主管檢驗師臨床醫(yī)學檢驗免疫學和免疫檢驗 第七章 放射免疫分析

1、 PAGE PAGE 5 / 4第七章 放射免疫分析第一節(jié) 放射免疫技術(shù)放射免疫分析是利用放射性核素可探測的靈敏性、精確性和抗原抗體反應特異性相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。早期的放射免疫技術(shù)是基于競爭性結(jié)合反應原理的放射免疫分析（RIA） ，稍后又發(fā)展了非競爭性結(jié)合的免疫放射分析（IRMA）。一、基本類型及原理1、放射免疫分析（RIA）中抗原量的一種分析法。2、免疫放射分析（IRMA）體的非競爭放射免疫分析法。二、常用的放射性核素放射免疫技術(shù)常用的放射性核素有125、131、3H、14C 等。使用最廣泛的是 125。三、標志物制備及鑒定采用放射性碘（如 125）酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。

2、1、直接標記法125物分子中酪氨酸殘基或組胺殘基上。（一）標記及類型其特點是標記方法操作簡便，容易將較多的125志物。常用的方法為：氯胺T（ch-T）法；乳過氧化物酶標記法。2、間接標記法也稱連接標記法（Bolton-Hunter 法） ，是最常用的間接碘標記方法。該法主要用于甾體類化合物、環(huán)核苷酸、前列腺素等缺乏碘標記基團的小分子化合物的標記。（二）標志物的純化純化標志物的方法有利用分子篩機制的凝膠過濾法、利用游離125與標志物分子極性差異進行吸附解 酰胺凝膠電泳法以及高效液相色譜法。（三）標志物的鑒定1、放射化學純度是指單位標志物中結(jié)合于被標志物上的放射性占總放射性的百分率，一般要求大于9

3、5%。2、免疫活性指制備的標志物與抗體結(jié)合的能力。3、比放射性Cig、mCimgCimmol比放射性計算方法有計算法和自身置換法。四、抗血清鑒定抗血清的質(zhì)量直接影響分析方法的特異性和靈敏度。用于鑒定抗血清質(zhì)量的參數(shù)主要有以下幾項：1、親和性是指抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應的抗原決定簇之間的結(jié)合強度，常用親和常數(shù)Ka 表示。2、特異性是指一種抗體識別相應抗原決定簇的能力。3、效價是反映抗血清中有效抗體含量的相對參數(shù)，即抗血清稀釋至能與抗原發(fā)生有效反應的最大稀釋度。五、方法學評價為增強結(jié)果的可比性， 需對RIA 方法學進行評價。除常規(guī)的靈敏度、精密度、準確性、特異性和穩(wěn)定性等指標外，還應注意以

4、下指標：1、可靠性斷方法的可靠性。平行性好者可靠。2、劑量-反應曲線3、高劑量鉤狀效應高劑量鉤狀效應（H00K 效應）是指當標本中被測物濃度超過線性范圍上限時，所得結(jié)果反而降低或呈陰性的現(xiàn)象。第二節(jié) 放射免疫分析放射免疫分析（RlA） 是以放射性核素作示蹤劑的標記免疫分析方法，它具有高度靈敏性、特異性和精確性等特點，特別適用于激素、多肽等含量微少物質(zhì)的超微量分析。一、基本原理經(jīng)典RIA 是采用標記抗原和非標記抗原競爭性結(jié)合有限量特異性抗體的反應。二、實驗方法及測定RIA 具體測定方法包括以下三個主要步驟：（一）抗原抗體反應根據(jù)RIA 原理，將未標記抗原（標準品和待測樣品）、標記抗原和特異性抗體

5、加入反應試管中，在一定條件（溫度、時間及介質(zhì)pH）下進行競爭抑制反應。（二）分離結(jié)合與游離標志物RIA 反應平衡后，標記抗原與試劑抗體形成免疫復合物（B）。由于其含量極少，不能自行沉淀，因此需加入適當?shù)某恋韯┎拍軐⑵鋸氐壮恋恚?然后經(jīng)離心使其與游離的標記抗原（F）分離。某些小分子抗原也可采用吸附法分離B 與F。目前RIA 常用的分離方法有以下幾種：1、第二抗體沉淀法其原理是用RIA 反應中的試劑抗體（一抗）如豚鼠的IgG 免疫另一種動物（如羊），IgG 血清（二抗）RIAIgGB 和 相物連接，制成固相二抗，分離BF2、聚乙二醇（PEG）沉淀法PEGPEG 被廣泛用于實驗作沉淀劑。其優(yōu)點是沉淀

6、完全、經(jīng)濟方便，但非特異性沉淀較多，且當溫度高于30時，沉淀物易復 溶。3、PR 試劑法先將二抗與PEG 按一定比例混合成懸液后進行試驗。是將第二抗體沉淀法和PEG 沉淀法沉淀原理相結(jié)合的方法。此法保留了兩者的優(yōu)點，節(jié)省了二者的用量，且分離迅速，簡便。4、活性炭吸附法活性炭可吸附小分子游離抗原或半抗原，而大分子蛋白（如抗體和免疫復合物）則留在溶液中?？乖?抗體反應后，加入活性炭顆粒，使游離的標記抗原的標記抗原抗體復合物供測定。該法主要用于測定小分子抗原或藥物的RIA。（三）放射性測量及數(shù)據(jù)處理分離、FRIA 實驗方法及目的，測定游離標記抗原 。繪制標準曲線（），樣品管以其測量或計算的反應參數(shù)，

7、 通過標準曲線即可查出相應的待檢抗原濃度，目前已普遍采用計算機進行數(shù)據(jù)處理、自動繪制標準曲線和打印樣 品抗原濃度。第三節(jié) 免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是在RIA 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的放射性核素標記免疫分析。與經(jīng)典RIA125I附劑對BFRIA，操作程序較RIA一、基本原理1、單位點IRMA反應液中剩余的未結(jié)合標記抗體并將其分離，測定上清液的放射量。2、雙位點IRMA二、IRMARIA1、標志物RIA 是以放射性核素標記抗原，抗原有不同種類,標記時需根據(jù)其理化和生物學特性，選用不同的放射性核素和方法。IRMA 則是標記抗體，為大分子蛋白，性質(zhì)較穩(wěn)定，不同抗體標記方法基本相同，標記抗體的比活

8、度高， 提高了測定的靈敏度。2、反應速率反應速率與反應物濃度成正比，IRMA 反應中，標記抗體為過量，且抗原抗體結(jié)合為非競爭性，故反應速率比RIA 快。3、反應原理RIA 為競爭抑制性結(jié)合，反應參數(shù)與待檢抗原量成反比。IRMA 為非競爭性結(jié)合，反應參數(shù)與待檢抗原濃度呈正相關(guān)。4、特異性IRMA 采用針對不同抗原決定簇的雙抗體結(jié)合抗原，反應受交叉反應物的干擾，較僅用單一抗體的RIA者小，測定特異性較高。、靈敏度和檢測范圍IRMA 反應中，抗原與抗體屬非競爭性，微量抗原能與抗體充分結(jié)合；RIA 中標記抗原和待檢抗原競爭,與有限量抗體的結(jié)合不充分，故IRMA 測定的靈敏度明顯高于RIA。 用于抗原含量較高標本測定時，結(jié)果也較RIA 好,IRMA準曲線工作范圍較RIA126、其他RIA 所用抗體為多克隆性，因此對其親和力及特異性要求較高，但用量很少；IRMA 為試劑過量的非競爭性結(jié)合反應對抗體親和力的要求不及RIA，但用量大。RIA 可以測定大分子和小分子抗原，但IRMA 則只能測定至少有兩個抗原決定簇的抗原。第四節(jié) 放射免疫分析技術(shù)的應用常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標志物和藥