透明質(zhì)酸寡糖逆轉(zhuǎn)MCF7ADM耐藥及促凋亡作用研究

1、透明質(zhì)酸寡糖逆轉(zhuǎn)MCF?7/ADM耐藥及促凋亡作用研究王麗萍王寶中司海運趙春亭隋振霞【摘要】目的研究透明質(zhì)酸寡糖逆轉(zhuǎn)F?7/AD細(xì)胞耐藥的作用。要領(lǐng)TT法研究透明質(zhì)酸寡糖對F?7/AD耐藥逆轉(zhuǎn)作用，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞外貌耐藥相干卵白P?gp、RP的表達(dá)及凋亡調(diào)控卵白p53、bl?2的表達(dá)。結(jié)果透明質(zhì)酸寡糖可進(jìn)步F?7/AD對化療藥的敏感性，使P?gp、RP表達(dá)落落，p53表達(dá)增高。結(jié)論透明質(zhì)酸寡糖可部門逆轉(zhuǎn)F?7/AD耐藥及促進(jìn)凋亡的作用?！娟P(guān)鍵詞】透明質(zhì)酸寡糖F?7/AD逆轉(zhuǎn)耐藥凋亡腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性是腫瘤治療失敗的緊張緣故原由，落服多藥耐藥性的要領(lǐng)之一是利用逆轉(zhuǎn)劑1，2。如今

2、雖已尋到很多逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的藥物，但是，或由于結(jié)果不敷滿足，或其毒副作用較大，很難在臨床推廣。本實行利用人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞系，以TT法、流式細(xì)胞術(shù)，研究透明質(zhì)酸寡糖hyalurnateligers，lig?HA對耐藥細(xì)胞的增敏及耐藥逆轉(zhuǎn)作用，并從低落膜外貌轉(zhuǎn)運卵白表達(dá)，促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡的角度探究其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制，以期能探求到逆轉(zhuǎn)DR作用強、毒性小的藥物。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1質(zhì)料乳腺癌F?7/S敏感細(xì)胞及對阿霉素耐藥F?7/AD細(xì)胞，源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所。細(xì)胞造就于ID造就液中，含10胎牛血清，試驗用對數(shù)生恒久細(xì)胞。PE?P?gp單抗、PE?RP單抗、FIT?bl?2單抗、FIT?p

3、53單抗，均為美國BisienesPharingen產(chǎn)物；lig?HA.2500Da和TT別離為SEikagaku公司、Siga公司產(chǎn)物。EL340i型酶聯(lián)免疫儀，美國Bitk公司；FASaliber型流式細(xì)胞儀，美國BD公司。1.2要領(lǐng)取對數(shù)生恒久的F?7AD細(xì)胞系，均隨機分為實行孔和比較孔，各組實行孔和比較孔別離設(shè)6個復(fù)孔，每組實行重復(fù)3次。此中實行孔參加差異濃度50g/l、100g/l、150g/l的透明質(zhì)酸寡糖以下均用HA1、HA2和HA3表現(xiàn)。比較組不加任何試劑或加等體積的造就液。各實行孔細(xì)胞均與lig?HA共造就48h后，網(wǎng)絡(luò)并舉行以下各試驗。將上述經(jīng)lig?HA作用后的實行組細(xì)胞

4、和比較組細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)后，以5104接種于96孔板中，每孔190l375%2、飽和濕度的條件下造就24h，然后參加差異濃度梯度的抗癌藥物另設(shè)空缺比較孔及調(diào)零孔，每濃度設(shè)6個復(fù)孔。在造就箱里讓細(xì)胞與藥物作用48h。每孔參加101的TT，繼承造就3h，棄上清，每孔參加DS100l，振蕩使甲瞻晶體充實溶解后，用酶標(biāo)儀(波長490n)檢測D值；然后盤算各組的細(xì)胞存活率、殞命率及耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。細(xì)胞存活率=實行組D比較組D100細(xì)胞殞命率=(1-實行組D比較組D)100耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=逆轉(zhuǎn)劑加抗癌藥物組細(xì)胞殞命率抗癌藥物組細(xì)胞殞命率別離向上述實行孔和比較孔細(xì)胞中參加終濃度為10gl的阿霉素。在原細(xì)胞造就條件下，繼

5、承造就3h,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)AD的相對熒光強度。網(wǎng)絡(luò)上述造就的各組實行孔和比較孔細(xì)胞并調(diào)治濃度為1106l，參加PE標(biāo)識表記標(biāo)幟的P?gp抗體20l，37避光胞膜染色30in，流式細(xì)胞儀檢測均勻熒光強度。細(xì)胞造就及實行分組同上，別離參加FIT標(biāo)識表記標(biāo)幟的bl?2及p53抗體20l，流式細(xì)胞儀檢測均勻熒光強度。接納SPSSl00軟件包舉行統(tǒng)計學(xué)處置懲罰。數(shù)據(jù)用均數(shù)尺度差(xs)表現(xiàn)，計量資料用配對t查驗，以P005作為明顯邊界。2結(jié)果2.1lig?HA加強耐藥細(xì)胞對阿霉素的敏感性差異濃度lig?HA均能顯著增長耐藥細(xì)胞F?7/AD對AD的敏感性，增長耐藥細(xì)胞殞命率，與比較組比力差異有明顯

6、性(P005)，增敏倍數(shù)別離為1.48、2.04、1.89;別的，F(xiàn)?7/AD與F?7/S組間各細(xì)胞殞命率比力，差異亦均具統(tǒng)計學(xué)意義(P005)(見表1)。2.2lig?HA增長胞內(nèi)AD積蓄流式細(xì)胞儀檢測104個耐藥細(xì)胞內(nèi)AD的相對熒光強度，HA1+AD、HA2+AD、HA3+AD組熒光值別離為15.78119、19.34065和19.57161；雷同造就基的F?7/AD中直接加AD組比較組熒光值為1268054。結(jié)果表白，三組均能顯著增長AD在細(xì)胞內(nèi)含量，使AD胞內(nèi)積聚增長121、1.44和143倍，與比較組比力有明顯性意義(P005)；別的，HA2、HA3劑量組間未表現(xiàn)有顯著的差異(P00

7、5)；HA1與另兩組比力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P005)。2.3lig?HA對耐藥相干卵白及凋亡調(diào)控卵白的作用見表2。與比較組細(xì)胞比力，各濃度lig?HA均能顯著低落膜外貌P?gp、RP表達(dá)(P值均005)，此中，HA2與HA3組間未表現(xiàn)有顯著的差異(P005)。別的，HA2、HA3濃度組均可上調(diào)凋亡調(diào)控卵白p53表達(dá)(P值均005)；且各組均對bl?2表達(dá)無顯著作用(P005)，說明各濃度lig?HA均有必然程度低落膜外貌耐藥卵白表達(dá)及促耐藥細(xì)胞凋亡的作用。3討論如今研究已證明，P?gp高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生氣制之一，P?gp是一種能量依靠性藥物排擠泵，通過ATP供給能量，可將抗腫瘤藥物

8、由細(xì)胞內(nèi)泵出，使其細(xì)胞毒作用削弱或消散，而導(dǎo)致化療失敗。比來，研究職員創(chuàng)造先前被以為在細(xì)胞中起到布局性和惰性作用的透明質(zhì)酸，終究上是引發(fā)癌細(xì)胞抗藥反響的關(guān)鍵物質(zhì)，透明質(zhì)酸能和其受體卵白D44結(jié)合，與磷酸肌醇?3激酶一起，促使癌細(xì)胞增長天生，能把藥物運輸出細(xì)胞的卵白質(zhì)如P?gp，從而使癌細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性3，4。癌細(xì)胞中透明質(zhì)酸的量越多，抗藥性就越強。因此假設(shè)可以或許阻斷這一環(huán)節(jié)，大概增敏化療藥物抗性的癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。多糖低聚物或單抗能與透明質(zhì)酸的一個受體D44結(jié)歸并制止它啟動一種大概導(dǎo)致藥物抗性的信號級聯(lián)，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。尚有文獻(xiàn)報道，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生氣制涉及腫瘤按捺卵白p53的失活

9、，誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的凋亡大概對改進(jìn)耐藥細(xì)胞的對藥性有必然作用5，6。bl?2和p53均為凋亡調(diào)控卵白，bl?2按捺腫瘤細(xì)胞凋亡，p53促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，p53表達(dá)上調(diào)或bl?2下調(diào)，均能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而到達(dá)必然程度逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。本實行從阻斷信號傳導(dǎo)和促進(jìn)凋亡兩方面來研究lig?HA對耐藥細(xì)胞系逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，為臨床應(yīng)用提供理論基矗我們的研究表白透明質(zhì)酸寡糖的干預(yù)能加強化療藥AD對F?7/AD的敏感性，使AD對耐藥細(xì)胞的殺傷性增大，并可增長胞內(nèi)化療藥物濃度，以逆轉(zhuǎn)F?7/AD細(xì)胞的耐藥性。同時創(chuàng)造隨著透明質(zhì)酸寡糖濃度(50g/l150g/l)的增大，耐藥腫瘤細(xì)胞殞命率漸漸增高，且胞內(nèi)阿霉素

10、的濃度亦增多，逆轉(zhuǎn)本領(lǐng)漸漸加強。別的，我們創(chuàng)造顛末處置懲罰后的耐藥細(xì)胞，耐藥卵白P?gp、RP的表達(dá)率顯著低落；透明質(zhì)酸寡糖濃度在50g/l時p53的表達(dá)無顯著上調(diào)，但隨濃度的進(jìn)步，p53表達(dá)顯著上調(diào)。從而提示透明質(zhì)酸寡糖大概通過按捺DR卵白的表達(dá)、調(diào)控凋亡卵白來逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對AD的耐藥，且上調(diào)凋亡卵白的透明質(zhì)酸寡糖濃度應(yīng)大于50g/l。綜上所述，臨床應(yīng)用透明質(zhì)酸拮抗劑如小分子的透明質(zhì)酸寡糖可以或許逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞藥物抗性。我們可以假想將這種透明質(zhì)酸拮抗劑與化療相結(jié)合，大概會到達(dá)更好的治療結(jié)果?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1GttesanHanerellsevadehetherapy:SixteenthRihardan

11、dHindaRisenthalfundatinaardletureJ.anerRes,1993，53(4)：747-7512StellerHehanistnsandgenesfellularsuiideJSiene,1995,2675203：1445-14493israS,GhatakS,Zltan?JnesA,etal.RegulatinfultidrugresistaneinanerellsbyhyalurnanJ.JBilhe,2022,278(28):25285-25288.4Sunitiisra，ShibnathGhatak,BryanPTle.RegulatinfDR1expressinanddrugresistanebyapsitivefeedbaklpInvlvinghyalurnan,phsphinsitide3?Kinase,andErbB2J.JBilhe,2022,280(21):20310-20315.5劉