腫瘤的分子生物學檢驗技術課件

1、腫瘤的分子生物學檢驗技術腫瘤的分子生物學檢驗技術腫瘤的分子生物學檢驗技術腫瘤的分子生物學檢驗技術腫瘤的分子生物學檢驗技術腫瘤的分子生“千手觀音” 21位聾啞演員中 18人有藥物史部分患者使用正常劑量也會致聾“一針致聾”現(xiàn)象線粒體基因突變（A1555G）+環(huán)境（使用氨基糖苷類）“千手觀音” 線粒體基因突變（A1555G）+環(huán)境（使用氨基線粒體（Mitochondrion）31. 真核細胞中的細胞器，二分裂方式進行新陳代謝，平均壽命10天2. 多數細胞含幾個到幾千個線粒體3. 每個線粒體含2-10 線粒體DNA（mtDNA）線粒體（Mitochondrion）31. 真核細胞中的細胞線粒體的主要功

2、能 1、參與人體很多重要的生物化學過程（三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸分解代謝、血紅素合成和部分尿素合成過程）被稱為“細胞的能量工廠” 2、線粒體體積大小，數量增減反應器官功能負荷的變化。線粒體的主要功能 1、參與人體很多重要的生物化學過程（三羧第一節(jié)線粒體基因組及其表達系統(tǒng)第一節(jié)線粒體基因組及其表達系統(tǒng)第一節(jié) 線粒體基因組與線粒體病人體細胞中的線粒體DNA具有自主的DNA復制、轉錄功能，為非孟德爾遺傳方式，故稱為25號染色體。25號染色體第一節(jié) 線粒體基因組與線粒體病人體細胞中的線粒體DNA具有自7（一）人類線粒體基因組1、基因組小, 16569 bp2、雙鏈環(huán)狀DNA外環(huán)富含鳥嘌呤稱為重鏈

3、，內環(huán)富含胞嘧啶稱輕鏈3、1）編碼區(qū) 13 結構基因 / mRNA22 tRNA 基因2 rRNA 基因2）非編碼區(qū)D-loop（約1120bp）L鏈復制起始區(qū)（約3050bp，tRNAAsn-tRNACys）一、線粒體基因組及其表達系統(tǒng)7（一）人類線粒體基因組1、基因組小, 16569 bp一、1、結構基因1、結構基因7個為NADH-CoQ還原酶復合體（復合體）的亞基（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6）1個編碼的結構蛋白質為CoQH2-細胞色素c還原酶復合體（復合體）中細胞色素b的亞基 3個為構成細胞色素c氧化酶（COX）復合體（復合體）催化活性中心的亞單位（COX、

4、COX和COX）2個為ATP合酶復合體（復合體）F0部分的2個亞基（A6和A8）1、結構基因7個為NADH-CoQ還原酶復合體（復合體）的亞基（ND12、tRNA基因22個tRNA 基因可轉錄20種tRNA 滿足線粒體內蛋白質翻譯的需要。tRNALeutRNASer 都有2個基因外，其余18種均只有1個基因。2、tRNA基因22個tRNA 基因3、rRNA基因1、mtRNA 編碼兩種rRNA,即12SrRNA16SrRNA2、位于H鏈tRNAPhetRNALeu之間以tRNAVal相隔 3、變異常發(fā)生在二級結構莖環(huán)上。3、rRNA基因1、mtRNA 編碼兩種rRNA,即12Sr4、非編碼區(qū)D-

5、loop（約1120bp）位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，約1120bp,是mtDNA中變異最多的區(qū)域，參與并調控mtDNA的復制和轉錄。L鏈復制起始區(qū)（約3050bp，tRNAAsn-tRNACys可折疊成莖環(huán)結構。4、非編碼區(qū)D-loop（約1120bp）（二）線粒體基因表達系統(tǒng)及特點1、密碼子1979年，Barrell 報道了人線粒體DNA所用的遺傳密碼。 通用遺傳密碼和線粒體遺傳密碼的差異密碼子線粒體DNA編碼核DNA編碼UGA色氨酸終止AUA起始異亮氨酸AGG終止精氨酸（二）線粒體基因表達系統(tǒng)及特點1、密碼子1979年，Barr（二）線粒體基因表達系統(tǒng)及特點2、mtDNA

6、復制特點D環(huán)復制為主要模式，重鏈以逆時針方向復制，輕鏈以順時針方向復制。nDNA只在細胞分裂時復制，mtDNA一直處于分裂狀態(tài)，并由nDNA編碼的調控因子控制。（二）線粒體基因表達系統(tǒng)及特點2、mtDNA復制特點mtDNA復制特點 mtDNA可進行半保留復制，其H鏈復制的起始點（OH）與L鏈復制起始點（OL）相隔2/3個mtDNA。復制起始于L鏈的轉錄啟動子，首先以L鏈為模板合成一段RNA作為H鏈復制的引物，在DNA聚合酶作用下，復制一條互補的H鏈，取代親代H鏈與L鏈互補。被置換的親代H鏈保持單鏈狀態(tài)，這段發(fā)生置換的區(qū)域稱為置換環(huán)或D環(huán)，故此種DNA復制方式稱D-環(huán)復制。mtDNA復制特點 m

7、tDNA可進行半保留復制，其H鏈（二）線粒體基因表達系統(tǒng)及特點3、mtDNA轉錄的特點對稱性轉錄，重鏈啟動子啟動重鏈順時針方向轉錄，輕鏈啟動子啟動輕鏈逆時針方向轉錄。成熟的mRNA只在3末端加polyA尾巴，5 末端不修飾帽子結構（二）線粒體基因表達系統(tǒng)及特點3、mtDNA轉錄的特點（二）線粒體基因表達系統(tǒng)及特點4、線粒體蛋白質的合成特點 自主編碼合成13個多肽，其余功能所需蛋白均由核基因組編碼，與細菌合成蛋白質體系十分相似。“共生學說”（二）線粒體基因表達系統(tǒng)及特點4、線粒體蛋白質的合成特點18核基因組編碼了1500多個線粒體蛋白線粒體基因組只編碼了13條多肽鏈“交叉對話（cross-tal

8、k）”機制（三）mtDNA與nDNA的相互關系1、nDNA的表達狀況可直接影響和調控mt DNA的表達和線粒體蛋白質的生物合成。2、 mt DNA突變可直接影響mt DNA所編碼蛋白多肽的合成，而影響有氧呼吸、物質代謝和能量代謝，并進一步通過線粒體功能變化反饋影響nDNA的復制和表達。18核基因組編碼了1500多個線粒體蛋白線粒體基因組只編碼了3、各種轉錄因子是其通訊的基礎?！敖徊鎸υ挘╟ross-talk）”機制3、各種轉錄因子是其通訊的基礎。“交叉對話（cross-ta二、線粒體病的概念因線粒體功能受損或缺陷而導致的疾病。主要累及大腦和肌肉組織。分為線粒體肌病，線粒體腦病、線粒體腦肌病二、

9、線粒體病的概念線粒體功能涉及眾多的組織器官21線粒體功能涉及眾多的組織器官21三、線粒體病的特征（一）母系遺傳與遺傳早發(fā)三、線粒體病的特征（一）母系遺傳線粒體疾病的母系遺傳線粒體疾病的母系遺傳(二)同質性突變與異質性突變與發(fā)病閾值效應24線粒體基因同質性（Homoplasmy）0 或 100%異質性（Heteroplasmy） 0-100%核基因純合子（Homozygous） 0 或 100%雜合子（Heterozygous）50%(二)同質性突變與異質性突變與發(fā)病閾值效應24線粒體基因核基mtDNA同質性/異質性突變與閾值25mtDNA同質性/異質性突變與閾值25線粒體DNA的突變率極高，約

10、比核DNA高10-20倍。 線粒體DNA排列緊湊，沒有內含子，任何mtDNA的突變都可能影響其基因組的重要功能；線粒體DNA缺少組蛋白的保護；線粒體DNA容易被呼吸鏈生成自由基氧化損傷；線粒體中沒有DNA損傷的修復系統(tǒng)；四、線粒體病的分子生物學檢驗標志線粒體DNA的突變率極高，約比核DNA高10-20倍。 線粒四、線粒體病的分子生物學檢驗標志（一）mtDNA堿基位點1、點突變 1）結構基因點突變包括同義突變和錯義突變，錯義突變導致氨基酸的替換，由此引起蛋白質結構和功能的改變，導致疾病。Leber視神經?。↙HON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）四、線粒體病的分

11、子生物學檢驗標志（一）mtDNA堿基位點1、點突變 2）tRNA基因的點突變，可以降低線粒體內蛋白質的生物合成的能力，從而影響線粒體氧化磷酸化的功能，導致疾病的發(fā)生。MELAS綜合征（線粒體腦肌病乳酸酸中毒及卒中樣發(fā)作）：A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因）1、點突變 2）tRNA基因的點突變，可以降低線粒體內蛋四、線粒體病的分子生物學檢驗標志2、單核苷酸多態(tài)性位點單個核苷酸變異引起的mtDNA序列的多態(tài)性，與不同人群有關。3、線粒體單體群 在進化過程中，母系遺傳的mtDNA為適應環(huán)境所形成的堿基位點多態(tài)性集合。四、線粒體病的分子生物學檢驗標志2、單核苷

12、酸多態(tài)性位點（二） mtDNA缺失或插入片段 大片段重組包括缺失和重復，以缺失較為常見。 大片段的缺失往往涉及多個基因，可導致線粒體OXPHOS功能下降，產生的ATP減少，從而影響組織器官的功能。 常見缺失： 848313459：Kearns-Sayre綜合癥（KSS）、缺血性心臟病 ； 863716073：與衰老有關的退行性疾?。?438914812：能量代謝受到嚴重破壞 。（二） mtDNA缺失或插入片段 大片段重組包括缺失和重復（二） mtDNA拷貝數的變化mtDNA拷貝數可作為評價線粒體功能的指標，當拷貝數減少時導致細胞能量缺乏，由此引發(fā)疾病，在胃癌、食管鱗癌等腫瘤細胞中mtDNA拷貝

13、數下降，有可能成為一種新的腫瘤標志物。（二） mtDNA拷貝數的變化mtDNA拷貝數可作為評價線粒第二節(jié)線粒體病分子生物學檢驗技術及質量控制第二節(jié)線粒體病分子生物學檢驗技術及質量控制一、線粒體病分子生物學檢驗策略一、線粒體病分子生物學檢驗策略二、線粒體病的分子生物學檢驗技術（一）PCR-RFLP技術二、線粒體病的分子生物學檢驗技術（一）PCR-RFLP技術PCR-RELP的質量控制（1）模板DNAD的制備和引物設計：設計合適的引物擴增目的模板DNA（2）酶的選擇：去除干擾物質，根據酶活性要求選擇適宜的緩沖液、活性劑等，酶的用量不超過總體積的10%。（3）PCR擴增體系和酶切反應條件：優(yōu)化保證P

14、CR產物的純度和精度，設計好酶切反應體系，根據內切酶活性，適時終止反應。（4）結果分析：根據酶解片段選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，染色后觀察擴增基因的變異情況。PCR-RELP的質量控制（1）模板DNAD的制備和引物設計二、線粒體病的分子生物學檢驗技術（二）變性高效液相色譜法在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。 二、線粒體病的分子生物學檢驗技術（二

15、）變性高效液相色譜法腫瘤的分子生物學檢驗技術課件DHPLC檢測的質量控制1、 DHPLC檢測的樣本要求（1）片段大小：最好在200-500bp.敏感性最好。（2）樣品質量：檢測前不許純化，核苷酸和引物會很早被洗脫，模板大分子在樣品峰后洗脫。引物二聚體和非特異性擴增及堿基數類似的污染物需優(yōu)化PCR去除。（3）樣品含量：PCR濃度必須足夠大，要求2微升產物經瓊脂糖凝膠電泳可見清晰條帶，相當于濃度至少20ng/ul.DHPLC檢測的質量控制1、 DHPLC檢測的樣本要求（1）PCR引物的設計：引物長度200-500bp范圍，且只有一個溶解區(qū)域，無錯配的PCR片段（2）PCR反應條件的優(yōu)化，控制好溫度

16、和時間達到模板雙鏈完全變性、復性（3）DHPLC檢測上樣前要驗證PCR產物質量，以保證結果準確性。（4）結果分析：在部分變性條件下出現(xiàn)異源雙鏈峰，表明異質性突變位點，反之則為同源單峰。建議購買陽性質控品。2、DHPLC檢測的條件優(yōu)化（1）PCR引物的設計：引物長度200-500bp范圍，且只二、線粒體病的分子生物學檢驗技術（三）DNA芯片技術略（四）DNA測序技術略二、線粒體病的分子生物學檢驗技術（三）DNA芯片技術略三、線粒體病的分子生物學檢驗應用（一）MELAS綜合征11月23日，讀初三的曉炎從學校回家后，顧春娜就感覺女兒臉色不好，以為曉炎在學校吃的沒有營養(yǎng)，就趕緊給女兒做了頓好飯。可曉炎

17、吃過飯后不久，就開始嘔吐。當晚凌晨2點鐘，曉炎出現(xiàn)了全身抽搐的癥狀，看到女兒四肢顫抖，嘴眼歪斜，顧春娜趕緊撥打120，急救車將女兒送到醫(yī)院救治。入院后的曉炎，直接被送進了ICU重癥監(jiān)護室。經過醫(yī)院的多次檢查，也沒有最終確診，院方建議顧春娜帶曉炎去北京治療。到了北京兒童醫(yī)院，終于確診曉炎患上的是一種因遺傳基因的缺陷而導致的線粒體結構和功能的異常，病癥名稱為線粒體腦肌病。三、線粒體病的分子生物學檢驗應用（一）MELAS綜合征MELAS綜合征發(fā)病特點母系遺傳1040歲發(fā)病，10歲前發(fā)育正常。首發(fā)癥狀為運動不耐受、卒中樣發(fā)作、偏輕癱、失語、皮層盲或聾。并有肢體無力、抽搐或陣發(fā)性頭痛、智能低下癡呆及乳酸

18、血癥MELAS綜合征發(fā)病特點腫瘤的分子生物學檢驗技術課件MELAS基因已發(fā)現(xiàn)4種點突變與大多數MELAS病例有關，其中2種分別在第A3243G、T3271C位核苷酸，最常見其中80%是A3243G的突變MELAS基因45399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 為異質性突變PCR-RFLP（限制酶Apa）PCR-DHPLCWTA3242G45399bp307bp92bpM Umt3243 突變DNA序列測定 3243正常序列突變雜合子mt3243 突變DNA序列測定 3243正常序列突變雜合子三、線粒體病的分子生物學檢驗應用（二）Leber遺傳性視神

19、經病變Leber遺傳性視神經病是以德國眼科醫(yī)生Theodor Leber的名字命名的，又稱Leber視神經萎縮，為一種急性或亞急性發(fā)作的母系遺傳病，男女病人比例5:1，至今尚未發(fā)現(xiàn)一個男性患者將此病傳給后代。三、線粒體病的分子生物學檢驗應用（二）Leber遺傳性視神經視神經與視網膜神經元退化，發(fā)病較早，表現(xiàn)急性亞急性視力減退，中心視野喪失明顯，導致失明。視神經與視網膜神經元退化，發(fā)病較早，表現(xiàn)急性亞急性視力減退，突變位點基因同質性/異質性首次報道*G3316AND1同質性Saillard et al.(2000)T3394CND1同質性Hofmann et al.(1997)G3460A*ND

20、1同質性/異質性Huoponen et al.(1991)C3497TND1同質性Kong et al.(2003）G3733AND1同質性/異質性Valentino et al.(2004)C4171AND1同質性/異質性Kim et al.(2002)T4216CND1同質性Torroni et al.(1994）A4435GtRNAMet同質性Herrnstadt et al.（2002）G7444ACO同質性Huoponen et al.（1993）T10663CND同質性Brown et al.(1995)G11696AND4同質性/異質性Zhou et al.（2006）G1177

21、8A*ND4同質性/異質性Wallace et al.(1988)T12338CND4同質性Wong et al.（2002）G14459AND6同質性/異質性Jun et al.(1994)C14482G/AND6同質性/異質性Howell et al.(1998)T14484C*ND6同質性/異質性Johns et al.(1992)A14495GND6異質性Chinnery et al.(2001)T14502CND6同質性Ozawa et al.（1991）C14568TND6同質性Wissinger et al.(1997)A14693GtRNAGlu同質性/異質性Tzen et a

22、l.（2003）A15951GtRNAThr同質性Li et al.（2006）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College49原發(fā)性突變：G3460A， G11778A，T14484C的突變，占全部LHON的 80-90繼發(fā)性突變：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438A ，G13708A ，G15257A新突變： A4435G 位于tRNAMet 基因可以調節(jié)ND4 G11778A 突變的外顯率與Leber遺傳性視神經病變相關的mtDNA突變突變位點基因同質性/異質性首次報道*G

23、3316AND1同質性11778GA 90. 9%,3460GA 1. 8%, 14484TC 7. 3% 是目前公認的致病性最強的三種原發(fā)性突變11778GA發(fā)病時視力多低于0.1，視力預后也最差；14484TC發(fā)病時視力及視力恢復情況明顯好于11778GA患者 腫瘤的分子生物學檢驗技術課件11778GA導致編碼NADH脫氫酶亞單位4(ND4)中第340位的Arg精His組，改變ND4空間構型，NADH脫氫酶活性降低，線粒體產能效率下降，視神經細胞提供能量不能長期維持視神經完整結構，導致神經細胞退行性變、死亡。11778 GA3460GA(ND1) 14484TC(ND6)11778GA導致

24、編碼NADH脫氫酶亞單位4(ND4)中第Leber病變相關的mtDNA突變常用檢測技術PCR-RFLP技術PCR-SSCP技術DHPLC技術DNA測序技術School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College52G3460A， G11778A，T11484C原發(fā)性突變測序圖Leber病變相關的mtDNA突變常用檢測技術School 三、線粒體病的分子生物學檢驗應用（三）藥物性耳聾三、線粒體病的分子生物學檢驗應用（三）藥物性耳聾突變位點基 因同質性/異質性疾 病首次報道aT961delT+C(n)ins961insC12S rRNA同質性藥物

25、性耳聾/非綜合征型耳聾Bacino et al.(1995)Tang et al.(2002)T1095C12S rRNA同質性/異質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Thyagarajan et al. (2000)C1494T12S rRNA同質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Zhao et al.(2004)A1555G12S rRNA同質性/異質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal異質性綜合征型耳聾Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(UUR)異質性綜合征型耳聾van den Ouweland, et al.

26、(1992)G7444ACO1/ tRNASer(UCN)同質性/異質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Pandya et al.(1999)A7445GCO1/ tRNASer(UCN)同質性/異質性非綜合征型耳聾Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同質性/異質性綜合征型耳聾Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同質性/異質性非綜合征型耳聾Sue et al.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同質性/異質性綜合征型耳聾Nakamura et al. (1995)A8344GtRNALys異質性綜合征型耳聾Sh

27、offner et al. (1990)G8363AtRNALys異質性綜合征型耳聾Santorelli et al. (1996)T14709CtRNAGlu同質性綜合征型耳聾Rigoli et al.(2001)G15927AtRNAThr同質性藥物性耳聾/非綜合征型耳聾Wang et al.(2008)突變位點基 因同質性/異質性疾 病首次報道aT961de第二節(jié) 線粒體基因組與耳聾耳聾相關的mtDNA突變的檢測PCR-RFLP技術DHPLC技術DNA測序技術基因芯片技術55檢測位點引物序列(53)退火溫度() 產物長度(bp)A1555GC1494TCGA TCA ACC TCA CC

28、A CCT CT58802TGG ACA ACC AGC TAT CAC CAA7445GACG CCA AAA TCC ATT TCA CT58987CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT第二節(jié) 線粒體基因組與耳聾耳聾相關的mtDNA突變的檢測5三、線粒體病的分子生物學檢驗應用（四）線粒體糖尿病線粒體糖尿病美國糖尿病協(xié)會(1997)/世界衛(wèi)生組織(1999)制定了新的糖尿病分型標準，將線粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類型糖尿病，屬于細胞功能遺傳缺陷型糖尿病，約占糖尿病總數的13據浙江省糖尿病防治中心提供的數據，浙江省糖尿病患病率為2.96%三、線粒體病的分子生物學檢驗應用（四）線

29、粒體糖尿病線粒體糖尿線粒體DNA突變與糖尿病突變位點累及基因同質性/異質性疾病首次報道C1310T12S rRNA同質性糖尿病臨床表型Guan et al. (2010)A1438G12S rRNA同質性糖尿病臨床表型Vawter et al.(2009)A3243G*tRNA Leu (UUR)異質性糖尿病合并耳聾Van den et al.(1992)C3254AtRNA Leu (UUR)異質性妊娠糖尿病Ng et al. (2000)T3264CtRNA Leu (UUR)異質性糖尿病Matsuoka et al.(1997)T3271CtRNA Leu (UUR)異質性糖尿病Jaks

30、ch et al. (1995)G3316AMT-ND1同質性非胰島素依賴性糖尿病Ogihara et al. (1995)T3394CMT-ND1同質性非胰島素依賴性糖尿病Wallace et al. (1995)T3398CMT-ND1同質性糖尿病合并耳聾Jaksch et al. (1995)A3399TMT-ND1同質性妊娠糖尿病Ng et al.(2000)T4291CtRNA Ile同質性糖尿病臨床表型Lifton et al. (2004)A4833GMT-ND2同質性非胰島素依賴性糖尿病Onaya et al. (2000)A7472CtRNA Ser (UCN)同質性糖尿病合

31、并耳聾Hanna et al. (2005)A8296GtRNA Lys同質性/異質性糖尿病合并耳聾Ohsawa et al. (1998)A10398GMT-ND3同質性2型糖尿病Kato et al. (2003)A12026GMT-ND4同質性糖尿病Onaya et al. (1998)C12258AtRNA Ser (AGY)異質性糖尿病合并耳聾Turnbull et al. (1998)T14709C*tRNA Glu同質性/異質性糖尿病合并耳聾Moraes et al. (1995)T16189CMT-DLOOP同質性2型糖尿病Poulton et al. (1998)School

32、 of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College57線粒體DNA突變與糖尿病突變位點累及基因同質性/異質性疾病首58攜帶tRNA Leu(UUR) A3243G突變的糖尿病家系School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College58攜帶tRNA Leu(UUR) A3243G突變的糖尿病59399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 為異質性突變RFLPDNA SequencingDHPLCControl A3243GA3242GWTSchool o

33、f Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College59399bp307bp92bpM U60School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College60School of Laboratory Medicin 第十六章 腫瘤的分子生物學檢驗技術濱醫(yī)附院檢驗科 袁笑 第十六章 濱常見腫瘤標志物與腫瘤 前列腺癌PSAEAP睪丸癌AFP, hCG胰腺癌CA 199乳房癌CA 153卵巢癌CA 125肝癌AFP肝癌AFP常見腫瘤標志物與腫瘤 前列腺癌睪丸癌胰腺癌乳房癌卵巢癌肝癌肝 腫瘤 首選標志物 補充標志物

34、 肺癌 CEA、NSE、CYFRA21-1 TPA、SCC、ACTH、降鈣素、TSA肝癌 AFP AFU、GT、CEA、ALP乳腺癌 CA15-3、CEA CA549、hCG、降鈣素、鐵蛋白 胃癌 CA72-4 CEA、CA19-9、CA242前列腺癌 PSA、f-PSA PAP結腸直腸癌 CEA CA19-9、CA50 胰腺癌 CA19-9 CA50、CEA、CA125 卵巢癌 CA125 CEA、hCG、CA19-9 睪丸腫瘤 AFP、hCG宮頸癌 SCC CA125、CEA、TPA 膀胱癌 無 TPA、CEA 骨髓瘤 本-周蛋白、2-M 常用腫瘤標志物聯(lián)合檢測的臨床應用 常用腫瘤標志物聯(lián)

35、合檢測的臨床應用腫瘤的分子診斷腫瘤從本質上來講是基因出現(xiàn)了問題，本質上是一種基因病同一種腫瘤其驅動基因可能完全不同，對治療的反應，腫瘤的發(fā)展以及預后可能完全不同不同的腫瘤其驅動基因可能相同，對相同的針對性治療方案反應相似因此，針對腫瘤的分子診斷愈發(fā)重要腫瘤的分子診斷腫瘤從本質上來講是基因出現(xiàn)了問題，本質上是一種第一節(jié)腫瘤的分子生物學檢驗策略第一節(jié)腫瘤的分子生物學檢驗策略一、腫瘤的分子生物學檢驗策略1、檢測腫瘤相關基因包括癌基因、抑癌基因、腫瘤轉移相關基因等。2、檢測腫瘤相關病毒的基因致瘤性DNA病毒：HPV,HBV,EBV等致瘤性RNA病毒：人類T細胞白血病/淋巴瘤病毒1和HCV.3、檢測腫瘤

36、標志物基因或Mrna在血液中的含量能反應惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及對治療的反應一、腫瘤的分子生物學檢驗策略1、檢測腫瘤相關基因二、腫瘤的分子生物學檢驗技術1、標本的來源： 容易獲得（無創(chuàng)或微創(chuàng)）2、分析方法的選擇：敏感性高、特異性強，適合相應樣本的檢測方法分析DNA,RNA仍然是分子雜交、PCR、基因測序。3、新技術產生：基因芯片，高通量測序，分子病理學，分子顯像技術，高通量質譜技術等。二、腫瘤的分子生物學檢驗技術1、標本的來源：68腫瘤分子診斷的常用方法染色體數目異常：熒光原位雜交技術FISH致病基因結構異常檢測（1） 斑點雜交（dot blot hybridization）（2）等位基因特異的

37、寡核苷酸探針雜交（ASO） （3）單鏈構象多態(tài)性（SSCP） （4）限制性內切酶圖譜（restriction map）分析 （5）限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP ）（6）DNA 分子雜交（Southern blot）致病基因表達異常檢測（1） mRNA檢測 定量PCR（2）蛋白檢測免疫組化：定性、半定量、定位Western blot ：定量68腫瘤分子診斷的常用方法染色體數目異常：熒光原位雜交技術F第二節(jié)腫瘤診斷的生物標志物第二節(jié)腫瘤診斷的生物標志物70腫瘤診斷的生物標志物的發(fā)展第1階段（1963-1978）：

38、癌胚性抗原1963年 Abelev AFP1965年 Gold & Freeman CEA第2階段（1979-1989）：糖鏈抗原為主1980年 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-9）1981年 Bast CA125（OC125）第3階段（1990以后）：基因標志腫瘤基因標志70腫瘤診斷的生物標志物的發(fā)展第1階段（1963-1978）71一、腫瘤相關的染色體異常1、數目異常：某個癌細胞的染色體共104條，包括許多異常的染色體 71一、腫瘤相關的染色體異常722. 染色體結構異常易位、缺失、重復、環(huán)狀染色體和雙著絲粒染色體 例：Ph染色體（費城1號染色體），慢性粒細胞性白血

39、?。–ML） ，9號和22號染色體長臂易位 9號原癌基因abl和22號bcr基因組合成融合基因增高的酪氨酸激酶活性。 Ph臨床意義在于：95的CML都是Ph陽性，可以作為診斷的依據。有時Ph先于臨床癥狀出現(xiàn)，故又可用于早期診斷。 722. 染色體結構異常73二、腫瘤相關基因表達異常 原癌基因: sis、VEGF、EGFR、c-myc抑癌基因: APC、BRCA、p53、Rb細胞周期調節(jié)基因: cyclins、CDKs、CKIs細胞凋亡相關基因: Bcl-1、p53、bcr-abl基因組穩(wěn)定相關基因(DNA修復基因): APE1腫瘤轉移相關基因:nm23、WDNM、sis、p53腫瘤血管生成相關

40、基因: VEGF 、EGFR、p5373二、腫瘤相關基因表達異常 （一）原癌基因普遍存在于人類或其他動物固有的一類基因，其在生物進化過程中高度穩(wěn)定，對細胞無害，而且在控制細胞生長和分化中起重要作用。在環(huán)境致癌因素作用下，原癌基因發(fā)生點突變、易位激活、原癌基因擴增、癌基因甲基化程度降低被激活成活性形式的癌基因才引起細胞癌變。（一）原癌基因普遍存在于人類或其他動物固有的一類基因，其在(一)原癌基因點突變(point mutation) 癌基因在編碼順序的特定位置上的某一個核苷酸發(fā)生突變，使其表達蛋白質中相應的氨基酸發(fā)生變化，從而獲得了轉化細胞的活性 75mutation(一)原癌基因點突變(poi

41、nt mutation) (二)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation）基因重排（rearrangemant）： 有些癌基因從其染色體的正常位置轉移到另一染色體的某個位置，由于調控環(huán)境發(fā)生變化，導致從相對靜止狀態(tài)變成激活狀態(tài)，使原癌基因表達產物顯著增加而導致腫瘤的發(fā)生 76 (二)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（t(三)原癌基因獲得外源啟動子而激活 腫瘤細胞中原癌基因的表達水平可以其轉錄的mRNA或翻譯產物蛋白質的含量來表示 在原癌基因的上游插入外源性啟動子或增強子可激活原癌基因，使其表達產物增多 病毒的增強子常位于5端的長末端重復序列(1ong termi

42、nal repeat，LTR)內。如果增強子插入到原癌基因的附近或遠處，均使之激活，促使癌基因的表達比正常表達增高幾十甚至上百倍 77(三)原癌基因獲得外源啟動子而激活 腫瘤細胞中原癌基 (四)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)對阻抑基因的轉錄具有重要作用 78 (四)原癌基因甲基化程度降低而激活 （二）抑癌基因又稱腫瘤抑制基因，為一類可編碼對腫瘤形成起阻抑作用的蛋白質基因，正常情況下抑制細胞增殖、促進細胞分化。抑癌基因失活方式： 1）DNA點突變或缺失導致一個等位基因失活。 2）DNA甲基化和組蛋白去乙?；种埔粋€等位基因表達。（二）抑癌基因又稱腫瘤

43、抑制基因，為一類可編碼對腫瘤形成起阻抑（三）細胞周期調節(jié)基因細胞周期：正常連續(xù)分裂的細胞從前一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成所經歷的連續(xù)動態(tài)過程，也是多階段多因子參與的精確而有序的調控過程。特點：1）單向性：G1 S G2 M 2）階段性：因某種原因停滯下來，條件好轉，進入下一時項 3）檢查點：細胞各時項交叉處存在檢查點，通過檢查點才能進入下一個時項。（三）細胞周期調節(jié)基因細胞周期：正常連續(xù)分裂的細胞從前一次細胞周期運行的動力主要來自細胞周期蛋白依賴性激酶，它的活性受細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑調控。這些調控方式相互制約，形成一個復雜的細胞周期分子調控網絡。1、細胞周期依賴性

44、蛋白激酶CDK1-132、細胞周期蛋白CCND13、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDK4、細胞周期檢查點Chk1(三)細胞周期調節(jié)基因細胞周期運行的動力主要來自細胞周期蛋白依賴性激酶，它的活性受（四）細胞凋亡相關基因大致分為三組1、促進細胞凋亡基因2、抑制細胞凋亡基因3、細胞凋亡過程中表達的基因（四）細胞凋亡相關基因大致分為三組（五）維持細胞基因組穩(wěn)定相關基因DNA修復基因及基因組不穩(wěn)定性基因（六）促進和抑制腫瘤轉移的相關基因（七）腫瘤血管生成相關基因VEGF(血管內皮生長因子)（五）維持細胞基因組穩(wěn)定相關基因DNA修復基因及基因組不穩(wěn)定84三、腫瘤相關單核苷酸多態(tài)性1. SNP與腫瘤腫瘤易感

45、基因、腫瘤藥物治療相關基因腫瘤個體化診療2. SNP的研究思路研究對象差異性研究技術：PCR、芯片研究難點：樣本采集84三、腫瘤相關單核苷酸多態(tài)性85四、腫瘤相關表觀遺傳異常 （一）表觀遺傳（epigenetics）是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是細胞內除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質發(fā)生的改變，且這種改變在發(fā)育和細胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞。（二）分子機制：1、基因印記丟失，一對等位基因只表達來自親本一方的等位基因，而與性別無關。 2、DNA甲基化：例如啟動子區(qū)域的CpG島高甲基化所致抑癌基因轉錄沉默 3、組蛋白修飾與染色體重塑85四、腫瘤相關表觀遺傳異常86

46、五、腫瘤相關miRNA1、 miRNA與腫瘤miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療、預后2、miRNA類腫瘤標志物的研究思路研究對象：實體瘤、細胞、循環(huán)血、其他研究技術：定量PCR、western blot、芯片、免疫組化、細胞培養(yǎng)（增殖、遷移、浸潤）等等86五、腫瘤相關miRNA第三節(jié)腫瘤分子生物學檢驗的臨床應用第三節(jié)腫瘤分子生物學檢驗的臨床應用 肺癌 肺癌肺癌的分子遺傳特征1、細胞色素P450家族，絕大多數的致癌物包括內源性和外源性都需經過P450轉化，研究最多的CYP1A12、谷胱甘肽轉移酶（GST）家族,使致癌物失活3、NAT2家族，解毒作用肺癌的分子遺傳特征1、細胞色素P450家族，

47、絕大多數的致癌物90肺癌的分子生物學檢驗1、EGFR（原癌基因表皮生長因子受體）基因檢測 大多數在NSCLC中過表達且是重表皮生長要是治療靶標，EGFR是表皮生長因子相關酪氨酸受體家族的成員，通過與配體的結合，受體同源和異源二聚體化，從而激活受體內源性的酪氨酸激酶，并引發(fā)下游信號級聯(lián)反應，主要包括Ras-Raf-MAP激酶信號通路、P3K-Akt信號通路和STAT通路。這些信號通路對細胞的增值、分化、遷移和血管生成有很強的刺激效應。90肺癌的分子生物學檢驗91肺癌的分子生物學檢驗2、K-ras檢測 ras基因，特別是K-ras基因，與肺癌的發(fā)生及預后有 關。有20%-30%的NSCLC患者存在

48、K-ras基因突變。80%-90%的突變是12密碼子G-T引起的，導致K-ras蛋白組成性活化， NSCLC患者伴隨K-ras突變與預后不良有關， K-ras突變與EGFR突變是相互排斥的。伴隨K-ras突變的NSCLC患者EGFR-TK3藥物敏感性較差91肺癌的分子生物學檢驗92肺癌的分子生物學檢驗3、甲狀腺轉錄因子1（TTF-1）是一種分子量為38-40的核蛋白，在胎兒肺組織及成人型肺泡上皮中存在，而在型肺泡上皮中不表達，TTF-1高表達則EGFR突變率高，是服用EGFR-TK3藥物的優(yōu)勢人群。92肺癌的分子生物學檢驗93肺癌的分子生物學檢驗4、癌胚抗原（CEA） 表達于胎兒上皮細胞的一種

49、糖蛋白，用于檢測上皮性腫瘤，尤其是腺上皮來源的腺癌。93肺癌的分子生物學檢驗靶向EGFR的抗腫瘤藥物類別一：小分子酪氨酸激酶抑制劑（ EGFR TKI) 作用機制：抑制EGFR胞內區(qū)酪氨酸激酶活性，阻斷EGFR信號通路； 藥物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄羅替尼（羅氏）。類別二：單克隆抗體(mAb) 作用機制：與EGFR胞外區(qū)結合，阻斷配體與EGFR的結合； 藥物代表：西妥昔（默克）；貝伐單抗（羅氏）。靶向EGFR的抗腫瘤藥物類別一：小分子酪氨酸激酶抑制劑（ E 乳腺癌 乳腺癌乳腺癌基因檢測的意義BRCA1:1990年研究者發(fā)現(xiàn)一種直接與遺傳性乳腺癌有關的基因，命名為BRCA1，1994年又發(fā)

50、現(xiàn)另外一種與乳腺癌有關的基因，稱為BRCA2。乳腺癌基因檢測的意義BRCA1:1990年研究者發(fā)現(xiàn)一種直接乳腺癌遺傳檢測適宜人群 (如果有以下因素，強烈建議接受乳腺癌BRCA檢查)1、一個或多個直系親屬有乳腺癌史，如母親或姐妹 2、家族成員里有早發(fā)乳腺癌患者，發(fā)病年齡早于40 3、家族成員里兩代以上出現(xiàn)乳腺癌患者 4、家族成員有雙側乳腺癌患者 5、家族成員里有卵巢癌患者 6、家族成員有男性成員乳腺癌患者 7、一個或多個家族成員攜帶BRCA基因突變，即遺傳檢測陽性 乳腺癌遺傳檢測適宜人群 (如果有以下因素，強烈建議接受乳腺癌乳腺癌的分子生物學檢測1、c-erb B-2/HER2基因的檢測是乳腺癌

51、中較常見，易激活的原癌基因c-erb B-2/HER2基因高表達往往生存率低，惡性程度高2、雌激素受體和孕激素受體的檢測ER和PR陽性的乳腺癌可以進行內分泌治療乳腺癌的分子生物學檢測1、c-erb B-2/HER2基因的腫瘤生物學行為決定乳癌治療選擇NegativePositiveER / PgRHER-2NegativePositive 化療 Avastin內分泌治療抗Her-2治療腫瘤生物學行為決定乳癌治療選擇NegativePosi 白血病 白血病1、白血病相關基因突變（1）C-KIT基因突變（2）FLT3基因突變 (3) NPM基因突變 （4）N-ras基因突變 （5）NOTCH1基因

52、突變1、白血病相關基因突變（1）C-KIT基因突變2、白血病相關基因異常表達（1）WT1基因異常表達，為抑癌基因的一種，是急性白血病獨立的預后因子（2）HOX11基因異常表達，此類患者預后較好，化療效果佳。2、白血病相關基因異常表達（1）WT1基因異常表達，為抑癌基3、白血病融合基因 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉移到第22對染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達增高，蛋白質產物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導致慢性粒細胞白血病的發(fā)生 3、白血病融合基因 染色體易位使位于9q34的c-ab 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉移到第22對染

53、色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達增高，蛋白質產物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導致慢性粒細胞白血病的發(fā)生 104 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉移到第22對染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達增高，蛋白質產物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導致慢性粒細胞白血病的發(fā)生 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉移到第22結直腸癌結直腸癌大腸癌靶向治療敏感基因EGFR的傳導通路大腸癌靶向治療敏感基因EGFR的傳導通路大腸癌靶向治療敏感性基因檢測K-RAS基因檢測已經成為大腸癌患者治療前必做的常規(guī)檢查，是目前醫(yī)生

54、了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法K-RAS基因檢測可以篩選出對抗EGFR(表皮生長因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實現(xiàn)腫瘤病人的個體化治療，從而達到良好的預后。早期檢測K-RAS還可以通過該基因的狀態(tài)了解到病人的復發(fā)轉移風險，為將來選擇最佳治療做好準備。 大腸癌靶向治療敏感性基因檢測K-RAS基因檢測已經成為大腸癌 第十七章 藥物代謝與毒副作用相關基因 的分子生物學檢驗技術濱醫(yī)附院檢驗科 袁笑 第十七章 濱是藥三分毒？ 你吃錯藥啦!你藥吃多啦！是藥三分毒？ 你吃錯藥啦!你藥吃多啦！不合理用藥導致嚴重不良反應 全球死亡患者中，三分之一是由于不合理用藥，而并非死于自然疾病本身。

55、 WHO（聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織）美國每年有10萬人死于藥物不良反應，直接和間接經濟損失達120億美元。FDA(美國食品和藥物管理局)根據藥監(jiān)局和食品藥品管理局等機構的統(tǒng)計：1、中國每年有5000萬的住院病人，其中至少250萬與藥物不良反應有關，20多萬人因此而死亡。2、我國住院病人中有20是由于不合理用藥造成二次住院。不合理用藥導致嚴重不良反應 全球死亡患者中，三分之一是由于不傳統(tǒng)用藥的弊端 癥狀體征及儀器檢查診斷藥物治療經驗處方藥物治療A藥B藥C藥D藥傳統(tǒng)經驗性用藥代價1、耗時多2、花費大3、療效差4、不良反應多5、毒副作用幾率大傳統(tǒng)用藥的弊端 癥狀體征及儀器檢查診斷藥物治療經驗處方藥物治藥物

56、代謝因人而異生物轉化肝臟藥物藥物重吸收代謝產物排泄藥物重吸收腎臟藥物毒性但有效藥物毒性且無效藥物無毒性且有效藥物無毒性也無效同種同量藥物治療一種類型的藥并不適合所有人藥物代謝酶藥物代謝因人而異生物轉化肝臟藥物藥物重吸收代謝產物排泄藥物重決定藥物反應的因素體重/身高性別老人/小孩/孕婦病史并發(fā)癥環(huán)境因素遺傳因素（基因）不同人群決定藥物反應的因素體重/身高性藥代動力學藥效動力學藥物療效和毒性的個體差異基因組基因變異(單核苷酸多態(tài)性)藥物靶點藥物轉運體藥物代謝酶約59%的藥物不良反應與遺傳相關基因變異決定藥物反應個體差異 決定性因素藥代動力學藥效動力學藥物療效和毒性的個體差異基因組基因變異(單核苷酸

57、多態(tài)性（SNP） 導致人類遺傳易感性的重要因素導致人類藥物代謝和反應差異的關鍵因素由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性（SNP） 導致人類遺傳易感性的重要因素由單個第一節(jié)藥物代謝酶基因的分子生物學檢驗第一節(jié)藥物代謝酶基因的分子生物學檢驗第一節(jié)藥物代謝酶相代謝酶CYP2D6、2C19、2C9、3A4、3A5等相代謝酶UGT1A1、1A9TPMT等藥物轉運蛋白MDR1藥物靶蛋白（受體等）ADRB2人類白血球抗原HLA-B第一節(jié)藥物代謝酶相代謝酶CYP2D6、2C19、2C9、3FDA確認受基因多態(tài)性影響的藥物 基因或變異名稱個體化應用的藥物CYP2C19氯吡格雷、伏立康唑、奧美拉唑、泮托拉唑、艾美拉唑、雷貝拉唑、地西泮、那非那韋CYP2C9塞來考昔、華法林CYP2D6阿托西汀、文拉法辛、利哌利酮、塞托溴胺吸入、他莫昔芬、噻嗎洛爾、氟西汀、奧氮平、西維美林、托特羅定、特比萘芬、曲馬多、氯氮平、阿立哌唑、美托洛爾、普萘洛爾、卡維地洛、普羅帕酮、硫利達嗪、普羅替林、可待因DPYD卡