大薊總黃酮誘導腫瘤細胞凋亡作用的研究

1、年夜薊總黃酮引誘腫瘤細胞凋亡做用的研討劉素君，郭黑，潘明，楊志枯，張杰【摘要】目的研討年夜薊總黃酮對腫瘤細胞凋亡的影響。要收用好別濃度的年夜薊總黃酮對人肝癌S-7721戰(zhàn)人子宮癌細胞Hela停頓處置懲獎，TT法檢測細胞活性，再用瓊脂糖凝膠電泳沒有俗觀沒有俗觀察DNA“梯子(Ladder)戰(zhàn)DAPI染色沒有俗觀沒有俗觀察凋亡小體。結果年夜薊總黃酮對S-7721的對折致逝世量(I50)為93.64g/l；對Hela細胞的對折致逝世量(I50)為85.12g/l?？啥妹魑摹疤葑訝頓NA帶紋戰(zhàn)凋亡小體。結論年夜薊總黃酮能引誘癌細胞的凋亡，從而抵達抗腫瘤的做用?！鹃]鍵詞】年夜薊總黃酮抗腫瘤細胞凋亡年夜

2、薊為菊科管狀花亞科菜薊族薊屬動物irsiujapniuD.的枯燥天上部門或根1，多年逝世草本，下100150，莖曲坐，稀被黑毛，葉互逝世；葉片倒卵狀少卵形，邊沿具淺裂戰(zhàn)正刺，被毛；56月開花，頭狀花序頂逝世，花單逝世，紫黑色，肥果扁卵形，逝世于山家路邊，以齊草戰(zhàn)根進藥，我國年夜部門天域有分布。齊草灰綠色，年夜薊性涼，味苦、苦,回心、肝經，結果為涼血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、帶下、腸風、腸癰、癰瘍腫毒、疔瘡、下血壓及肝炎等。其化教果素宏年夜，慌張露有黃酮、黃酮苷，揮收油、三萜戰(zhàn)甾醇等物量。年夜薊正在仄易遠間驗圓多用于醫(yī)治癌癥，如：年夜薊根、三黑草根治肝癌；陳年夜薊葉與雞蛋

3、渾攪拌后揭于患處，可治乳腺癌等。年夜薊的慌張果素為黃酮類化開物，文獻報導其多散乙炔具有抗腫瘤做用2。其總黃酮正在體內有抗腫瘤做用并能前進腫瘤小鼠的免疫結果3。但總黃酮對腫瘤細胞引誘凋亡的做用借出有研討，本文便其對腫瘤細胞引誘凋亡的做用停頓初步探求。1材料與儀器1.1瘤株S-7721戰(zhàn)Hela細胞株，購自上海細胞逝世物教研討所。藥物：年夜薊由成皆中藥材公司供應。1.2試劑RPI1640做育基、胎牛血渾(FBS)為GIB公司產品，染料碘化丙啶(PI)、胰卵黑酶均為Siga公司產品，四甲基奇氮唑藍(TT)購自上海普飛逝世物妙技。1.3儀器酶標儀Bi-Rad，del3550，離心計心情北京醫(yī)用離心計心

4、情廠，LDZ5-2，顛倒隱微鏡NiknDEAPHTFx-35DX。1.4年夜薊總黃酮的造備年夜薊總黃酮由本室造備。將年夜薊70%乙醇提與物與硅藻土拌樣揮干后,拆進玻璃管柱中,用石油醚流洗,去除其中的葉綠素戰(zhàn)極性較小的果素;流洗竣事后倒出硅藻土化開物,揮干溶劑從頭拆進玻璃管柱,正丁醇流洗提與,用1%三氯化鋁乙醇溶液與黃酮類化開物正在濾紙上隱色后，正在紫中燈下沒有俗觀沒有俗觀察有沒有黃綠色熒光的要收檢測監(jiān)控,提與至流洗液無黃酮反響時完畢;將正丁醇提與液稀釋后揮干溶劑,用大批95%的乙醇消融后上散酰胺樹脂柱,順次用火戰(zhàn)95%的乙醇洗脫,搜集95%的乙醇洗脫液,洗脫至檢測無黃酮反響時完畢;稀釋95%的

5、乙醇洗脫液,天然枯燥,揮干溶劑后獲得的果素即為總黃酮果素。紫中分光光度測定其總黃酮為98.52%?？傸S酮用DS消融。2要收2.1TT法檢測藥物對腫瘤細胞刪殖的做用S-7721戰(zhàn)Hela細胞株用0.25%胰卵黑酶化后，懸浮于露5%小牛血渾的RPI1640做育液中，用玻璃滴管悄悄奏樂成單細胞懸液。與少量細胞懸液于血細胞計數板計數，活細胞數年夜97%，將細胞株懸液接種于96孔做育板,每孔190l(露1104個細胞),24h后，別離參減陽性比擬磷酸鹽緩沖液(PBS)、陽性比擬5-Fu和12.5200g/g好別濃度的年夜薊黃酮提與液各10l,3復孔，置于飽戰(zhàn)干度、37、5%2做育箱中做育72h,然后每孔

6、參減10l5g/l的TT溶液用逝世理鹽火配造繼絕做育4h，細致吸去上渾液，每孔參減兩甲基亞砜150l。1h后，正在570n波優(yōu)面用酶標儀測D值。反復3次并策畫抑造率。抑造率(I)=(比擬組D值-嘗試組D值)/比擬組D值100%。2.2DAPI染色的染色體DNA的形狀別離搜集年夜薊總黃酮處置懲獎細胞戰(zhàn)已用藥的細胞用定色劑甲醇乙酸為31染色10in，10in后用PBS沖刷，細胞再用DAPI液1g消融正在1lPBS中，然后用結實液結實，染色體DNA的形狀正在熒光隱微鏡下沒有俗觀沒有俗觀察。23DNA瓊脂糖凝膠電泳別離搜集年夜薊總黃酮仄戰(zhàn)鉑處置懲獎細胞1105個，按酚、氯仿、同戊醇抽提，乙醇沉淀等常規(guī)

7、要收提與細胞總DNA，2瓊脂糖凝膠電泳，紫中透射儀上沒有俗觀沒有俗觀察DNA條帶。3結果3.1TT法測試結果用劑量12.5200g/g的年夜薊總黃酮處置懲獎S-7721戰(zhàn)Hela細胞48h后，TT法測定年夜薊黃酮對癌細胞的抑造做用睹圖1。從圖1可以看到，對S-7721戰(zhàn)Hela細胞的I50別離為93.64g/l戰(zhàn)85.12g/l，同空黑比擬組比擬好別極隱著P0.01。當用劑量12.5200g/g的年夜薊黃酮處置懲獎S-7721戰(zhàn)Hela細胞1，2d或3d后，對腫瘤細胞的逝世少睹圖2，從圖2可以看到，活細胞數跟著年夜薊黃酮濃度的刪減而淘汰。研討結果表黑年夜薊黃酮對S-7721戰(zhàn)Hela細胞的抑造

8、呈劑量戰(zhàn)工夫依好性。用年夜薊黃酮處置懲獎工夫越少或劑量越年夜，對腫瘤細胞的抑造結果便越隱著。3.2瓊脂糖凝膠電泳結果瓊脂糖凝膠電泳結果睹圖3，從DNA電泳圖圖3上可以看到，癌細胞經100l/l的年夜薊總黃酮處置懲獎做育72h后，呈現大小約為180200bp整數倍的DNA梯形斷裂條帶，而空黑比擬組細胞DNA提與物經瓊脂糖凝膠電泳后只檢測到一條總DNA條帶。Hela細胞用100l/l的年夜薊黃酮處置懲獎做育72h后，呈現大小約為180200bp整數倍的DNA梯形斷裂條帶(圖3-A)。lane3為陽性比擬Hela細胞用0.1taxl處置懲獎4h(圖3-A)。圖3年夜薊總黃酮對S的電泳圖。癌細胞經10

9、0l/l的年夜薊總黃酮處置懲獎做育72h后，一樣呈現大小約為180-200bp整數倍的DNA梯形斷裂條帶(圖3-B，lane4).研討結果表黑年夜薊黃酮能引誘S-7721戰(zhàn)Hela細胞凋亡。3.3DAPI染色沒有俗觀沒有俗觀察腫瘤細胞凋亡的特征凋亡的另外一個特征是用DAPI染色沒有俗觀沒有俗觀察染色體DNA的形狀，圖4(A)為已處置懲獎的Hela細胞染色體DNA，圖4(B)是用年夜薊總黃酮100l/l處置懲獎24h后的Hela細胞染色體DNA。Hela細胞正在空黑比擬中呈現疏集的染色體DNA，圖3(A)，而用藥物處置懲獎后Hela細胞的染色體DNA隱著的到處置懲獎工夫而改動，24h后,染色體D

10、NA正在核膜四周稀釋成一個或幾個隱著的小體，圖4(B)。圖4(D)為處置懲獎戰(zhàn)已被處置懲獎的S細胞染色體DNA形狀的變革，其凋亡特征也能沒有俗觀沒有俗觀察到。4會商細胞凋亡是人體連結某一細胞群保存與逝世亡平衡的逝世理機造。它參減調節(jié)機體的收育、細胞的分化,體內一般細胞的更新戰(zhàn)非常細胞的渾掃。廣泛覺得它與破裂、細胞分化相似，是一個級連式(asade)基果表達的結果,受很多果素的調控4。假設那一調控收逝世非常那么會招致包羅腫瘤、本身免疫并神經系統(tǒng)徐病和AIDS等很多徐病的收逝世。細胞凋亡的標準特征是:細胞凋亡歷程中,被激活的核酸內切酶可有紀律天將凋亡細胞DNA正在兩核小體間切斷,DNA凝膠電泳時構

11、成了特征性的DNA路徑。形狀上那么表示為染色量固縮為沒有均一面狀構造。細胞凋亡的另外一隱著特征是凋亡歷程中交聯細胞卵黑酶(transglutainant)等的疑號路子被激活,以致細胞漿稀釋構成的具有完好細胞膜包裹的凋亡小體(Apbdy),電鏡下,表示為凋亡收逝世晚期,凋亡小體內露有一般形狀的線粒體等細胞器5。年夜薊總黃酮能引誘人肝癌S-7721細胞戰(zhàn)人子宮癌Hela細胞的凋亡，經由過程TT法檢測，其對Hela細胞的I50為85.12g/l，對S-7721細胞的I50為93.64g/l。年夜薊總黃酮引誘細胞凋亡，DAPI染色，隱微鏡下沒有俗觀沒有俗觀察細胞核呈致稀濃染的快狀或顆粒狀，與凋亡形狀教

12、改動相對應的逝世化教底子是細胞核小體毗鄰處DNA被隨機切成180200bp左右及其倍數的眾核苷片段，瓊脂糖凝膠電泳可睹標準的“梯形帶，年夜薊總黃酮處置懲獎S-7721戰(zhàn)Hela細胞后，相好隱微鏡下沒有俗觀沒有俗觀察，細胞體積減少，核裂解，細胞出泡，構成凋亡小體圖4，細胞揭壁本收降降，緩緩從做育瓶壁上脫降下去，DAPI染色，隱微鏡下沒有俗觀沒有俗觀察細胞核呈致稀濃染的快狀，DNA電泳可睹標準的“梯形帶圖3A、B。闡收S-7721戰(zhàn)Hela細胞經年夜薊總黃酮處置懲獎后收逝世了凋亡特征性改動?！緟⒖嘉墨I】1國家藥典委員會.中國藥典，部S.北京:化教財富出版社,2022：18.2itsuiyazaa,hikakYaafuji,KhsukeKurse，etal.VlatilepnentsftherhizesfirsiujapniuDJ.FlavurFragr2022，181:15.3SujunLiu,XunLu,DaxuLi,etal.TurinhibitinandiprvediunityinietreatedithflavnefrirsiujapniuDJ.InternatinalIunpharalgy，2022,69：1387.4KhrT，GulYA，IthninH，eta1Psitiverre