淺析CCL20在胸腺CD4+CD25+T細胞發(fā)育過程中的作用及其意義

1、淺析CCL20在胸腺CD4+CD25+T細胞發(fā)育過程中的作用及其意義【摘要】目的:研究趨化因子L20對小鼠胸腺D4+D25+雙陽性T細胞發(fā)育的影響,為天然調(diào)節(jié)性T細胞調(diào)控的研究提供根底數(shù)據(jù)。方法:采用14.5d齡胚鼠胸腺進展體外培養(yǎng),以流式細胞術(shù)FP0.001。結(jié)論:體外培養(yǎng)的D4+D25+雙陽性胸腺細胞數(shù)量和比例變化與體內(nèi)發(fā)育變化趨勢一致,L20明顯下調(diào)胸腺D4+D25+的表達,這將為天然調(diào)節(jié)性T細胞的調(diào)控研究提供有效的參考根據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】胸腺細胞D4+D25+L20體外胸腺器官培養(yǎng)Sakaguhi等1研究發(fā)現(xiàn),給小鼠輸入D4+D25+T細胞,會下調(diào)免疫應(yīng)答,研究者們進一步在動物模型和臨床病

2、例證實該細胞參與自身免疫病的發(fā)生、腫瘤的免疫逃避以及移植物抗宿主反響。隨后的研究證實了該群細胞為D4+D25+fxp3+調(diào)節(jié)性T細胞,小鼠體內(nèi)輸注經(jīng)同種抗原活化的D4+D25+T細胞,可引起特異性免疫耐受2,不僅如此,它在免疫系統(tǒng)發(fā)育、自身免疫、腫瘤逃逸等過程中均扮演重要的角色,成為當(dāng)前免疫學(xué)研究的熱點。調(diào)節(jié)性T細胞分為天然調(diào)節(jié)性T細胞和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞,其中天然調(diào)節(jié)性T細胞對機體具有舉足輕重作用。目前就其來源、亞群、特點、轉(zhuǎn)歸及其在T細胞活化中的作用研究都有了長足的進展,但對這群細胞在胸腺發(fā)育中的變化及調(diào)控因素尚不清楚。而L20是亞家族的趨化因子3,該趨化因子的受體分布于未成熟的樹突狀細胞、

3、T細胞、B細胞上4-6,在固有免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著重要的作用7。人們對L20的研究顯示該趨化因子在胸腺中表達明顯8,其受體R6是調(diào)節(jié)性T細胞的標(biāo)志之一9,但其在胸腺中存在的意義以及其是否參與胸腺D4+D25+T細胞的發(fā)育尚不清楚,因此本研究擬采用不同孕齡的胎鼠,以體外胸腺器官培養(yǎng)fetusthyusrganulture,FT技術(shù)在體外以L20對調(diào)節(jié)性T細胞進展干預(yù)實驗,對D4+D25+T細胞的體內(nèi)外發(fā)育狀態(tài)進展比較研究,以期為該群細胞發(fā)育和調(diào)控的深化研究提供了根據(jù)。1材料和方法1.2方法參加1LRPI1640培養(yǎng)液含200L/LFBS。滅菌濾膜充分潮濕后覆蓋在明膠海綿上,吸棄0.5L培養(yǎng)

4、液,使24孔板中最終剩0.5L培養(yǎng)液。頸椎脫位處死孕鼠,從孕鼠子宮中取出胚鼠,置于加有PBS的100的平皿中,根據(jù)大小等特征再次判斷其胚齡。剪開胚鼠胸腔,取出胸腺小葉經(jīng)PBS充分清洗,每孔加8個胸腺小葉,每組均為雙復(fù)孔進展培養(yǎng)。L20干預(yù)組在培養(yǎng)的第0、3天加趨化因子L20終濃度為4g/L。體內(nèi)胸腺細胞發(fā)育過程的研究分別取不同孕齡的母鼠,按照以上步驟取出胸腺小葉后,制成單細胞懸液,計數(shù)、染色10。參加1LFIT標(biāo)記D4和PE標(biāo)記D25Ab10g/L,輕輕混勻,4,避光,靜置30in。PBS洗3次后,用500LPBS重懸,流式細胞術(shù)檢測。檢測體外培養(yǎng)胸腺時,將胸腺小葉從濾膜上取出,按照以上方法制

5、成懸液并染色,BDaliber機型檢測,ellquest軟件分析10。2結(jié)果2.1體外及體內(nèi)胸腺細胞總數(shù)的變化系統(tǒng)反映存在于胸腺細胞中的D4+D25+雙陽性細胞的體內(nèi)外發(fā)育狀況,首先觀察了整個胸腺細胞的數(shù)量變化。結(jié)果顯示:14.5d胚齡鼠的胸腺細胞為雙陰性時期或者稍有陽性,是進展胸腺細胞發(fā)育研究的最正確圖1。圖1胚鼠胸腺細胞數(shù)目的體內(nèi)外動態(tài)變化略2.2D4+D25+雙陽性胸腺細胞的體內(nèi)外發(fā)育進一步研究D4+D25+雙陽性胸腺細胞的體內(nèi)外發(fā)育狀況顯示:在體內(nèi)情況下,14.5d胚鼠的胸腺細胞中D4+D25+占全部胸腺細胞的比例為0.13%,17d增至峰值4.13%,而后降低至19d的2.03%圖2

6、A圖2B圖2圖2D。體外培養(yǎng)的胸腺細胞與體內(nèi)胸腺細胞發(fā)育規(guī)律類似:體外培養(yǎng)1d時,胸腺細胞中D4+D25+的比例體內(nèi)為1.87%,4d增至峰值10.85%,而后降低至6d的3.54%圖2A。D4+D25+細胞數(shù)在1d為0.01104,4d增加至4.31104,持續(xù)增至6d的4.89104圖2B。D4+D25+占D25+細胞的在1d比例為3.75%,持續(xù)增加至80.06%圖2D。僅D4+D25+占D4+細胞的比例與體內(nèi)不同,在1d為58.29%,而后持續(xù)降低至6d的4.04%圖2。圖2胚鼠胸腺細胞中D4+D25+細胞的體內(nèi)外動態(tài)變化略A:D4+D25+胸腺細胞百分比;B:D4+D25+胸腺細胞數(shù);:D4+D25+/D4+百分比;D:D4+D25+/D25+百分比.2.3L20干預(yù)胸腺D4+D25+細胞的發(fā)育由于L20表達于胸腺中,為了研究L20是否對胸腺D4+D25+細胞的發(fā)育產(chǎn)生影響,以一定濃度的L20與胸腺細胞共培養(yǎng),結(jié)果顯示在不同培養(yǎng)時間點均有不同程度的影響表1,在培養(yǎng)的第3、6天,D4+D25+胸腺細胞的比例明顯降低,進一步的實驗說明L20濃度的增加,D4+D25+胸腺細