新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件

1、新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用內(nèi)容提綱一實(shí)驗(yàn)方法介紹檢測蛋白表達(dá)水平方法：Western blot, 2D-gel, 免疫共沉淀，Shotgun，免疫組化，流式細(xì)胞測定，激光掃描共聚焦顯微，綠熒光蛋白標(biāo)記法，螢光素酶標(biāo)記法，ELISA.檢測DNA/RNA表達(dá)水平方法：Southern blot, Northern blot, 原位雜交, PCR.基因操作方法: 基因敲除，基因沉默.內(nèi)容提綱一實(shí)驗(yàn)方法介紹內(nèi)容提綱二實(shí)用技術(shù)介紹細(xì)胞活性檢測：MTT, MTS，CCK-8, Calcein-AM.細(xì)胞凋亡檢測：Western blot, 流式，TUNEL, Hoechst 3325

2、8，DNA ladder.活性氧自由基（ROS）檢測：DCF, SOD, GSH, ESR.內(nèi)容提綱二實(shí)用技術(shù)介紹Western blot原理：Western blot利用了蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。在一定pH的緩沖液中，特定的蛋白質(zhì)具有固定的電荷數(shù)。在電場的作用下，蛋白質(zhì)將按電荷數(shù)及蛋白質(zhì)分子量大小在凝膠中分布。SDS法的Western blot進(jìn)一步簡化，SDS的應(yīng)用使得所有的蛋白都帶均勻的負(fù)電荷，此時(shí)蛋白電泳的距離只與蛋白分子量大小有關(guān)。 Western blot原理：Western blot原理：凝膠是由聚丙烯酰胺組成，聚丙烯酰胺的濃度決定了膠中孔徑的大小，孔徑越大，蛋白運(yùn)動(dòng)越容易，越快，對(duì)大

3、分子量的蛋白的分離效果好。反之亦然。測定大分子量蛋白（）時(shí)宜用低濃度膠，測定小分子量蛋白（）時(shí)宜用高濃度膠。另有梯度膠（例如），可以保證在一定范圍內(nèi)的蛋白都相對(duì)均勻分離。Western blot原理：轉(zhuǎn)膜方法主要分為濕轉(zhuǎn)(Wet transfer)和半干轉(zhuǎn)（Semi-dry transfer）。濕轉(zhuǎn)速度較慢，操作難度較大，易出現(xiàn)氣泡，但轉(zhuǎn)膜效率高，特別對(duì)大分子量蛋白效果好。半干轉(zhuǎn)的特點(diǎn)與濕轉(zhuǎn)正好相反，對(duì)大分子量蛋白容易轉(zhuǎn)不上。根據(jù)實(shí)際情況選擇。轉(zhuǎn)膜方法主要分為濕轉(zhuǎn)(Wet transfer)和半干轉(zhuǎn)（S新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件Western blot電泳完成后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到固相載體（

4、NC膜或者PVDF膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)需使用脫脂牛奶等封閉，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶,同位素或者熒光標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色,放射自顯影或熒光成像以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。 Western blot電泳完成后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到固相載體（示例實(shí)驗(yàn)步驟：蛋白質(zhì)抽提 蛋白濃度測定 ：按試劑盒說明書，用BCA法測定蛋白濃度 。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS) ：玻璃板夾槽中依次加入分離膠和濃縮膠，待其凝固；根據(jù)濃度取適量待測蛋白與5x上樣緩沖液

5、混勻后,95度變性10分鐘,加入上樣孔中，浸于電泳緩沖液，以75V（濃縮膠）及120V（分離膠）恒壓電泳。轉(zhuǎn)膜 ：裁切與凝膠同樣大小的NC膜和濾紙，NC膜置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡30min以上。按順序依次放置濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，半干法以40mA恒流轉(zhuǎn)膜 2 h。示例實(shí)驗(yàn)步驟：抗原抗體反應(yīng): 蛋白質(zhì)以脫脂牛奶封閉1h后，與一抗4孵育過夜，與二抗室溫孵育1h，TBST洗滌4次，每次5min。顯色:加入DAB顯色5min，蒸餾水洗終止顯色。凝膠分析軟件Quantity one測灰度值。 顯色系統(tǒng)多種多樣。傳統(tǒng)的二抗通常是與辣根過氧化酶結(jié)合的抗體，遇DAB顯色或者與專用試劑盒試劑反應(yīng)使膠片曝光。新型

6、二抗與熒光物質(zhì)結(jié)合，在專用的熒光成像儀下讀取熒光印跡，可以方便地進(jìn)行多通道western blot (multiplex western blotting),免去切膜或者抗體清除的步驟.抗原抗體反應(yīng): 顯色系統(tǒng)多種多樣。傳統(tǒng)的二抗通常是與辣根2D-Gel2D-Gel免疫共沉淀是一種著重檢測蛋白-蛋白或蛋白-核酸間聯(lián)系的方法。基本原理是利用抗原抗體結(jié)合,以及與抗體相連的小珠（Beads）,以物理方式將目標(biāo)蛋白連同與其相結(jié)合的物質(zhì)分離出來單獨(dú)分析。分離后，解離蛋白，以Western blot的方式檢測潛在目標(biāo)的水平，即可得知目標(biāo)間在細(xì)胞中是否有緊密聯(lián)系。免疫共沉淀是一種著重檢測蛋白-蛋白或蛋白-核

7、酸間聯(lián)系的方法。免疫共沉淀免疫共沉淀Chromatin immunoprecipitation （CHIP）染色質(zhì)免疫沉淀，與蛋白的共沉淀相似，不同之處是利用甲醛等產(chǎn)生DNA與其上蛋白質(zhì)的交聯(lián)，從而用帶小珠的抗體將蛋白質(zhì)與DNA一起“拉下”，用PCR檢測拉下的DNA.Chromatin immunoprecipitation “獵槍”法（Shotgun proteomic）“獵槍”法（Shotgun proteomic）免疫組化Immunohistochemistry原理類似Western blot，但直接在組織切片（或在滿足一定條件的情況下，整個(gè)組織）上進(jìn)行，保留了原始組織結(jié)構(gòu)，能提供更多的

8、信息。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)，目標(biāo)蛋白表達(dá)不高時(shí)不易檢測到，量化統(tǒng)計(jì)不易。免疫組化Immunohistochemistry原理類似W新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件免疫組化樣本制備通常來講，免疫組化用的樣本為組織切片（幾微米厚）. 足夠小且能被完全通透化（Permeabilize)的組織可以直接做在位免疫組化，但應(yīng)用不如原位雜交來得廣泛。冷凍切片信號(hào)較好，但受時(shí)間，地點(diǎn)，存放條件等限制。石蠟切片具有儲(chǔ)存，使用方便等優(yōu)點(diǎn)，但需要抗原修復(fù)方可進(jìn)行免疫組化染色，且效果一般差于冷凍切片。免疫組化樣本制備通常來講，免疫組化用的樣本為組織切片（幾微米免疫組化的抗體使用免疫組化中使用的一

9、抗通常與Western blot中用的相同。二抗被設(shè)計(jì)成與一抗的宿主結(jié)合的抗體，一般結(jié)合有探測用分子，免疫組化中常用的是生物素（biotin）。一抗宿主一般不能與實(shí)驗(yàn)所用組織同種，但必要時(shí)也有專用試劑可以允許這種應(yīng)用 例子：MOM （Mouse on Mouse) Kit。免疫組化的抗體使用免疫組化中使用的一抗通常與Western 不同的探測方法直接探測法：直接標(biāo)記一抗，不需使用二抗來探測目標(biāo)蛋白表達(dá)水平，最簡單但敏感度最差，基本已不用。間接探測法：一抗沒有標(biāo)記，然后用抗一抗的二抗來間接探測目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。有信號(hào)放大作用，敏感度好，節(jié)省試劑。不同的探測方法直接探測法：直接標(biāo)記一抗，不需使用二

10、抗來探測目間接探測法介紹：PAP法PAP: peroxidase anti-peroxidase method PAP法使用未標(biāo)記的一抗和二抗，之后加入第三層的探針：peroxidase及其抗體，且抗體的抗原性與一抗相同，都與二抗相結(jié)合。如此以二抗為中心形成“三明治”結(jié)構(gòu)。 間接探測法介紹：PAP法PAP: peroxidase anAvidin-Biotin Complex (ABC) 法免疫組化最常用方法之一。也是形成“三明治”樣結(jié)構(gòu)，使用未標(biāo)記的一抗，生物素（biotin）標(biāo)記的二抗，生物素標(biāo)記的peroxidase以及生物素結(jié)合蛋白（Avidin）。需要封閉內(nèi)源性的 peroxidas

11、e。必要時(shí)，封閉內(nèi)源性 的biotin。Avidin-Biotin Complex (ABC) 法免Labeled Streptavidin Biotin (LSAB) 法與ABC法相似，但使用Strptavidin替換一般的生物素結(jié)合蛋白，其與組織的非特異性結(jié)合較少，因此可以降低背景。Labeled Streptavidin Biotin (L新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件免疫組化中的注意要點(diǎn)樣本的準(zhǔn)備封閉（非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，內(nèi)源性的peroxidase，內(nèi)源性的biotin）抗體濃度培養(yǎng)溫度顯色時(shí)間 免疫組化中的注意要點(diǎn)樣本的準(zhǔn)備流式細(xì)胞儀1 實(shí)驗(yàn)原理: 流式細(xì)胞儀(Flow Cy

12、tometer)是采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞或顆粒懸液進(jìn)行快速分析的自動(dòng)化分析儀器。流式細(xì)胞術(shù)（ Flow Cytometry)是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)。它通過對(duì)流動(dòng)液體中排成單列的細(xì)胞或顆粒進(jìn)行逐個(gè)分析、測定細(xì)胞或顆粒的光散射和熒光情況，以獲得其大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理或化學(xué)特征。要求細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中。對(duì)于貼壁細(xì)胞，需要先將其游離出來，有一定損傷。 流式細(xì)胞儀1 實(shí)驗(yàn)原理:流式細(xì)胞儀應(yīng)用舉例細(xì)胞凋亡、死亡的檢測-Annexin V/PI雙染色法 1 原理細(xì)胞凋亡的早期生化特征之一是氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶活性的降低使磷脂酰絲氨酸(Phosphatdylserine)

13、“翻到”細(xì)胞膜的外層。熒光標(biāo)記Annexin V-FITC(AV)和碘化丙啶(propidum iodide, PI)雙染可區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死, 對(duì)AV和PI均不染色的是正常細(xì)胞, 對(duì)AV染色對(duì)PI不染色的為早期凋亡細(xì)胞, 對(duì)AV和PI均染色的為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞。 2 結(jié)果判斷凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右

14、上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。 流式細(xì)胞儀應(yīng)用舉例新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件 Ca2+i的檢測 Fluo-3-AM熒光 染色原理用熒光探針Fluo-3-AM進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶水解為Fluo-3, 后者是鈣離子螯合劑, 與鈣離子形成的復(fù)合物經(jīng)紫外激發(fā)可產(chǎn)生熒光, 流式細(xì)胞儀通過檢測其熒光強(qiáng)度而間接反映胞內(nèi)游離鈣水平。 人參皂苷 (saponin) 降低缺氧的心肌細(xì)胞中的鈣超載。Li et al. The saponin of red ginseng protects the cardiac myocytes

15、against ischemic injury in vitro and in vivo, Phytomedicine, 19(6) 477-483 Ca2+i的檢測 Fluo-3-AM熒光 染色人參皂線粒體膜電位（）的測定rhodanmine 123 熒光染色原理氧化刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可致線粒體兩種功能改變: 一是線粒體膜電位降低和線粒體通透性孔開放, 二是線粒體產(chǎn)生活性氧。線粒體對(duì)rhodanmine 123的攝取依賴其膜電位, 分析rhodanmine 123的熒光強(qiáng)度可反映線粒體的膜電位。 Black: control, Purple: UVB model, Yellow: UVB+0.

16、25%PCF, Red: UVB+0.5%PCF, Blue: UVB+1%PCF, Green: UVB+0.1%VitC.線粒體膜電位（）的測定rhodanmine 123 激光掃描共聚焦顯微(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）1 基本原理 激光共聚焦顯微鏡是近年來發(fā)展起來的一種結(jié)合激光掃描、計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析與顯微鏡技術(shù)的新技術(shù)，新儀器。它采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)定量分析被激光掃描的物體所激發(fā)出的熒光數(shù)量的變化，具有圖像清晰、特異性高、敏感性強(qiáng)、可精確定量等優(yōu)點(diǎn)。2 優(yōu)點(diǎn)激光共聚焦顯微鏡做間接免疫熒光組化染色并做定量分析，利用激光聚焦熒光標(biāo)記和系統(tǒng)軟件分析

17、對(duì)組織進(jìn)行深層與斷層掃描，不破壞組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，可準(zhǔn)確深層次定位和精確定量，是轉(zhuǎn)化了的精確定量分析。激光掃描共聚焦顯微(Confocal Laser Scann激光共聚焦顯微鏡一般都有2個(gè)以上不同波長的激光管，因此只要將標(biāo)本標(biāo)記上不同波長的熒光，就可以在同一張切片上同時(shí)分析2種或更多不同指標(biāo)的變化，并比較它們之間的比值變化，方便而精確。激光共聚焦顯微鏡可以根據(jù)科研需要，提供純熒光、白光、以及熒光與白光合成的圖像等多種圖像。 以往免疫熒光染色多要求冰凍新鮮組織標(biāo)本，如用石蠟切片做免疫熒光染色，在普通熒光顯微鏡下觀察，常因背景非特異性熒光過強(qiáng)而影響觀察結(jié)果。但如用激光共聚焦顯微鏡掃描石蠟切片的熒光

18、染色，可獲得清晰的圖像。激光共聚焦顯微鏡一般都有2個(gè)以上不同波長的激光管，因此只要3 應(yīng)用定性定量定位熒光分析:CLSM可對(duì)單、雙或三色標(biāo)記的細(xì)胞及組織標(biāo)本的熒光進(jìn)行定性定量定位分析，還可測定膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。Ca2 和pH等細(xì)胞內(nèi)離子的實(shí)時(shí)定量測定:利用Fluo-3、Fura2等熒光探針，CLSM可以測定Ca2 在活細(xì)胞內(nèi)的濃度變化。CLSM可測定單個(gè)或一群細(xì)胞內(nèi)的ca2 濃度，并提供細(xì)胞內(nèi)Ca2 分布的二維及至三維圖像。另外，如果對(duì)細(xì)胞施加外部的刺激，CLSM就能觀察到細(xì)胞內(nèi)各點(diǎn)的Ca2 濃度在外部刺激下隨時(shí)間而產(chǎn)生的變化。這對(duì)于研究Ca2 等離子細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)有意義。利用SN

19、AFL類探針可對(duì)單個(gè)或一群細(xì)胞內(nèi)的pH及細(xì)胞內(nèi)pH的變化進(jìn)行測定。使用雙熒光探針Fluo一3和CNARF可進(jìn)行Ca2 和pH同時(shí)測定。細(xì)胞的物理化學(xué)動(dòng)態(tài)監(jiān)測：CLSM可對(duì)細(xì)胞形狀、周長、面積、平均熒光強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測定，能對(duì)細(xì)胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量、定性、定時(shí)及定位測定。3 應(yīng)用藥理研究中的應(yīng)用：CLSM可直接觀察藥物在細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞水平的分布，并可了解藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的特殊親和力及其藥物作用，從而推斷細(xì)胞內(nèi)藥物定位及細(xì)胞耐藥的相關(guān)機(jī)制，還可了解其在細(xì)胞內(nèi)代謝的過程。例CLSM可

20、直接觀察扇貝多肽（PCF）在細(xì)胞的定位。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記PCF，顯微鏡下確定PCF作用位點(diǎn)在細(xì)胞膜上。圖3 PCF保護(hù)HaCaT細(xì)胞的最初作用靶點(diǎn)藥理研究中的應(yīng)用：圖3 PCF保護(hù)HaCaT細(xì)胞的最初作激光顯微細(xì)胞外科技術(shù)：CLSM可將激光作為“光子刀”使用，完成諸如細(xì)胞膜瞬間穿孔，線粒體、溶酶體等細(xì)胞器燒灼，染色體精確切割和神經(jīng)元突起切除等一系列細(xì)胞外科術(shù)。在亞細(xì)胞定位研究中的應(yīng)用：經(jīng)熒光探針標(biāo)記細(xì)胞器，CLSM可探測光敏劑和探針熒光圖像，實(shí)現(xiàn)對(duì)光敏劑在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位，并進(jìn)行定性和定量分析。在藥物抗腫瘤活性研究中的應(yīng)用：利用CLSM觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄細(xì)胞的熒光程度，以細(xì)胞的

21、熒光程度反映DNA的含量，從而判斷藥物的抗癌活性。在釋藥過程研究中的應(yīng)用：由于CLSM的實(shí)時(shí)觀測能力，可對(duì)控釋藥物的釋藥過程中藥物損耗變化進(jìn)行觀察。4 缺點(diǎn)：不能觀察到大部分的膜結(jié)構(gòu)特征，尤其是ultra filtration膜結(jié)構(gòu)。成像質(zhì)量與掃描速度始終是一對(duì)矛盾。 掃描過程耗時(shí)較長，且只能掃描不動(dòng)的微生物，許多活動(dòng)的大型微生物因運(yùn)動(dòng)比較劇烈而對(duì)成像造成一定影響。某些熒光染料可能會(huì)對(duì)某些活體細(xì)胞的活性造成一定的負(fù)面影響，因此宜選擇合適的熒光染料，同時(shí)適當(dāng)?shù)卣{(diào)整激光的光強(qiáng)，宜用最弱的光對(duì)標(biāo)本進(jìn)行照射掃描。激光顯微細(xì)胞外科技術(shù)：Reporter Assay為檢測特定基因能否在目標(biāo)生物體內(nèi)表達(dá)及表

22、達(dá)水平，Reporter assay常被使用。PromoterTarget GeneReporter GenePromoterTarget Gene ProductsReporter ProductsEasy DetectionReporter Assay為檢測特定基因能否在目標(biāo)生物體內(nèi)綠熒光蛋白標(biāo)記Osamu Shimomura, Martin Chalfie 及 Roger Tsien 于2008年因綠熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 綠熒光蛋白標(biāo)記Osamu Shimomura, Martin熒光素酶標(biāo)記熒光素酶標(biāo)記直接ELISA:直接使用酶標(biāo)記的一抗探測固定的抗原。最為簡單，避免二抗可

23、能的交叉反應(yīng)，但敏感性較差，需要大量昂貴的標(biāo)記抗體。間接ELISA: 不直接標(biāo)記一抗，而是標(biāo)記抗一抗的二抗。信號(hào)可以被有效放大，且一抗免疫活性不會(huì)受標(biāo)記的影響。但二抗可能發(fā)生交叉反應(yīng)?！叭髦巍?ELISA:先在盤中固定一層捕獲抗體（Capture antibody），以之將目標(biāo)抗原捕獲，之后再使用一層標(biāo)記的探測抗體。兩種抗體必須小心選擇以避免相互之間的反應(yīng)。此法不需純化抗原，同時(shí)具有極高的敏感性和特異性。但對(duì)抗原有要求：至少有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。競爭性 ELISA:樣本和純化并事先固定的目標(biāo)抗原對(duì)標(biāo)記的抗體進(jìn)行競爭，如果樣本中存在目標(biāo)抗原，最終得到的信號(hào)就會(huì)下降。此法可用于不純的樣本，重復(fù)性可靠，

24、但敏感性和特異性都較低。ELISA （Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）ELISA （Enzyme-Linked ImmunoSorELISA （Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）ELISA （Enzyme-Linked ImmunoSor酶標(biāo)儀1 原理 酶標(biāo)儀（Microplate Reader）是對(duì)用專用反應(yīng)盤進(jìn)行的，建立在吸光度改變基礎(chǔ)上的各種實(shí)驗(yàn)進(jìn)行讀取的設(shè)備，因其主要用途之一是讀取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果而得名。但其也可讀取其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如蛋白定量，各種酶活性檢測，MTT等。 新式

25、酶標(biāo)儀除讀取一般吸光度外，還可以讀取熒光數(shù)據(jù)：實(shí)驗(yàn)者指定激發(fā)光波長及放射光波長，帶熒光讀取功能的酶標(biāo)儀即可讀取該數(shù)據(jù)。同時(shí)還有的酶標(biāo)儀帶加溫，振蕩，定時(shí)重復(fù)讀取等等功能，極大地方便了實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀1 原理Southern BlottingSouthern BlottingEdwin Southern, Southern Blotting的發(fā)明者。左圖為他在Nature上關(guān)于Southern Blotting的文章中的例圖。Edwin Southern, Southern BlottNorthern BlottingNorthern BlottingIn situ hybridization (原

26、位雜交技術(shù))1 原理原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細(xì)胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。In situ hybridization (原位雜交技術(shù))新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件舉例：原位雜交檢測p21mRNA將用DEPC處理后的無菌蓋玻片（細(xì)胞飛片）置入6孔培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞于孔內(nèi)，37 、5 % CO2培養(yǎng)至細(xì)胞80融合，處理同1.2細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞飛片用中性樹膠粘于載玻片上，4多聚甲醛固定20 min，PBS洗5 min2次，系列酒精脫水。蛋白

27、酶K消化細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗，多聚甲醛固定及酒精系列脫水后于37用不含探針的雜交液預(yù)雜交45 min。加入含探針90 gL-1的雜交液，置于密閉濕盒中，60過夜。雜交結(jié)束后，NBT顯色，中性樹膠封片。舉例：原位雜交檢測p21mRNA新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件PCR (Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是研究工作中最常用到的技術(shù)之一。PCR (Polymerase Chain ReactionTaq DNA聚合酶在黃石國家公園沸泉的耐熱細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)并分離，在72攝氏度下可正常反應(yīng)，高達(dá)95攝氏度的情況下仍不變性，是PCR反應(yīng)得以進(jìn)行的基礎(chǔ)?，F(xiàn)代技術(shù)已經(jīng)在此基礎(chǔ)

28、上發(fā)展出多種改良型的耐高溫DNA聚合酶，使反應(yīng)效率提升，反應(yīng)條件要求降低。Taq DNA聚合酶在黃石國家公園沸泉的耐熱細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)并分離PCR條件DNA聚合酶。反應(yīng)所需模板（Template），DNA分子。反應(yīng)所需引物（Primer），兩個(gè)方向。反應(yīng)所需原料（dNTPs）。適宜的緩沖液。適宜的反應(yīng)溫度。Real-time PCR還需要熒光染料。目前很多試劑廠商以“Master Mix”的形式提供PCR試劑，極大地方便了實(shí)驗(yàn)。PCR條件DNA聚合酶。PCR的分類以DNA為起始點(diǎn)的PCR （目的為大量復(fù)制擴(kuò)增目標(biāo)基因）。以RNA為起始點(diǎn)的PCR （RT-PCR，目的為檢測目標(biāo)基因表達(dá)強(qiáng)度），其又可分

29、為一般的RT-PCR和Real-time RT-PCR。PCR的分類以DNA為起始點(diǎn)的PCR （目的為大量復(fù)制擴(kuò)增目RT-PCR的一般步驟1. RNA的抽提 經(jīng)典的方法是利用RNA在酒精中溶解度低使之析出。較新的RNA抽提試劑盒在此基礎(chǔ)上利用了能特異性與RNA結(jié)合的微型分離柱，大大提高RNA產(chǎn)率和純度。2. 檢測RNA質(zhì)量和濃度 比色法檢測OD260/280和OD260/230，前者在DNA應(yīng)該為1.8而RNA應(yīng)該為2左右，后者應(yīng)該在2.0-2.2左右. Nanodrop儀器可用極小量樣本作快捷而相對(duì)準(zhǔn)確的檢測。RT-PCR的一般步驟1. RNA的抽提RT-PCR的一般步驟3. 逆轉(zhuǎn)錄。一般應(yīng)

30、用試劑盒進(jìn)行，將逆轉(zhuǎn)錄酶，mRNA逆轉(zhuǎn)錄引物及相應(yīng)的原料，緩沖液等與抽提到的RNA混合，在適宜溫度下，從RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。4. PCR反應(yīng)。將PCR各原料，引物及模板混合后，在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。如為一般RT-PCR，反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物電泳，EB染色后凝膠成像分析，如為Real-time PCR，反應(yīng)結(jié)束后直接取數(shù)據(jù)分析即可。RT-PCR的一般步驟3. 逆轉(zhuǎn)錄。一般應(yīng)用試劑盒進(jìn)行，將逆半定量RT-PCR直接完成指定周期數(shù)的PCR反應(yīng)后，以電泳及EB染色法確定終產(chǎn)物的量。優(yōu)點(diǎn)：不需特別試劑和儀器，成本低廉。缺點(diǎn)：檢測的敏感度較差，實(shí)驗(yàn)步驟較繁瑣，且涉及有毒試劑EB的使用。半定量RT-PCR

31、直接完成指定周期數(shù)的PCR反應(yīng)后，以電泳及Real-Time PCR借助與雙鏈DNA特異性結(jié)合發(fā)出熒光的特殊染料（如SYBR Green），在每一個(gè)PCR周期完成后都讀取一次產(chǎn)物的量，可以得到實(shí)時(shí)的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的數(shù)量并較精確地定量分析。優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)敏感度好，CT(Cycle threshold)值的測定避免了非線性擴(kuò)增對(duì)結(jié)果的干擾。缺點(diǎn)：需要專用PCR儀器，器材及試劑價(jià)格較昂貴。Real-Time PCR借助與雙鏈DNA特異性結(jié)合發(fā)出熒光Real-Time PCR示例注意在使用SYBR Green為基礎(chǔ)的Real-time PCR時(shí)要檢測熔化曲線以確定得到的是單一產(chǎn)物。Real-Time PC

32、R示例注意在使用SYBR GreenPCR易出現(xiàn)的問題產(chǎn)物錯(cuò)誤：引物設(shè)計(jì)不佳/結(jié)合溫度有誤/存在污染/鎂離子濃度不當(dāng)。無產(chǎn)物：引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或引物數(shù)量不足/存在干擾反應(yīng)物質(zhì)/污染/實(shí)驗(yàn)方法或設(shè)備問題。多重產(chǎn)物：結(jié)合溫度設(shè)置太低/鎂離子濃度不當(dāng)/引物過多或生成引物二聚體/外來DNA污染。PCR易出現(xiàn)的問題產(chǎn)物錯(cuò)誤：引物設(shè)計(jì)不佳/結(jié)合溫度有誤/存在多重產(chǎn)物及解決實(shí)例左上為多重產(chǎn)物實(shí)例。可以看到雖然只加入一種引物，此反應(yīng)卻生成了兩種產(chǎn)物。調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件（主要是結(jié)合溫度）后，同一反應(yīng)得到均一產(chǎn)物。多重產(chǎn)物及解決實(shí)例左上為多重產(chǎn)物實(shí)例。可以看到雖然只加入一種MicroarrayMicroarray基因敲除經(jīng)

33、典的基因敲除法（Knockout），將目標(biāo)基因替換為一個(gè)外源性的基因（常用耐新霉素基因以方便篩選細(xì)胞），從而敲除目標(biāo)基因。相對(duì)來講，經(jīng)典基因敲除法較為簡單。但有一些不足之處，如有的基因敲除就無法讓動(dòng)物生存，有的會(huì)被代償?shù)??；蚯贸?jīng)典的基因敲除法（Knockout），將目標(biāo)基因替換條件敲除（Conditional Knockout）一般是靠Cre-LoxP/FLP-Frt 重組系統(tǒng)來完成，目標(biāo)基因上被加入LoxP或Frt元素，帶有LoxP的小鼠與在某些組織上特異性表達(dá)Cre（或者Flp）的小鼠交配，后代的特定器官上的該基因即被敲除。易導(dǎo)致錯(cuò)位翻譯。條件敲除（Conditional Knocko

34、ut）一般是靠四環(huán)素控制的條件基因表達(dá)/沉默：轉(zhuǎn)錄的激活子（Transactivator）rTA，在無四環(huán)素存在的前提下，能與一個(gè)特別定制的操縱子tet-O結(jié)合，激活下游目標(biāo)基因的表達(dá)，而四環(huán)素（如多西環(huán)素）的應(yīng)用將使此激活子與四環(huán)素結(jié)合，迅速中止目標(biāo)基因的表達(dá)。四環(huán)素控制的條件基因表達(dá)/沉默：轉(zhuǎn)錄的激活子（TransacRNA干擾1 原理： 近年來的研究表明，將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptional gene silencing, PT

35、GS)被稱為RNA干擾（RNAi）。2 小的干涉RNA（siRNA）： 是在RNA干涉過程中人工體外合成的小片段RNA，由19-21個(gè)堿基對(duì)的核心部分和每條鏈上2個(gè)懸掛的核苷酸組成。3 應(yīng)用： 研究信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因功能 RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間，控制基因表達(dá)的部位。 開展基因治療的新途徑 一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性， 設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因表達(dá)同時(shí)降低的表現(xiàn)，也可同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。為治療多基因調(diào)控的腫瘤疾病，帶來新

36、的治療策略。RNA干擾新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用優(yōu)質(zhì)課件Fas干擾實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 空白對(duì)照組、UVB模型組、UVB試劑對(duì)照組 (不加siRNA,僅加入轉(zhuǎn)染試劑)、UVBsiRNA 組 接種細(xì)胞至6 孔板 讓其在有血清無抗生素的培養(yǎng)基中生長，使得轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)60%80% 轉(zhuǎn)染 siRNA 組每孔加入800L轉(zhuǎn)染復(fù)合物8L siRNA溶于100L轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基8L siRNA轉(zhuǎn)染試劑溶于100L轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基 Fas干擾實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 空37 、5% CO2孵育57h 去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換含10%小牛血清的正常培養(yǎng)基 37 、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1824h 轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行UVB照射30min 干擾效率

37、的檢測 RT-PCR干擾后Fas mRNA的表達(dá)檢測水平 Western blot檢測干擾后Fas蛋白的表達(dá)水平37 、5% CO2孵育57h 去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，37 常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹細(xì)胞活性（Cell Viability）檢測 檢測樣本中活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。最為常用的實(shí)驗(yàn)手段之一，在抑瘤，毒理，細(xì)胞保護(hù)等實(shí)驗(yàn)中都必不可少。MTTMTSCCK8Calcein-AM染色PI染色Trypan Blue染色細(xì)胞活性（Cell Viability）檢測 檢測樣本中活MTT法MTT，化學(xué)名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑鹽。活細(xì)胞，特別是增殖的細(xì)胞中能量

38、代謝旺盛，其中線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原為藍(lán)色的結(jié)晶formazan沉積在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，形成的結(jié)晶與增殖的細(xì)胞數(shù)成正比。二甲基亞砜（DMSO）可溶解formazan，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)典方法，缺點(diǎn)是較麻煩，誤差相對(duì)也較大。MTT法MTT，化學(xué)名3-（4，5-二甲基 MTT的改進(jìn)型：MTSMTS是在MTT的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)的一種四唑鹽，Promega公司將其與電子偶聯(lián)劑PES穩(wěn)定混合，形成單一溶液形式，易用而穩(wěn)定的細(xì)胞活力檢測試劑。 MTT的改進(jìn)型：MTSMTS是在MTT的基礎(chǔ)上加以CCK-8法CCK-8（

39、Cell Counting Kit-8），是碧云天公司推出的另一種MTT改進(jìn)型，基于MTT的另一個(gè)衍生物WST-8，與MTS法相似，只需將單一溶液加入即可測定活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量。CCK-8法CCK-8（Cell Counting Kit-Calcein-AM染色 Calcein-AM是一種熒光染料Calcein的前體，能穿透細(xì)胞膜，在活細(xì)胞中被轉(zhuǎn)化為Calcein，熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)量成正比?？捎糜跓晒怙@微鏡下標(biāo)記細(xì)胞。Calcein-AM染色 Calcein-AM是一種熒光染料PI染色法Propidium Iodide (PI)為DNA的嵌入劑（Intercalator），同時(shí)為一熒光染料。PI

40、的特性是無法穿過活細(xì)胞膜，因此其能被用來確定死細(xì)胞。前面流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)介紹過通過PI染色確定細(xì)胞是否死亡的方法。PI染色法Propidium Iodide (PI)為DNATrypan Blue染色法Trypan Blue (臺(tái)盼藍(lán)）也是一種只能染色死細(xì)胞的染料，與PI的不同之處是其染色肉眼可見，可給出直觀 的細(xì)胞生存與否的表述。Trypan Blue染色法Trypan Blue (臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞凋亡檢測Western blot流式細(xì)胞術(shù)TUNELHoechst 33258染色DNA ladder細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路Western blot檢測細(xì)胞凋亡需要同時(shí)檢測兩個(gè)目

41、標(biāo)：Caspase-3及PARP（Poly ADP-Ribose Polymerase）Caspase-3在正常細(xì)胞中以前體酶（Procaspase-3）的形式存在，約為32KD。凋亡發(fā)生時(shí)，前體酶被剪切為具有活性的Caspase-3，兩個(gè) 亞基分別約為17KD和 12KD（分子量隨不同 物種有少量波動(dòng)）Western blot檢測細(xì)胞凋亡需要同時(shí)檢測兩個(gè)目標(biāo)：CPARP是一個(gè)DNA修復(fù)酶，是激活的caspase-3的底物。正常全長的PARP為116KD, 被caspase-3剪切后則被分為89KD和24KD兩段。PARP是一個(gè)DNA修復(fù)酶，是激活的caspase-3的底物流式細(xì)胞術(shù)法檢測凋亡

42、在流式細(xì)胞術(shù)一節(jié)已經(jīng)講到，以Annexin V/PI雙染色法 結(jié)合流式細(xì)胞儀即可分辨正?；罴?xì)胞，早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡/壞死細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)法檢測凋亡在流式細(xì)胞術(shù)一節(jié)已經(jīng)講到，以AnnexiTUNELTerminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標(biāo)記?；赥erminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)的應(yīng)用。凋亡發(fā)生時(shí)，DNA被切斷，暴露的殘端可以被TdT識(shí)別，進(jìn)而將dNTP聯(lián)接到DNA殘端上。通過標(biāo)記dNTP，凋亡的細(xì)胞可以被在位標(biāo)記出

43、來。TUNELTerminal deoxynucleotidylTdT只識(shí)別凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA斷裂，而不會(huì)識(shí)別其他原因如輻射導(dǎo)致的DNA斷裂，故可特異性顯示凋亡細(xì)胞。常用Biotin-Streptavidin-HRP系統(tǒng)（與免疫組化相仿）顯色。注意需要阻斷內(nèi)源性的過氧化酶，biotin高表達(dá)的組織還需要阻斷內(nèi)源性的biotin。TdT只識(shí)別凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA斷裂，而不會(huì)識(shí)別其他原因如輻射Kumaret al.Cardiovascular Diabetology20076:34Kumaret al.Cardiovascular DiHoechst 33258熒光染色1 原理： 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮。Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染或呈碎塊致密濃染，顏色有些發(fā)白。2 步驟： 細(xì)胞種入放潔凈蓋玻片的六孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合至8090% 。