人體細(xì)39-401 小時(shí),即能受到肯定損傷 ,但仍有40-4

17、11 小時(shí),細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷 ,僅小半數(shù)有可能恢復(fù);41-421可能;當(dāng)溫度在 43以上 10時(shí),對(duì)細(xì)胞代謝雖有影響 ,但并無(wú)損害作用 ;把細(xì)胞放入 25-35時(shí),細(xì)胞仍能生存437長(zhǎng).細(xì)胞代謝隨溫度降低而減慢 .當(dāng)溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí) ,細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡 .但是,假設(shè)向培育液中參加肯定量的冷凍保護(hù)劑 (二甲亞砜或甘油),可在深低溫下如 -80或-196(5,適宜的氣體環(huán)境氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培育生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和 二氧化碳 .氧氣參與三羧酸循環(huán) ,產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分 .開(kāi)放培育時(shí)一般把細(xì)胞置于 95%空氣加5%二氧化碳混合氣體

18、環(huán)境中 .二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物 ,也是細(xì)胞生長(zhǎng)生殖所需成分 ,它在細(xì)胞培育中的主要作用在于維持培育基的pH值.大多數(shù)細(xì)胞的適宜 pH 為7.2-7.4,偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培育將產(chǎn)生有害的影響.但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些 ,在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng) .但有一些細(xì)胞也寵愛(ài)偏堿環(huán)境中生長(zhǎng) ,如成纖維細(xì)胞最適合 pH7.4-7.6. 每種細(xì)胞都有其最適 pH細(xì)胞培育無(wú)菌操作根本技術(shù)無(wú)菌操作技術(shù)分為三個(gè)局部 :工作環(huán)境及外表的處理 ,細(xì)胞培育所用玻璃及塑料制品的處理及培育液與培育細(xì)胞的處理.工作環(huán)境的處理使用層流超凈工作臺(tái)是最經(jīng)濟(jì)有效的手段 .超凈工作臺(tái)正常工作時(shí) ,向下的氣流可阻擋外界空氣污染物

19、進(jìn)入超凈臺(tái).試驗(yàn)前,無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)用紫外燈照耀30-60 分鐘滅菌,用 70%酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面 ,并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn) 10 分鐘后,才可開(kāi)頭實(shí)試驗(yàn)物品帶出工作臺(tái) .如需要連續(xù)進(jìn)展下一個(gè)試驗(yàn) ,則用 70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面 ,再讓無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn) 10 分鐘后,才可進(jìn)展下一個(gè)試驗(yàn)操作 .或吸管頭等可以臨時(shí)放置 ,其它試驗(yàn)用品用完后應(yīng)準(zhǔn)時(shí)移出 ,以利氣體流通 .試驗(yàn)用品要用 70% 酒精擦拭后才能帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi) .試驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中心無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)展 ,勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作 .蓋并握住瓶身 ,傾斜約 45角取用 ,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺(tái)面上 .工作人員應(yīng)留意自身的安全

20、 ,必需穿戴試驗(yàn)衣與手套后才進(jìn)展試驗(yàn).對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別留神 ,并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)的無(wú)菌DMSOTPA 等,并避開(kāi)鋒利物品傷人等 .定期檢查以下工程 :CO2鋼瓶?jī)?nèi)的 CO2壓力;CO2培育箱內(nèi)的 CO2濃度,溫度,及水盤是否有污染 ;無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)氣流壓力是否正常 ,定期更換紫外燈管及 HEPA過(guò)濾器濾膜,預(yù)濾300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng),3000小時(shí)/HEPA). 培育細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程:埋伏期指數(shù)增生期停滯期埋伏期(latentphase) 細(xì)胞接種后,先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培育液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時(shí),細(xì)胞質(zhì)回縮 ,胞體呈圓球形.然后細(xì)胞貼附于載體外表 ,稱貼壁,懸浮期完畢. 細(xì)胞貼壁速度與細(xì)

21、胞種類, 培育基成分,載體的理化性質(zhì)等親熱相關(guān) .一般狀況下 , 原代培育細(xì)胞貼壁速度慢 ,可達(dá)10-24小時(shí)或更多, 而傳代細(xì)胞系貼壁速度快, 通常10-30分鐘即可貼壁.細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過(guò)一個(gè)埋伏階段 ,才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期 .原代培育細(xì)胞埋伏期長(zhǎng) ,約 24-96 小時(shí)或更長(zhǎng) , 連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞埋伏期短 ,僅需6-24小時(shí).指數(shù)增生期 (logarithmic growth phase)這是細(xì)胞增殖最旺盛的階段 ,分裂相細(xì)胞增多.指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要標(biāo)志.通常以細(xì)胞分裂相指 數(shù)(Mitoticindex,MI) 表示,即細(xì)胞群中每 1000個(gè)細(xì)

22、胞中的分裂相數(shù) .一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于 0.1%-0.5%, 原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低 ,而連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá) 3%-5%.指數(shù)增生期的細(xì)胞活力最好時(shí)期 ,是進(jìn)展各種試驗(yàn)最正確時(shí)期 ,也是凍存細(xì)胞的最好時(shí)機(jī) .在接種細(xì)胞數(shù)量適宜狀況下,指數(shù)增生期持續(xù) 3-5天后,隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多 ,生長(zhǎng)空間削減,最終細(xì)胞相互接觸集合成片 .正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng) ,這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contactinhibition). 而惡性腫瘤細(xì)胞無(wú)接觸抑制現(xiàn)象 ,能(piled up).胞接觸集合成片后 ,雖然發(fā)生接觸抑制 ,但只要養(yǎng)分充分 ,細(xì)胞仍能進(jìn)展增 殖分裂,因此細(xì)胞數(shù)仍舊在增

23、多 .但是,當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大 ,培育液中營(yíng)胞分裂停頓 ,這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象 (Density Inhibition).停滯期(Stagnate phase)細(xì)胞數(shù)量到達(dá)飽和密度后 ,如不準(zhǔn)時(shí)進(jìn)展傳代 ,細(xì)胞就會(huì)停頓增殖 ,進(jìn)(Plateau phase). 停滯期細(xì)胞雖不增殖,但仍有代謝活動(dòng) .如不進(jìn)展分別傳代 ,細(xì)胞會(huì)因培育液中養(yǎng)分耗盡 ,pH會(huì)發(fā)生死亡 ,因此,應(yīng)準(zhǔn)時(shí)傳代 . 培育細(xì)胞根本形態(tài) 培育細(xì)胞隨貼附支持物外形不同而形態(tài)各異 ,最常見(jiàn)的是貼附于平面支持物細(xì)胞 .在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透亮的 ,構(gòu)造不明顯 .細(xì)胞在生長(zhǎng)期常有 1-2粒,脫滴和腔泡等,說(shuō)明細(xì)胞代謝不良

24、 . 體外培育細(xì)胞依據(jù)它們?cè)谂嘤髅笫欠衲苜N附于支持物上生長(zhǎng)特征 ,可分為貼附型生長(zhǎng)和懸浮型生長(zhǎng)兩大類 .貼附型細(xì)胞在培育時(shí)能貼附在支持物外表生長(zhǎng).如羊水細(xì)胞為貼附型細(xì)胞 ,常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞生長(zhǎng) .懸浮型細(xì)胞在培育中懸浮生長(zhǎng) .成纖維型細(xì)胞在培育中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時(shí),皆可稱之為成纖維細(xì)胞 .本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相像而得名,細(xì)胞在支持物外表 呈梭形或不規(guī)章三角形生長(zhǎng) ,細(xì)胞中心有卵園形核 ,胞質(zhì)向外伸出 2-3厘米個(gè)長(zhǎng)短不同的突起 ,除真正的成纖維細(xì)胞外 ,凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類形態(tài)生長(zhǎng) .上皮型細(xì)胞此類型細(xì)胞在培育器皿支持物上生長(zhǎng)具有扁平

25、不規(guī)章多角形特征,細(xì)胞中心有園形核,細(xì)胞嚴(yán)密相連單層膜樣生長(zhǎng) .起源于內(nèi),外胚層細(xì)胞如皮膚,表皮衍生物,消化管上皮等組織細(xì)胞培育時(shí) ,皆呈上皮型形態(tài)生長(zhǎng) .游走型細(xì)胞本型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng) ,一般不連成片 .細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或亦難和其它型細(xì)胞區(qū)分 .在肯定的條件下 ,由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后 ,可呈類似多角型或成纖維細(xì)膩包形態(tài) .常見(jiàn)于羊水細(xì)胞培育的早期 . 細(xì)胞培育所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒清洗在組織細(xì)胞培育中 ,體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都格外敏感 .微生物產(chǎn)品附帶雜物 ,上次細(xì)胞殘留物及非養(yǎng)分成分的化學(xué)物質(zhì) ,均能影響培育細(xì)胞的生長(zhǎng).因此對(duì)使用玻璃器皿和重使用的培育器皿都要嚴(yán)格徹底

26、的清洗且要依據(jù)器皿的組成材料不同 ,選擇不同的清洗方法 .玻璃器皿的清洗組織細(xì)胞培育中 ,使用量最大的是玻璃器皿 ,故工作最最大的是玻璃器皿的清洗 .一般玻璃器皿的清洗包括浸泡 ,刷洗,浸酸和沖洗四個(gè)步驟 .清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透亮無(wú)油跡 ,而且不能殘留任何物質(zhì) .浸泡:初次使用和培育使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,以使附著物軟化或被溶液掉 .的初次使用的玻璃器皿 ,在生產(chǎn)及運(yùn)輸過(guò)程中 ,玻璃外表帶有大量的干固的灰塵 ,且玻璃外表常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)等.瓶使用前應(yīng)先用自來(lái)水簡(jiǎn)潔刷洗 ,然后用稀鹽酸液浸泡過(guò)夜,以中和其中的堿性物質(zhì) .再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過(guò)

27、的蛋白質(zhì),干固后不易洗掉,故用后要馬上浸入水中 ,且要求完全浸入,不能留有氣泡或浮在液面上 .刷洗:浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗,以除去器皿外表附著較牢的雜質(zhì) .刷洗要適度,過(guò)度會(huì)損害器皿外表光澤度 .浸酸:清潔液是由重鉻酸鉀 ,濃硫酸和蒸餾水按肯定比例配制而成 ,其處理過(guò)程稱為浸酸 .清潔液對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕作用 ,而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì) .清潔液去污力量很強(qiáng) .是清洗過(guò)程中關(guān)鍵的一環(huán) .浸泡時(shí)器皿要布滿清潔液 ,勿留氣泡或器皿露出清潔液面 .浸泡時(shí)間一般為過(guò)夜,不應(yīng)少于 6三種: 重鉻酸鉀 (g) 濃硫酸(ml) 蒸餾水(ml) (A)63:1000:202200

28、 (B) 次強(qiáng)清洗液 120:200:1000 (C) 弱清潔液 100:100:100.清潔液配制時(shí)應(yīng)留意安全 ,須穿戴耐酸手套和圍裙 ,并要保護(hù)好面部及身體然后漸漸加濃硫酸 .并不停的用玻璃棒攪拌 ,使產(chǎn)生的熱量揮發(fā) ,配制溶液應(yīng)選擇塑料制品 .配成后清潔液一般為棕紅色 .沖洗:玻璃器皿在使用后 ,刷洗及浸泡后都必需用水充分沖洗 .使之3-5膠塞的清洗細(xì)胞培育中所用的橡膠制品主要是瓶塞 .購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10-20 分鐘,以除掉培育中的13010-20塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是承受無(wú)毒并已經(jīng)特別處理的包裝 ,翻開(kāi)包裝即可用 ,2% NaOH5%鹽酸

29、溶液浸泡 30消毒細(xì)胞培育的最大危急是發(fā)生培育物的細(xì)菌 ,真菌和病毒等微生物的污染.污染主要是由于操作者的疏忽而引起 ,常見(jiàn)的緣由有操作間或四周空間的不潔,培育器皿和培育液消毒不合格或不徹底 .由于有關(guān)培育的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培育失敗 ,故細(xì)胞培育的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)防止發(fā)生污染 . 消毒方法分為三類 :物理滅菌法 (紫外線,濕熱,干烤,過(guò)濾等),化學(xué)滅菌法(各種化學(xué)消毒劑)和抗生素.氣中大局部細(xì)菌 ,培育室紫外線燈應(yīng)距地面不超過(guò) 2.5 米,且消毒進(jìn)物品不宜相互遮檔 ,照耀不到的地方起不到消毒作用 .紫外線可產(chǎn)生臭氧 ,污染空氣,法.溫?zé)嵯緯r(shí) ,消毒物品不能裝得過(guò)滿 ,以防止

30、消毒器內(nèi)氣體堵塞而千百作者不能離開(kāi)工作崗位 ,要定時(shí)檢查壓力及安全 ,防止消毒及表皮意外大事發(fā)生.常用物品消毒壓力準(zhǔn)時(shí)間 :培育液,平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體:121,15磅,20分鐘; 布類,玻璃制品,金屬器械等物品 :先 121, 15 磅, 20 分鐘,然后在烘箱中烘干; 玻璃瓶:干熱滅菌 170, 4 小時(shí).70%1操作者的皮膚 , 操作臺(tái)外表及無(wú)菌室內(nèi)的壁面處理 .后者則主要用器械的常用物品細(xì)胞培育基目前,市場(chǎng)上可供給干粉培育基和液體培育基 .干粉培育基需使用者自體培育基是由專業(yè)產(chǎn)家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn) ,不僅質(zhì)量得到保證 ,而且使用格外便利.常用的培育基種類及其應(yīng)用見(jiàn)下表 :培育基

31、種類 應(yīng)用細(xì)胞RPMI-1640( 標(biāo)準(zhǔn)型) 主要用于懸浮細(xì)胞培育DMEM-DMEM-IMDMMcCoys 5AM199F10血清平衡鹽液體PBS(Phosphate-Buffered Sallines)DPBS(Dulbecco”s Phosphate-Buffered Sallines)成分 含量(g/L)0.10KCl 0.20KH2PO4 0.20MgCl2 6H2O 0.10NaCl 8.00Na2HPO4 7H2O 2.16Hanks” 平衡鹽溶液 (Hanks” Balanced Salt Solutions,HBSS)成分 含量(g/L)0.14KCl 0.40KH2PO4 0

32、.06MgCl2 6H2O 0.1011MgSO4 7H2O 0.10NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01D-Hanks” 平衡鹽溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)成分 含量(g/L)KCl 0.40KH2PO4 0.06NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01消化液:分別組織和分散細(xì)胞 .常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉 (EDTA)(1)胰蛋白酶(簡(jiǎn)稱胰酶)是一種黃白色

33、粉末 ,易潮解,應(yīng)放置冷暗枯燥處保存.目前應(yīng)用的胰蛋白酶主要來(lái)自?；蜇i的胰腺.胰酶的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解 ,使細(xì)胞相互離散 .胰酶對(duì)細(xì)胞的分別作用與細(xì)胞的種類和細(xì)胞的特性有親熱關(guān)系 .一般來(lái)講,胰酶濃度大 ,作用溫度高 ,作用時(shí)間長(zhǎng) , 對(duì)細(xì)胞分別力量也大 ,但超過(guò)肯定的限度會(huì)損傷細(xì)胞 .胰酶溶液在 pH8.0,溫度為37時(shí),作用力量最強(qiáng).留意:鈣離子,鎂離子和血清蛋白的存在會(huì)降低胰酶活力.因此,胰酶溶液常用無(wú) Ca2+,Mg2+ 的D-Hanks” 平衡鹽溶液配制成0.25%溶液.消化細(xì)胞時(shí) ,參加一些血清或含血清的培育液 ,或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的消化作用 .胰蛋白

34、酶溶液配制 :稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中 ,先用少許 D-Hanks(pH7.2D-Hanks4次日,先用濾紙粗濾 ,再進(jìn)展過(guò)濾除菌 ,分裝入瓶中 ,低溫冰箱保存?zhèn)溆?常用濃度為 0.25% 或 0.125%.氫鈉溶液調(diào) pH7.220失效.EDTA4Na 溶液EDTA低廉,使用便利 .常用工作液濃度為 0.02%. 通常與 0.25%1:1EDTAHanks干凈,因殘留的 EDTAEDTAD-HBSS平衡鹽溶液溶解后 ,高壓蒸汽滅菌 ,分裝成小瓶 ,室溫或 4冰箱保存 . 胰蛋EDTA 4Na 溶液(0.05%0.53mM EDTA 4Na) 4Na+1L D-HBSS.- 20冰箱中保存 .pHNaHCO3 溶液常用濃度為 7.5%.,4冰箱或pH10%CO2法調(diào)整.HEPES( 分子量 238.31)HEPES 使用終濃度一般為 10-50mM, 但通常配成 1M200ml蒸水溶解 47.6HEPES,1N NaOH 調(diào)整 pH7.5-8.0;裝小瓶,室溫或 4保存. 抗生素溶液酚紅:大多數(shù)培育液中使用酚紅作為 pHpH,性 pH