胰蛋白酶活力測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)胰蛋白酶活力測(cè)定、原理福林一酚試劑中的磷鎢酸和磷鑰酸，在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類 化合物還原為藍(lán)色化合物（鎢藍(lán)和鑰藍(lán)。蛋白質(zhì)中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白 酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸與福林一酚試劑反應(yīng)，生成藍(lán)色 化合物，在一定的范圍內(nèi)，藍(lán)色化合物顏色的深淺與酶活力的大小成正 比。二、實(shí)驗(yàn)儀器試管7220分光光度計(jì)恒溫水浴鍋三、實(shí)驗(yàn)試劑福林試劑B :見福林（Folin）-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度部分（冰箱中） 0.55mol/L碳酸鈉溶液：58.3g無水碳酸鈉溶于蒸餾水，稀釋并定容至 1000ml10%三氯乙酸溶液0. 2mol/L 磷酸緩沖液（pH7.

2、5）:0.5%酪素溶液：稱取0.5g酪素，以0.5mol/L氫氧化鈉1ml濕潤(rùn)，再 加少量0. 2mol/L磷酸緩沖液稀釋。在水浴中煮沸溶解，冷卻，稀釋并 容至100ml，冷藏在（冰箱）里。500ug/L酪氨酸溶液胰蛋白酶溶液（冰箱中）四、實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按下表加入試劑：管號(hào)123456500ug/LB氨酸溶液00.20.40.60.81.0蒸餾水1.00.80.60.40.20各管中加0.5%酪素2ml，于37對(duì)水浴中反應(yīng)15分鐘，然后加入10% 三氯乙酸3ml，過濾除去沉淀取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸鈉5ml , 再加入福林試劑1ml，于37 C水浴中顯色15分鐘，測(cè)O

3、D680。以光密度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：取干燥的試管2支，按下表加入試劑管號(hào)12備注0.5%酪素溶液2.02.037水浴中酶解15分鐘0. 2mol/L磷酸緩沖液1.002mg/ml胰酶溶液01.010%三氯乙酸溶液3.03.0過濾上清液1137水浴中顯色15分鐘0.55mol/L碳酸鈉溶液5.05.0福林試劑B11OD6800五、結(jié)果計(jì)算酶活力：在37對(duì)下每分鐘水解酪素產(chǎn)生lug酪氨酸為一個(gè)活力單位。樣品中含酶活力單位=A/15 XFA一樣品測(cè)定光密度查曲線得相當(dāng)酪氨酸ug數(shù)F一酶液稀釋倍數(shù)原始數(shù)據(jù)：（注：7號(hào)為待測(cè)液）液體編度計(jì)值0123457液體編度計(jì)值

4、012345700.0570.1720.2010.2550.3730.91900.0570.1730.1940.2630.3860.92800.0680.1740.1940.2710.3910.934分光光度計(jì)值分光光度計(jì)值分光光值度光光分0 -0.05組數(shù)酪氨酸濃度為：組數(shù)/30 mg/L*系列1值度光光分0 -0.05組數(shù)酪氨酸濃度為：組數(shù)/30 mg/L*系列1系列2系列3線性（系列3）5 4 5 3 4 3 -O - O o O5 2 5 1 B 2I-1I-O o o o計(jì)算得X=12.583換算后得A=6.2915ugF=3故酶活力為1.2583單位六.實(shí)驗(yàn)分析誤差分析：試管液體的

5、選?。罕ＷC選用的胰蛋白酶液是新鮮的，有較好的活性和催化效率盡量保持不同試管溶液配制的時(shí)間差達(dá)到最小，試管內(nèi)的溶液不易擱置 太久取液時(shí)的操作：各種容器洗后壁上殘留水移液管洗刷完后沒有潤(rùn)洗，導(dǎo)致所移液體不純移液管的俯視和仰視使讀數(shù)不準(zhǔn)從水浴中拿出試管，沒有使試管完全冷卻。是測(cè)得的分光值可能不準(zhǔn)確， 是液體的溫度盡量相等分光光度計(jì)的正確使用：分管光度計(jì)有銹斑，測(cè)量誤差較大在使用分光光度計(jì)時(shí)，一定要先預(yù)熱，另外，比色皿要選用透明度 好的，有些比色皿由于使用時(shí)間過長(zhǎng)，或某些原因沒有刷干凈，顏色發(fā) 暗，在某些程度上影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在選取時(shí)一定要注意。胰蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中，在Ca 2

6、+的存在 下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活 從肽鏈N端 賴氨酸和異 亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后 轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電 點(diǎn)約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300）,其等電點(diǎn) 約為pH10.8，最適pH7.68.0，在pH=3時(shí)最穩(wěn)定，低于此pH時(shí)， 胰蛋白酶易變性，在pH5時(shí)易自溶。Ca 2+離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定 作用。重金屬離子，有機(jī)磷化合物和反應(yīng)物都能抑制胰蛋白酶的活性, 胰臟、卵清和豆類植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑。最近發(fā)現(xiàn)在一 些植物的塊基（如土豆、白薯、芋頭等）中也存在有胰蛋白酶抑制劑。胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨 酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還 能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn) 為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對(duì)這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎?鍵 酰胺鍵 肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為 底物來測(cè)定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（簡(jiǎn) 稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸書-萘酰胺（簡(jiǎn)稱BANA）測(cè)定酰胺酶 活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡(jiǎn)稱BAEE ）和對(duì)甲苯磺酰-L-精氨 酸甲酯（簡(jiǎn)稱