消毒劑與抗抑菌劑中抗真菌藥物的檢測方法和評價要求

1、 消毒劑與抗抑菌劑中抗真菌藥物的檢測方法和評價要求范圍本標準規(guī)定了消毒劑與抗抑菌劑中抗真菌藥物的檢測方法和評價要求。本標準適用于消毒劑與抗抑菌劑中灰黃霉素、硝酸益康唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、聯(lián)苯芐唑、硝酸咪康唑、氟胞嘧啶、鹽酸萘替芬及其它抗真菌藥物的測定和評價。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682-2008 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法中華人民共和國藥典（二部）（2015版）國家藥典委員會 術語和定義下列術語和定義適用于本文件抗真菌藥物 a

2、ntifungal agents具有抑菌和（或）殺菌特性、用于預防和治療真菌性感染的藥物，包括抗生素和按處方藥物管理的化學合成藥物。檢測方法原理樣品經(jīng)1%甲酸乙腈超聲提取后，膏霜劑型經(jīng)N-丙基乙二胺凈化，其他劑型不需凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標法定量。試劑和材料本方法所用試劑均為色譜純，實驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。試劑乙腈（CH3CN）。甲酸（HCOOH）。N-丙基乙二胺（C5H14N2，PSA）。試劑配制0.1%甲酸水溶液：取甲酸1.0mL，用水定容至1000mL。1%甲酸水溶液：取甲酸10.0mL，用水定容至1000mL。0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸1.0mL，用乙腈定

3、容至1000mL。1%甲酸乙腈溶液：取甲酸10.0mL，用乙腈定容至1000mL。0.1%甲酸乙腈水溶液：取乙腈300mL，加入甲酸1.0mL，用水定容至1000mL。標準品灰黃霉素、酮康唑、克霉唑、硝酸益康唑、硝酸咪康唑、氟康唑、聯(lián)苯芐唑、氟胞嘧啶、鹽酸萘替芬標準物質(zhì)：純度均98.5%或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準物質(zhì)，其他相關信息見附錄A。標準溶液配制標準儲備液：準確稱取標準品50mg（精確至0.1mg），用少量乙腈溶解后，轉(zhuǎn)移至置50mL容量瓶中，加乙腈使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1000ug/mL的標準儲備溶液，-18-22冷凍保存，有效期3個月。混合標準中間液的配制

4、：取上述標準儲備液適量，用乙腈配置成酮康唑濃度為10g/mL、氟胞嘧啶濃度為5g/mL、氟康唑、灰黃霉素、聯(lián)苯芐唑濃度為1mg/L、硝酸益康唑、硝酸咪康唑、鹽酸萘替芬和克霉唑濃度為0.5g/mL的混合標準中間，冷藏避光保存，有效期1個月?；旌蠘藴嗜芤海何〔煌w積的混合標準中間液，用空白樣品提取液配制成適當濃度的標準工作溶液，如酮康唑的濃度為10g/L、25g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，氟胞嘧啶的濃度為5g/L、12.5g/L、25g/L、50g/L、75g/L、100g/L，氟康唑、灰黃霉素、聯(lián)苯芐唑的濃度為1g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L、15g

5、/L、20g/L，硝酸益康唑、硝酸咪康唑、鹽酸萘替芬和克霉唑的濃度為0.5g/L、1.25g/L、2.5g/L、5g/L、7.5g/L、10g/L，臨用現(xiàn)配。材料有機系濾膜：孔徑為0.22m。儀器和設備超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：帶電噴霧離子源。分析天平：最小分度值0.1mg。離心機：轉(zhuǎn)速9000r/min。渦旋混合器。超聲波清洗器。分析步驟樣品前處理膏霜劑型稱取0.5g（精確至1mg）試樣置于15mL離心管中，加入8.0mL1%甲酸乙腈，渦旋1min，加入50mg N-丙基乙二胺，超聲提取30min，離心（9000r/min）5min，將上清液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，1%甲酸乙腈定容至刻度?；?/p>

6、勻后取1.0mL置于10mL容量瓶，用0.1%甲酸乙腈水溶液定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)移至離心管，離心（9000r/min）5min，取上清液經(jīng)濾膜過濾后備用。其他劑型稱取0.5g（精確至1 mg）試樣置于15mL離心管中，加入8.0mL1%甲酸乙腈，渦旋1min，超聲提取30min，離心（9000r/min）5min，將上清液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，1%甲酸乙腈定容至刻度?；靹蚝笕?.0mL置于10mL容量瓶，用初始流動相定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)移至離心管，離心（9000r/min）5min，取上清液經(jīng)濾膜過濾后備用。樣品測定液相色譜參考條件色譜柱：C18柱（柱長100mm，內(nèi)徑為2.1mm，粒徑為1.

7、7m）或相當者；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3mL/min；柱溫：30；進樣體積：2L；梯度洗脫程序：見附錄B。質(zhì)譜參考條件電離方式：ESI+；離子源溫度：150；毛細管電壓：3.0Kv；脫溶劑氣溫度：400；脫溶劑氣（N2）流量：800L/h；錐孔氣（N2）流量：150L/h；碰撞氣及碰撞室壓力：7.010-3mPa；監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；其他質(zhì)譜參數(shù)：見附錄C。標準曲線的制作將混合標準系列溶液，按濃度由低到高依次注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測得相應的峰面積。以各抗真菌藥物標準工作溶液的濃度為橫坐標，以各抗真菌藥物的峰面積為縱坐標，繪制標準

8、曲線，以離子對定性，采用外標法進行定量分析，標準圖譜見附錄D。定性測定在相同測試條件下，試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比較，變化范圍在2.5%以內(nèi)，且檢測到的相對離子豐度，應與濃度相當?shù)臉藴嗜芤褐邢鄬﹄x子豐度一致，其相對豐度比偏差應符合表1要求。相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度（%）5020至5010至2010允許的最大偏差（%）20253050定量測定按照外標法進行定量計算，標準溶液和試樣溶液中抗真菌藥物的響應值均應在儀器線性響應范圍內(nèi)。如果含量超過標準曲線范圍，應稀釋到合適濃度后分析。測定將試樣溶液注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀中，以保留時間和兩對離子（特征離子

9、對/定量離子對）所對應的色譜峰面積相對豐度進行定性，根據(jù)標準曲線計算試樣溶液中目標化合物的質(zhì)量濃度?？瞻自囼灣患釉嚇油猓瓷鲜霾襟E進行。結果計算和表述試樣中目標化合物的含量按式（1）計算： （ SEQ 標準自動公式 * ARABIC 1）式中：X試樣中目標化合物的含量，單位為微克每千克（g/kg）；C由標準曲線計算出的試樣溶液中目標化合物的濃度，單位為微克每升（g/L）；V定容體積，單位為毫升（mL）；K稀釋倍數(shù)；m樣品稱樣量，單位為克（g）。計算結果保留三位有效數(shù)字。精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。檢出限和定量限當取樣量為0.5g，定量體積

10、為10mL時，本方法的檢出限和定量限見附件E。其他抗真菌藥物的檢測方法可參照中華人民共和國藥典方法并進行方法驗證后執(zhí)行。若中華人民共和國藥典未涵蓋的抗真菌藥物的檢測方法?？蓞⒖嘉墨I報道的方法，并通過認證后方可使用。評價要求消毒劑與抗抑菌劑中不得添加任何抗真菌藥物?？拐婢幬镌谙緞┡c抗抑菌劑中含量或總量均不得超過100mg/kg。其他抗真菌藥物在消毒劑與抗抑菌劑中的含量或總量不得超過外用藥物最小規(guī)格的1%。（規(guī)范性附錄）標準品相關信息標準品相關信息抗真菌藥英文名稱分子式CAS序號化學結構式灰黃霉素GriseofulvinC17H17ClO6126-07-8酮康唑KetoconazoleC26H

11、28Cl2N4O465277-42-1克霉唑ClotrimazoleC22H17ClN223593-75-1硝酸益康唑Econazole NitrateC18H16Cl3N3O468797-31-9硝酸咪康唑Miconazole NitrateC18H15Cl4N3O422832-87-7氟康唑FluconazoleC13H12F2N6O86386-73-4聯(lián)苯芐唑BifonazoleC22H18N260628-96-8氟胞嘧啶FlucytosineC4H4FN3O2022-85-7鹽酸萘替芬Naftifine hydrochlorideC21H22ClN65473-14-5（資料性附錄）液相

12、色譜梯度洗脫程序液相色譜梯度洗脫程序時間（min）A（%）B（%）095519553554544060910909.501001095513955（資料性附錄）質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件編號物質(zhì)名稱母離子（m/z）錐孔電壓（V）子離子（m/z）碰撞能量（eV）1灰黃霉素353.035165.0*2535215.0202酮康唑531.059489.0*2959255.0363克霉唑277.045165.0*2545241.0254硝酸益康唑381.031125.0*3131193.0185硝酸咪康唑417.048159.0*3548161.0326氟康唑307.042238.0*1542220.0

13、167聯(lián)苯芐唑311.023243.0*1423165.0188氟胞嘧啶130.021113.0*172185.0209鹽酸萘替芬288.026117.0*1526141.020帶*的離子為定量離子。（資料性附錄）標準圖譜標準圖譜1:灰黃霉素（3.89min）；2:酮康唑（3.83min）；3:硝酸咪康唑（5.69min）；4:硝酸益康唑（5.22min）；5:聯(lián)苯芐唑（4.41min）；6:氟康唑（2.96min）；7:鹽酸萘替芬（4.13min）；8:克霉唑（4.32min）；9:氟胞嘧啶（0.80min） （資料性附錄）方法檢出限和定量限方法檢出限和定量限抗真菌藥檢出限（mg/kg）定量

14、限（mg/kg）灰黃霉素0.060.2酮康唑0.62.0克霉唑0.030.1硝酸益康唑0.030.1硝酸咪康唑0.030.1氟康唑0.060.2聯(lián)苯芐唑0.060.2氟胞嘧啶0.31.0鹽酸萘替芬0.030.1（資料性附錄）方法回收率膏霜劑型的各添加濃度的回收率與精密度膏霜劑型中抗真菌藥物的的回收率抗真菌藥添加濃度（mg/kg）回收率范圍（%）精密度（n=8，%）灰黃霉素487.5103.03.08188.0104.35.340.580.0100.63.80酮康唑4076.087.13.251074.4102.44.38588.499.25.45克霉唑284.096.03.760.583.09

15、9.04.120.2585.0105.05.33硝酸益康唑288.098.03.660.592.095.44.320.2580.0104.03.22硝酸咪康唑292.0105.03.530.592.0104.04.550.2580.096.05.26氟康唑478.695.04.40178.098.25.550.580.0102.36.15聯(lián)苯芐唑489.599.14.66185.0103.53.220.586.5101.93.16氟胞嘧啶2084.3103.22.52589.598.83.052.584.8106.44.15鹽酸萘替芬282.097.03.400.584.0102.05.050.2580.095.05.85其他劑型的各添加濃度的回收率與精密度其他劑型中抗真菌藥物的回收率抗真菌藥添加濃度（mg/kg）回收率范圍（%）精密度（n=8，%）灰黃霉素482.594.54.24178.094.03.040.580.0104.04.77酮康唑4073.590.33.991081.590.44.75584.295.65.05克霉唑288.0100.03.730.572.088.04.030.2580.096.05.55硝酸益康唑290.097.03.580.590.098.55.220.2