激光共聚焦煙草

1、實_業(yè)姓狄晨學日期地點農(nóng)生B-課程稱細胞生實_業(yè)姓狄晨學日期地點農(nóng)生B-課程稱細胞生物學實驗指導老師安千成績激光掃共聚焦顯微鏡工作原理及用稻瘟菌 實驗類型驗組學生姓魯楠一1實驗目的和要求必填21了解綠色熒光蛋白green fluorescent proteinGFPV子用于監(jiān)測靶因的裝線31掌握用激光掃共聚焦顯微鏡成像的要素并檢測 GFP 標記蛋白在真菌細胞內(nèi)的定 二1實驗內(nèi)容和原理必填11熒光熒光是物質(zhì)V子中的電子吸收了光的能由P能態(tài)躍遷到高能態(tài)再回到的光2激能發(fā)射熒光的物質(zhì)被稱熒光物質(zhì)2熒光物質(zhì)激回到態(tài)過程中除發(fā)射熒光外能以w它形式如熱能和磷能即有能損失也即光物質(zhì)吸收高能短光而發(fā)射P能長熒

2、光2而對于一些非熒光物質(zhì)以通過或稱熒光探針結合或反而化熒光物質(zhì)個過程被稱熒21熒光顯微鏡工作原理光源發(fā)的光線通過激發(fā)濾鏡ion filterV濾定長范圍的激發(fā)光2激發(fā)光被二向色鏡或稱V色鏡dichroicirror改方向通過物鏡照射品激發(fā)品發(fā)射長熒光2來自品的熒光通過V色鏡而來自rblockfilter,阻斷短光進入目鏡231激光掃共聚焦顯微鏡的工作原理LSCM 是在熒光顯微鏡礎P用激光激發(fā)點掃和用共聚焦裝置焦點熒光信排除非焦點的熒光信從而實光即LSM是集熒光顯微高性能算機和數(shù)_圖像處理體的高精度顯微成像系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡成像原理在光源和檢測器前各有一個針孔 pinhole或稱孔光欄V別稱照

3、明針孔illmintionpinhol和檢測針孔detetionpinhol 2由激光光物質(zhì)激而發(fā)射的熒光經(jīng)物鏡和V光器beamspliter通過檢測針孔到達檢測器光電倍增管 PMT2通過照明針孔和檢測針孔的光線經(jīng)一系列的鏡都聚焦于焦點2焦點既PMT檢測到的由激光點掃焦面而發(fā)射的熒光信被算通過顯微鏡P裝置的微步進馬達驅(qū)動載物在垂直方向z軸移動x有穿性的激光能對厚品表面Q一定深度的區(qū)域進行連續(xù)光學W片進而由算機數(shù)_圖xy二維圖像建品的O維結構2V子用于檢測靶因表達和靶蛋白最大熒光吸收/395 nm475 nm 有一個肩峰熒光發(fā)射峰508 nm2GFP GFP O需要外物和輔因子GFP 生色團的形

4、成是自催化的, 檢測FP Ser6rl7 l酸殘的碼序列產(chǎn)生了O的改了吸收和發(fā)射光譜從藍到黃P 突體如(enhaced) FP , 8 m , 8 2P蛋白作內(nèi)V子被廣泛用于監(jiān)測靶內(nèi)的V布和態(tài)2本實驗中所GFP 生色團O點及空間P相鄰的l酸通過突碼酸序列的堿被改了對碼 GFP 的酸序列做了w他修改以適合 GFP 因在真菌細胞或植物O1實驗材料P試劑必填組成型表達連有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定O序列的 GFP的因煙草 16c無菌水211養(yǎng)煙草老師完成1開機LASAF LeicaApplication Suite Advanced Fluorescence 程序路設置激發(fā)光488nm所檢測的發(fā)射光500550nm或

5、更500530nm23用倒置熒光顯微鏡的P倍I3 濾塊cube激發(fā)長 450490 nmV510 nm發(fā)射長大于 515 nm預覽調(diào)焦找到有發(fā)綠色熒光區(qū)域24往數(shù)1.4 63 倍油物鏡鏡頭P滴少無熒光浸油用油鏡找到所要觀察的區(qū)域5點Live 用標準掃頻400 Hz1像素V辨512512dpi 和針孔徑度1 Airy 預掃調(diào)節(jié)焦面1激光強度1PMT 電壓增gain 值和offset 值在預覽到適度的所觀測的圖像選用像素V辨率 10241024 dpi1P頻 200 Hz 和線均 line average 3點Capture 掃成像26將獲得的清晰圖像以 TIFF 格式輸儲七1實驗結果七1實驗結果PV注釋ERendoplasmicreticulum 內(nèi)質(zhì)注釋ERendoplasmicreticulum 內(nèi)質(zhì)Nnuclear 細胞CVcentral箭頭所指細胞生型煙草中未檢熒光標記而在突體中GFP P內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定O序列形成融合因液所以在煙草突體中以看到被 GFP 標記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時以證明 GFP