免疫實驗免疫學和免疫檢測技術試驗課件

1、實驗一、外周血單個核細胞的分離 單個核細胞：一、基本原理?常用哪些方法分離細胞，免疫學可采用哪些方法本實驗是利用不同的細胞之間密度不同的性質，通過速度沉降法來分離制備外周血中單個核細胞。二、操作：1、稀釋血：1ml血+1ml緩沖液（含510IU/ml肝素的PBS，無血清 ）（用滴管）實驗一、外周血單個核細胞的分離 單個核細胞：離心單個核細胞（斜面?。?、加于淋巴細胞分離液上層，離心：500g 20min（小于1000rpm)！沿管壁滴加 !淋巴細胞分離液取法3、吸出細胞，懸于營養(yǎng)緩沖液（12倍量含5IU/ml肝素、2滅活小牛血清的PBS液 ），離心：200g 10min，除去血小板。4、洗滌：

2、同樣營養(yǎng)液洗滌2次，洗去淋巴細胞分離液，離心： 500g 10min離心單個核細胞2、加于淋巴細胞分離液上層，離心：500g 25、檢查細胞存活率：（1）將1滴細胞懸液和1滴臺盼蘭混勻，靜置5-10分鐘。（2）上述混合液滴入細胞計數(shù)板，在顯微鏡下觀察細胞，計數(shù)活細胞數(shù)和死細胞數(shù)。三、注意事項：1。血液制品2。注意將稀釋后的血輕輕地沿管壁鋪在細胞分離液上，避免破壞其界面。 3。在收集單個核細胞時，預先將毛細滴管中的氣體排空，再將毛細滴管輕輕插入單個核細胞層，沿管壁輕輕旋轉吸取細胞，千萬不能吹打，以免影響細胞的收集效果。 5、檢查細胞存活率：4。抽血后在2小時內使用。*關于實驗報告：全部內容都要填

3、寫，關于日期。報告你的細胞收率 ，存活率。4。抽血后在2小時內使用。實驗二、酶聯(lián)免疫檢測技術（ELISA） 一、實驗原理： 酶聯(lián)免疫測定法實質上是將專一性很強的、十分靈敏的、能夠定量進行的抗原抗體結合反應與高催化效能的酶促反應偶聯(lián)在一起的一種分析方法。它除了用來測定抗體外，原則上適用于一切可以誘導動物產(chǎn)生相應抗體的抗原和半抗原物質的測定。其特點是專一性強，靈敏度高，操作簡便，無須特殊設備，特別適用于測定成分復雜的體液及組織中的微量生命物質，而且?guī)缀醪皇芷渌镔|的干擾。 實驗二、酶聯(lián)免疫檢測技術（ELISA） 一、實驗原理：一、原理（續(xù)）測定方法：酶聯(lián)免疫測定法應用非常廣泛。具體操作方法隨測定對

4、象及測定要求的不同而有很大差異。液相固相吸附測定法酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)簡稱酶標法。酶標法的基本測定方法有三類：即間接法(抗原-抗體-酶標抗抗體)雙抗體(夾心)法(抗體-抗原-酶標抗體)抗原競爭法。 一、原理（續(xù)）測定方法：本次實驗檢測血清IgG，應用的是雙抗體夾心法。 本次實驗檢測血清IgG，應用的是雙抗體夾心法。 二、實驗方法：1、包被抗體： 包被抗體濃度為：用包被液稀釋（包被聚苯乙烯要在偏堿性條件下進行，所以該包被液用pH9.6的碳酸鹽緩沖溶液）抗體至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔18孔的安排：套上包裝袋，4過夜，棄上清，以洗滌液(200ul)洗滌三次，甩干。

5、關于對照、平行！標準：S1-S5ELISA熒光免疫空白對照陰性對照陽性對照二、實驗方法：1、包被抗體： 包被抗體濃度為：用2、加抗原：！稀釋抗原用加BSA的保溫液稀釋！如上頁圖所示，加抗原，空白和熒光陰性對照加含BSA的保溫液標準抗原1-5的濃度分別為：50，100，200，300，500ng/ml(都從500ng/ml加，分別加10，20，40，60，100ul至各孔，再分別補加90，80，60，40，0ul保溫液即可)熒光各孔：陰性對照：Ab-Ag-FITC-Ab，陽性對照用200ng/ml，500ng/ml37，1hr，洗滌液洗滌三次2、加抗原：3、加酶標抗體、熒光標記抗體：所有ELIS

6、A各孔均加100ul（已稀釋好,稀釋倍數(shù)：2000各熒光孔不加酶標抗體，加熒光標記抗體100ul,(已稀釋好，稀釋倍數(shù)：50)！注意！熒光怕見光，注意避光，加液、保溫時都要避光37，45min，取出后保溫平衡10分鐘,洗滌液洗滌三次，熒光各孔可不洗3、加酶標抗體、熒光標記抗體：4、觀察熒光、ELISA各孔加底物：一組同學觀察熒光、一組同學加酶底物。酶底物溶液要現(xiàn)配，由老師或同學代表配制一份即可。各孔加100ul，37保溫15min。終止酶反應：各孔加4mlol/L硫酸50ul終止。5、酶標儀上測各孔492nm的光吸收。打印直線附在實驗報告上！4、觀察熒光、ELISA各孔加底物：實驗三、納米金免

7、疫檢測技術一、實驗原理：以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片上滴加純化的抗體，為膜所吸附。當?shù)渭釉谀ど系臉吮疽后w滲濾過膜時，標本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關蛋白等濾出膜片。其后加入的膠體金標記的抗體也在滲濾中與已結合在膜上的抗原相結合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應即在膜中央顯示紅色斑點。實驗三、納米金免疫檢測技術一、實驗原理：一、實驗原理本實驗不用夾心法，直接加抗原，再加金標抗體。一、實驗原理本實驗不用夾心法，直接加抗原，再加金標抗體。二、實驗操作：點加抗原：（人IgG）：在硝酸纖維素膜下墊吸水材料（衛(wèi)生紙），用微量移液器取3ul抗原溶液點于硝酸纖維素膜上，注意點樣時要逐次點于膜上，待

8、前次所點液體滲入后再繼續(xù)點，不要使斑點太大，同時注意不要太用力將膜點破，致使斑點太大。 烤干或吹干，保證抗原能夠吸附到膜上，給蛋白質一定吸附時間，否則下步的洗滌有可能將蛋白洗掉?。?。洗滌、封閉：點加10ul 含1%BSA的PBS洗滌（BSA作用是封閉），待干（注意別讓BSA覆蓋前一步抗原），另點1個點（作為陰性對照）。二、實驗操作：點加抗原：（人IgG）：在硝酸纖維素膜下墊吸點加金標抗體：金標記抗體稀釋至1：25-1：50，點加10ul，即可在陽性對照點處觀察到紅色斑點，而陰性對照則無。點加金標抗體：金標記抗體稀釋至1：25-1：50，點加10三、注意事項：1斑點大小控制。2勿用力戳破膜。3給第一抗體和封閉蛋白（BSA）一定吸附時間。4把你的實驗結果粘貼于實驗報告上，報告測定結果，指出陽性點和陰性點。三、注意事項：1斑點大小控制。實驗四、免疫熒光檢測技術一、基本原理：熒光雙抗夾心法定位與定量抗原二、操作： 1、抗體包被：（同實驗二）2、加樣本：同實驗二，但在本實驗中不做標準曲線，樣品加兩個稀釋濃度，如1：20，1：40，另外加一個陽性對照（用人IgG標準），每孔做一個復孔，加空白對照共計8孔。3、加熒光抗體：從這里開始與實驗二不同之處是一定要記得避光操作。按照要求加入一定稀釋度的熒光標記抗人IgG抗體（一