葛根素對糖尿病腎病大鼠內(nèi)皮素表達的影響

1、葛根素對糖尿病腎病大鼠內(nèi)皮素表達的影響【關(guān)鍵詞】葛根素；,糖尿病腎病模型；,內(nèi)皮素摘要：目的觀察葛根素對糖尿病腎病內(nèi)皮素表達的影響。方法利用鏈脲佐菌素腹腔注射法誘導建立1型糖尿病大鼠模型,將實驗用SD大鼠隨機分正常對照組、糖尿病組、葛根素治療組。治療12周，觀察治療期間及治療后大鼠的一般狀況、血糖、尿素氮、血肌酐，內(nèi)生肌酐去除率、24h尿蛋白排泄率，免疫組織化學檢測腎小球ET表達。結(jié)果造模組大鼠均出現(xiàn)腎臟功能損害；葛根素能改善根本狀況，降低糖尿病大鼠的尿素氮、血肌酐、24h尿白蛋白排泄率，增加內(nèi)生肌酐去除率，ET表達顯著降低。結(jié)論葛根素具有確切的腎臟保護作用。關(guān)鍵詞：葛根素；糖尿病腎病模型；內(nèi)

2、皮素EffetfPuerarinntheExpressinfEndthelininStreptztin-InduedDiabetiNephrpathyRatsAbstrat：bjetiveTbservetheeffetfpuerarinnendthelinfstreptztin-indueddiabetirats.ethdsDiabetinephrpathyratsereinduedbyintraperitnealinjetinfSTZ.Ratseredividedintnralntrlgrup,delgrup,andPueraringrupfr12eeks.Duringandafterthe

3、treatent,thegeneralstate,bldgluselevels,bldureanitrgen,serureatinine,urinaryalbuinexretinratefthe24-hurs，andlearaneratefreatinine，asellasendthelineredetetedbyiunhistheialtehnlgyindifferentgrups.ResultsDiabetesellitusandrenalfuntinlesinurredinthetdelgrups.Puerarinuldiprvethegeneralstate,dereasebldure

4、anitrgen,serureatinine,andurinaryalbuinexretinratefthe24-hurs,inreaselearaneratefreatinine,theexpressinfendthelininthekidneyassignifiantlyinhibitedatthesaetie.nlusinPuerarinhasertainprtetiveeffetnrenalfuntin.Keyrds：Puerarin;Diabetinephrpathydels;Endthelin糖尿病腎病(diabetinephrpathy，DN)是嚴重的常見糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，

5、是造成終末期腎功能衰竭的最常見原因。假設(shè)在腎病早期階段進展有效干預治療，有希望延緩甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病的開展。內(nèi)皮素(Endthelin，ET)主要由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，是目前作用最強和維持時間最持久的一種縮血管物質(zhì)，是調(diào)節(jié)血管通透性的重要因子，是一種血管收縮和促有絲分裂肽，它在體內(nèi)外均可影響腎臟構(gòu)造和功能，已經(jīng)有動物模型證實糖尿病與血漿和尿內(nèi)皮素增高有關(guān)。此種增高很可能與糖尿病的特征性變化和腎損傷相關(guān)聯(lián)，在糖尿病腎病早期病理變化的研究中是重要指征。多年研究證明，在糖尿病持續(xù)高糖狀態(tài)下，體內(nèi)氧化應激(xidativestress)和非酶糖基化(糖基化)反響均很明顯，在糖尿病腎病發(fā)病中起重要作用1，2，

6、抑制氧化糖基化可能延緩或減輕糖尿病腎臟并發(fā)癥，故我們擬以藥物抑制糖基化和氧化應激兩個方面為出發(fā)點，結(jié)合葛根素Puerarin的作用機理，作者試用葛根素對模型糖尿病大鼠進展干預，以明確葛根素對糖尿病腎病發(fā)生、開展的影響，通過對糖尿病大鼠腎組織免疫組織化學的研究，觀察葛根素對腎小球ET表達的影響，為擴大該藥的臨床應用范圍提供實驗根據(jù)。1材料與方法1.1動物雄性SD大鼠50只，2月齡，體重200250g，清潔級；由湖南農(nóng)業(yè)大學動物部提供。實驗期間自由飲水，攝食飼料為中南大學動物中心提供的混合飼料，適應性喂養(yǎng)1周后進展實驗。室溫1828，相對濕度62%80%。1.2儀器與試劑怡成SENTEST手持式快

7、速全血葡萄糖測試儀，日麗7170型自動生化，F(xiàn)J-2022型免疫細胞記數(shù)儀國營二六二廠消費，葛根素Puerarin，棕黃色粉末(純度90%),由湖南金農(nóng)生物資源股份提供;S-P免疫組化染色試劑盒、兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子(anti-Fibrnetin,anti-ET抗體由武漢博士德生物公司提供。鏈脲佐菌素(Streptztin,STZ,Siga,.USA);將0.1l/L檸檬酸鈉緩沖液pH4.5配成0.45%之溶液，使用前經(jīng)微孔濾過除菌。免疫組化染色載玻片洗凈，枯燥分別放入以1：10比例去離子稀釋的多聚氨酸及多聚氨酸含有1/1000DEP的溶液中，浸泡5in，60烤箱烘烤1h枯燥，裝盒，備用。1

8、.3方法1.3.1動物建模50只大鼠預養(yǎng)1周后，空腹12h，腹腔注射1%STZ-檸檬酸鈉緩沖液STZ60g/kg體重。對照組注射等量檸檬酸鈉緩沖液，根據(jù)72h后尿糖+，靜脈采血測血糖怡成全血葡萄糖測試儀血糖16.7l/L者，確定模型建立，納入本實驗。除去造模失敗及死亡大鼠，將30只糖尿病鼠納入本實驗。1.3.2分組糖尿病鼠隨機分為正常對照組N組10只；糖尿病組D組10只；葛根素治療組D+P組10只。葛根素組每只腹腔注射葛根素80g/(kgd)，均連續(xù)給藥12周。各組為了防止酮癥和維持糖尿病鼠的生存。組隔日腹腔注射長效胰島素24單位，并斷尾取血測大鼠血糖，使血糖波動在25l/L左右，實驗共12周

9、。1.4標本采集第16周實驗終止時，各組大鼠在禁食的根底上，用代謝籠搜集24h尿，測定尿白蛋白(UAE)含量，動物經(jīng)乙醚麻醉后稱體重，股動脈放血5l測大鼠血糖、尿素氮、血肌酐，計算內(nèi)生肌酐去除率。然后背部作縱形切口，取出腎臟，右腎稱重，取左側(cè)腎臟反復灌洗至發(fā)白，剔除包膜，橫斷切取約0.50.50.5柱狀體2塊，置于4%多聚甲醛含11000焦碳酸二乙酯中固定，固定12h，石蠟包埋，連續(xù)切片，4厚者用于HE染色，6厚者切片用于免疫組化染色。1.5觀察指標1.5.1動物一般情況觀察每日觀察大鼠飲食飲水量、精神狀態(tài)、活動情況、大便性狀及尿量、隔日測體重并加以記錄。連續(xù)2d記錄每只大鼠的飲水量、尿量用代

10、謝籠搜集尿液，取其平均值作為最終數(shù)據(jù)。1.5.2腎臟濕重去包膜后用精細天平稱重。1.5.3生化指標用全自動生化儀測血糖、尿素氮、血肌酐。1.5.4尿白蛋白排泄率urinaryalbuinexretin,UAE搜集24h尿液，用二甲苯防腐，混勻后取2l用免疫細胞記數(shù)儀測定。1.5.5腎小球濾過率GFR以內(nèi)生肌酐去除率為代表，GFR尿肌酐尿量/血肌酐。1.6免疫組化檢測操作步驟S-P免疫組化染色試劑盒采用生物系標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及低物色素混合液來測定細胞和組織中的抗原，染色主要過程如下：石蠟切片脫蠟和水化后，用PBSpH7.4沖洗3次，3in/次。根據(jù)抗體的要求，對

11、組織抗原用濃度為0.05%胰蛋白酶消化，消化時間為37,1040in，每張切片加1滴50u過氧化酶阻斷溶液試劑A，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫下孵育10in。PBS沖洗3次，3in/次。甩去PBS液，每張片加1滴或50l的非免疫性動物血清試劑B，室溫下孵育10in。甩去血清，每張切片加1滴或50l的第一抗體用戶自選，室溫下孵育60in或4過夜。PBS沖洗3次，3in/次。甩去PBS液，每張切片加1滴或50l的生物素標記的第二抗體試劑，室溫下孵育10in。PBS沖洗3次，3in/次。甩去PBS液，每加1滴或50l鏈霉菌抗生物-過氧化酶容液試劑D，室溫下孵育10in。PBS沖洗3次，3in/次

12、。甩去PBS液，每張切片加滴或100l新穎配制的DAB，顯微鏡下控制顯色時間，陽性顯色為棕色。自來水沖洗，蘇木素復染。0.1%Hl分化,0.1%氨水或PBS沖洗返藍。切片經(jīng)過梯度酒精脫水枯燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。陽性結(jié)果主要在胞漿顯棕黃色，以PBS代替一抗作陰性對照。免疫組化結(jié)果圖像分析：采用計算機顯微圖像處理系統(tǒng),在400放大倍數(shù)下每張片子隨機選取10個視野區(qū),對雜交信號結(jié)果進展灰度掃描,以其平均相對灰度值作為表達量的值(平均數(shù)標準差表示)。1.7免疫組化結(jié)果定性判別方法在顯微鏡下根據(jù)著色程度按以下標準斷定結(jié)果：1陰性：無黃色；2弱陽性：淡黃色；3陽性：黃色；4強陽性：深黃色或黃褐色。

13、1.8統(tǒng)計方法測定數(shù)值皆以s表示，統(tǒng)計分析在SPSS10.0軟件上進展。2結(jié)果2.1造模過程大鼠一般情況觀察正常組大鼠體重增加明顯，精神狀況良好，毛皮有光澤，動作自如，反響靈敏。糖尿病大鼠精神逐漸萎靡、明顯消瘦、多尿、多飲、早期多動，后期反響遲鈍、動作遲慢、弓背蛇體、多汗出、毛豎無光澤、小便量多，需換墊料12次/d；有1只視力下降；有2只白內(nèi)障；有1只出現(xiàn)反復腹瀉。治療各組精神狀況良好，無白內(nèi)障及尾、足壞死，動作自如，反響靈敏度較正常組稍差。2.2藥物對大鼠尿量、體重、腎重/體重、血糖的影響見表1。結(jié)果顯示，造模成功的大鼠體重與正常組比擬，明顯下降，尿量增加，血糖升高，差異顯著P0.05，治療

14、后，Puerarin藥物治療組與D組比擬，體重、腎重/體重有顯著進步P0.05。表1各組大鼠尿量、體重、腎重/體重、血糖的變化比擬略與N組比擬，aP0.05；與D組比擬，bP0.05；n=102.3藥物對大鼠尿白蛋白排泄率、血肌酐、肌酐去除率、尿素氮的影響見表2。結(jié)果顯示，造模成功的大鼠血清尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮較正常組明顯升高，內(nèi)生肌酐去除率下降，差異顯著P0.05，D組相比Puerarin治療組，尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮明顯升高，內(nèi)生肌酐去除率下降P0.05。表2各組大鼠尿白蛋白排泄率、血肌酐、肌酐去除率、尿素氮的變化比擬略與N組相較，aP0.05，與D組相較，bP0.05；

15、n=102.4藥物對大鼠腎小球內(nèi)皮素表達及血清糖化血紅蛋白的影響HE染色鏡下顯示，光鏡檢查各組大鼠腎小球及小管間質(zhì)未見明顯的病理改變。模型組大鼠腎組織可見腎小球明顯增大,腎小球細胞增生，散在腎小管上皮細胞腫脹變性、脫落，腎小球毛細血管基底膜彌漫性增厚。各用藥組中上述病理改變均有不同程度的減輕。免疫組化結(jié)果顯示：與正常組相比，糖尿病狀態(tài)下腎小球著色濃集，于腎小球系膜細胞、血管內(nèi)皮細胞及少量腎小管上皮細胞胞漿均可見棕黃色顆粒顏色加深且數(shù)量增多，腎小球血管外表內(nèi)皮素表達顯著上調(diào)，呈強陽性，經(jīng)灰度值測定兩組間差異有非常顯著性意義P0.05，治療后，Puerarin治療組腎組織著色較淺，與D組相比內(nèi)皮素

16、相對表達含量明顯下調(diào)，呈弱陽性P0.05。見表3及圖1。表3免疫組化各組大鼠腎小球ET表達的灰度值及血中糖化血紅蛋白的比擬略與N組相較，aP0.05，與D組相較，bP0.05；n=10圖1腎小球內(nèi)皮素免疫組化的圖片略轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論糖尿病腎病確實切發(fā)病機制尚不清楚，但證實有多種血流動力學與非血流動力學因素參與。有研究認為3，由于糖脂肪代謝紊亂導致微血管病變，而腎內(nèi)血流動力學改變直接參與DN的發(fā)生、開展。近年來，一些學者認為內(nèi)皮功能失調(diào)，對大分子物質(zhì)通透性增加和內(nèi)皮細胞增生，可能涉及糖尿病微血管并發(fā)癥和DN蛋白尿的發(fā)活力理4。內(nèi)皮素來源于血管內(nèi)皮細胞,是目前作用最強和維持時間最持久的

17、一種縮血管物質(zhì)，是調(diào)節(jié)血管通透性的重要因子,并與其他因子如血管表皮生長因子(VEGF)、N等共同作用，N是由NS催化L-精氨酸與氧內(nèi)皮素(ET)可能與此有關(guān)，是體內(nèi)重要的縮血管物質(zhì)。以往研究說明，糖尿病大鼠腎臟的ET信使核糖核酸(ETRNA)含量增加5，腎臟ET的合成和分泌增多5，ET受體拮抗藥可以使糖尿病大鼠的蛋白尿減少7。ET系統(tǒng)已被證實能通過促使血管收縮、促進細胞增殖及增加腎小球系膜細胞外基質(zhì)合成等機制參與DN進展，其中ET活性最強。研究說明，ET強烈的縮血管效應，可以影響腎臟的血流動力學，使腎臟的血流量減少；ET可刺激血管緊張肽(Ang)和血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶(AE)的產(chǎn)生，而Ang又可增

18、加腎內(nèi)ET的含量,協(xié)同引起血管收縮、系膜增生、細胞外基質(zhì)(E)堆積及基底膜增厚；更重要的是ET-1可以通過ET受體A(ETAR)誘導TGF產(chǎn)生，血管內(nèi)皮素(ET)增多是糖尿病腎病早期微量蛋白尿的原因之一，并與其他因素一起參與腎小球硬化。因此,ET可能成為防治糖尿病腎病的更為特異的新靶點對阻斷ET合成或生物學作用具有重要意義。研究說明8，與DN發(fā)病親密相關(guān)因素如高血糖、氧化應激、AGEs和血管緊張素，TGF1均能誘導ET的產(chǎn)生和分泌。葛根素對糖尿病腎病有治療作用9,但其確切機制未明。已有充分證據(jù)說明，體內(nèi)高濃度葡萄糖與蛋白質(zhì)發(fā)生非酶化促糖反響糖基化及由此形成AGEs在糖尿病腎病的發(fā)生中起重要的作

19、用10。糖基化和氧化是兩個親密相連的生化過程，兩者互相促進，可能協(xié)同參與糖尿病腎病的發(fā)病過程。UAE是DN診斷的金標準11，ET和UAE的結(jié)合檢測可能作為DN的監(jiān)控指標，糖尿病腎病的臨床診斷根據(jù)白蛋白尿的出現(xiàn)，而HbA1程度在一定程度上反響體內(nèi)AGEs的程度12。本研究證明，糖尿病組大鼠在注射STZ16周后BUN，r，尿蛋白及肥大指數(shù)均明顯高于對照組,提示已有糖尿病腎病發(fā)生。近年來，更多的研究者在尋找維護內(nèi)皮細胞功能正常，免受氧化糖基化和炎性因子損傷的藥物，葛根是豆科植物野葛或甘葛藤的枯燥根,其主要有效成分即為Pue，化學名為4,7二羥基8D葡萄糖異黃酮。Pue具有毒性孝半衰期短、可經(jīng)多種途徑

20、排泄、不易在體內(nèi)積蓄的特點?，F(xiàn)代藥理研究說明，其能降低血液黏度，抑制血小板凝集，降低血栓素A2的程度，并能使明顯增高的血漿內(nèi)皮素、血管緊張素及腎素活性降低，從而擴張微動脈，改善腎小球的缺血、缺氧及高凝狀態(tài)，可去除糖基化反響所產(chǎn)生的自由基，可以抑制酮亞胺經(jīng)氧化產(chǎn)生的二羰基中間產(chǎn)物，并可減少氧化應激，到達有效抗氧化，進而抑制AGEs。已有報道13，葛根素可抑制體外非酶促糖化反響的棕色產(chǎn)物及熒光產(chǎn)物形成量?，F(xiàn)有研究資料進一步說明14，葛根素和氨基胍AG抑制糖尿病大鼠體內(nèi)AGEs形成的作用相近，是目前公認的作用最強的糖基化阻斷劑，但由于AG的毒副作用目前臨床還未被使用15。本研究證實經(jīng)葛根素治療的糖尿

21、病大鼠ET免疫組化結(jié)果均較模型組明顯為輕，提示葛根素可以抑制ET的作用，從而延緩DN發(fā)生開展的病理進程，葛根素可使大鼠一般情況改善，體重增加；ET表達減弱，尿量和腎重/體重比值減少；降低UAE，HbA1，BUN，Sr，改善腎功能，到達有效抗氧化，進而抑制AGEs?？偠灾?，以藥物抑制糖基化和氧化應激兩個方面為出發(fā)點，可能為臨床糖尿病腎病防治提供新的途徑和思路。參考文獻：1朱玉霞，李吻，吳玉雙，等.糖基化終末產(chǎn)物與2型糖尿病慢性并發(fā)癥的相關(guān)性研究J.中國危重病急救醫(yī)學，2022，177：436.2BayneJ.Rlefxidativestressindevelpentfpliatinsindia

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