醫(yī)療器械微生物檢驗講義培訓課件

1、醫(yī)療器械微生物檢驗講義醫(yī)療器械微生物檢驗講義2概述微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。 微生物限度檢查細菌、真菌菌落數(shù)控制菌醫(yī)療器械微生物檢驗講義2概述微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微3概述微生物：形體微小，結構簡單，通常要用光學顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物特點： 1、個體微小，一般0.1mm 2、構造簡單，有單細胞的，簡單多細胞 的，非細胞的 3、進化地位低分類：原核類：二菌，四體（細菌、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體） 真核類：真菌，原生動物，顯微藻類 非細胞類：病毒，亞病毒醫(yī)療器械微生物檢驗講義3概述微生物：形

2、體微小，結構簡單，通常要用光學顯微鏡和電子顯4醫(yī)療器械微生物檢驗講義4醫(yī)療器械微生物檢驗講義5概述醫(yī)療用品的分類按醫(yī)療用品與人體接觸的性質以及對人體使用安全性要求分三類： a) 類醫(yī)療用品：接觸人體完整皮膚的醫(yī)療用品 b) 類醫(yī)療用品：接觸人體未破損粘膜的醫(yī)療用品 c) 類醫(yī)療用品：進入人體無菌組織、器官和血液 以及接觸破損皮膚和粘膜的醫(yī)療 用品 醫(yī)療器械微生物檢驗講義5概述醫(yī)療用品的分類醫(yī)療器械微生物檢驗講義6常用檢測標準中華人民共和國藥典 2010年版二部附錄XI J “微生物限度檢查法”GB 15979-2002 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準附錄BISO11737-1:2006 Sterili

3、zation of medical devices Microbiological methodsPart1: Determination of a population of microorganisms on products醫(yī)療器械微生物檢驗講義6常用檢測標準醫(yī)療器械微生物檢驗講義7項目藥典2010GB15979-2002細菌定量：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2個平皿定量：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 5個平皿真菌定量：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 至少2個平皿 72h 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基定量：沙氏瓊脂培養(yǎng)基 5個平皿 7天定性：沙氏液體培養(yǎng)基 7天大腸埃希菌 膽鹽乳糖培養(yǎng)基 、MUG培養(yǎng)基 曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基

4、或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 /大腸菌群膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基 、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍瓊脂、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基沙門菌 營養(yǎng)肉湯 、四硫酸鈉亮綠培養(yǎng)基 、膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞藍瓊脂）培養(yǎng)基 、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 /銅綠假單胞菌膽鹽乳糖 、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基 、氧化酶試驗 、綠膿菌素試驗、 SCDLP培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基 、氧化酶試驗 、綠膿菌素試驗、硝酸鹽還原產氣試驗、明膠液化試驗42生長試驗金黃色葡萄球菌 亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基 、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培

5、養(yǎng)基 、血漿凝固酶試驗 SCDLP培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵試驗、血漿凝固酶試驗梭菌 庖肉培養(yǎng)基、含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基 、過氧化氫酶試驗 /溶血性鏈球菌/葡萄糖肉湯、血瓊脂培養(yǎng)基、鏈球菌試驗、桿菌肽敏感試驗 白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、念珠菌顯色培養(yǎng)基、1%聚山黎脂80-玉米瓊脂培養(yǎng)基、芽管試驗/醫(yī)療器械微生物檢驗講義7項目藥典2010GB15979-2002細菌定量：營養(yǎng)8實驗條件無菌操作技術實驗環(huán)境實驗器材醫(yī)療器械微生物檢驗講義8實驗條件無菌操作技術醫(yī)療器械微生物檢驗講義9無菌操作技術微生物學基礎微生物實踐基礎無菌操作意識醫(yī)療器械微生物檢驗講義9無

6、菌操作技術微生物學基礎醫(yī)療器械微生物檢驗講義10實驗環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域或隔離系統(tǒng)；定期按GB/T16292-16294：2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證；實驗中監(jiān)控：實驗時將制備好的營養(yǎng)瓊脂平板打開放于實驗臺上，至實驗結束收起，30 35培養(yǎng)48h，菌落平均數(shù)應小于1cfu/90mm。 醫(yī)療器械微生物檢驗講義10實驗環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流11實驗器具儀器 超凈工作臺、光學顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、薄膜過濾裝置、比濁儀等。用具 試管、注射器、三角瓶、刻度吸管

7、、移液器、精密PH試紙、濾膜、濾杯、剪刀、鑷子、無菌服、牛皮紙等。醫(yī)療器械微生物檢驗講義11實驗器具儀器醫(yī)療器械微生物檢驗講義12實驗準備實驗環(huán)境保證實驗試液培養(yǎng)基滅菌方法醫(yī)療器械微生物檢驗講義12實驗準備實驗環(huán)境保證醫(yī)療器械微生物檢驗講義13實驗環(huán)境保證環(huán)境清潔，表面消毒（ 75%(V/V)乙醇、新潔爾滅(1:1000)溶液或其他適宜消毒溶液）空氣過濾系統(tǒng)，紫外燈或臭氧空氣消毒儀醫(yī)療器械微生物檢驗講義13實驗環(huán)境保證環(huán)境清潔，表面消毒（ 75%(V/V)乙醇、14實驗試液稀釋劑 1.0.9%氯化鈉溶液 2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液 3.pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩

8、沖液：調解pH至近中性，其中蛋白胨對細菌細胞有保護作用有利于菌落數(shù)及控制菌測定。表面活性劑、中和劑或滅活劑鑒定用試劑 1.靛基質試液 2.1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液（氧化酶試液） 3.三氯甲烷 4.1mol/l鹽酸試液 醫(yī)療器械微生物檢驗講義14實驗試液稀釋劑醫(yī)療器械微生物檢驗講義15培養(yǎng)基標準菌株處理及增菌用培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基醫(yī)療器械微生物檢驗講義15培養(yǎng)基標準菌株處理及增菌用培養(yǎng)基醫(yī)療器械微生物檢驗講義16培養(yǎng)基培養(yǎng)基的酸堿度應符合細菌生長要求。應按各種培養(yǎng)基要求準確測定調節(jié)pH值。多數(shù)細菌生長的適宜pH值為7.27.6。酵母菌霉菌（6.06.5）。調節(jié)可用1N HCl或NaO

9、H。培養(yǎng)基的滅菌時間和溫度，應按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進行，以保證滅菌效果及不損失培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分。 制成的培養(yǎng)基應透明，以便觀察細菌生長性狀以及其他代謝活動所產生的變化。醫(yī)療器械微生物檢驗講義16培養(yǎng)基培養(yǎng)基的酸堿度應符合細菌生長要求。應按各種培養(yǎng)基要17滅菌方式濕熱：115 121 ，15min30min 物品切勿立即取出置冷處，以免急速冷卻，使滅菌物品內蒸氣冷凝造成負壓，以致染菌。干熱：160 170 ，2h 適于耐高溫的玻璃、陶瓷或金屬器皿的滅菌。 滅菌程序需要經過驗證。醫(yī)療器械微生物檢驗講義17滅菌方式濕熱：115 121 ，15min3018計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查細菌、霉菌及酵母菌計

10、數(shù)用培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。醫(yī)療器械微生物檢驗講義18計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用培養(yǎng)基應進行19計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查菌種大腸埃希菌 CMCC（B）44 102金黃色葡萄球菌 CMCC（B） 26 003枯草芽孢桿菌 CMCC（B） 63 501白色念珠菌 CMCC(F) 98 001黑曲霉 CMCC(F) 98 003驗證試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。醫(yī)療器械微生物檢驗講義19計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查菌種醫(yī)療器械微生

11、物檢驗講義20計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備 取細菌新鮮培養(yǎng)物（一般18h24h，白念24h48h ，黑曲霉 57天 ），用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)50cfu100cfu的菌懸液 （黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液）；菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2 8可以在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 8，在驗證過的貯存期內使用。醫(yī)療器械微生物檢驗講義20計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查菌液制備 醫(yī)療器械微生物檢驗講義21計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基接種 金黃色葡萄球菌2個平皿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 大腸埃希菌2個平皿 枯草芽孢桿菌2個平皿 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 白

12、色念珠菌2個平皿 黑典霉2個平皿酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：白色念珠菌2個平皿用相同的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基做對照醫(yī)療器械微生物檢驗講義21計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基接種 醫(yī)療器械微生物檢驗講義22計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查結果判定 若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。醫(yī)療器械微生物檢驗講義22計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查結果判定醫(yī)療器械微生物檢驗講義23樣品準備供試品進入無菌實驗室前應作表面消毒，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒。檢驗數(shù)量：應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少

13、于4片。一般應隨機抽取不少于檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3倍量供試品。醫(yī)療器械微生物檢驗講義23樣品準備供試品進入無菌實驗室前應作表面消毒，用適宜的消毒24樣品準備檢驗量：除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10 g或10ml；化學膜劑100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗應增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照試驗）。醫(yī)療器械微生物檢驗講義24樣品準備醫(yī)療器械微生物檢驗講義25供試液制備液體供試品、固體、半固體或黏稠液供試品 取10ml或10g用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1：10的供試液。油

14、劑可加入適量的無菌吐溫80使供試品分散均勻; 水溶性液體亦可用混合供試品原液作為供試液；非水溶性供試品 ：乳化或萃取;膜劑供試品 ：取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml浸泡，振搖，作為1：10的供試液;腸溶及結腸溶制劑供試品：取供試品10g ，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑)PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑）至100ml，置45水浴中，振搖，使溶解，作為1：10的供試液;氣霧劑、噴霧劑供試品 ，經處理后同第一項制備供試液;貼劑供試品具抑菌活性的供試品 ：培養(yǎng)基稀釋法 、離心沉淀法 、薄膜過濾法 、中和法; 醫(yī)療器械微生物檢驗講義25供

15、試液制備液體供試品、固體、半固體或黏稠液供試品 醫(yī)療器26細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 實驗方法傾注平皿法薄膜過濾法培養(yǎng)基細菌總數(shù)：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 霉菌及酵母菌計數(shù)：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基 醫(yī)療器械微生物檢驗講義26細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 實驗方法醫(yī)療器械微生物檢驗講義27細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)培養(yǎng)和計數(shù)除另有規(guī)定外，細菌培養(yǎng)3天，逐日點計菌落數(shù)霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日點計菌落數(shù)必要時可延長至7天進行菌落計數(shù)點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)醫(yī)療器械微生物檢驗講義27細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)培養(yǎng)和計數(shù)醫(yī)療器械微生物檢驗講義28細菌、霉菌及酵母

16、菌計數(shù)方法驗證（1）試驗組 平皿法：供試液1ml +1ml 試驗菌菌懸液，平行制備2個平皿，菌落計數(shù)；薄膜過濾法：供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入1ml試驗菌，過濾，菌落計數(shù)；（2）菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)；（3）供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)；（4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。稀釋劑+試驗菌菌懸液；醫(yī)療器械微生物檢驗講義28細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證醫(yī)療器械微生物檢驗講義29細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，

17、并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。結果判斷 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率應均不低于70%；若試驗組的菌數(shù)回收率均不低于70%，可照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌數(shù)回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和 法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。醫(yī)療器械微生物檢驗講義29細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試30細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)1.平皿法采用平皿法進行菌數(shù)測定時，應取適宜的連續(xù)23個稀釋級的供試液。取供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入

18、1520ml 溫度不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長。醫(yī)療器械微生物檢驗講義30細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)1.平皿法醫(yī)療器械微生物檢驗講義31細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)營養(yǎng)瓊脂-細菌 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基-霉菌醫(yī)療器械微生物檢驗講義31細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)營養(yǎng)瓊脂-細菌 玫32細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)1.平皿法菌數(shù)報告規(guī)則：細菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300、霉菌宜選取平

19、均菌落數(shù)小于100的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據；以最高平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)；如果各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅是最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。醫(yī)療器械微生物檢驗講義32細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)1.平皿法醫(yī)療器械微生物檢驗講義33細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)2. 薄膜過濾法取相當于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g或1ml 所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml ，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗

20、液沖洗濾膜，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。醫(yī)療器械微生物檢驗講義33細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)2. 薄膜過濾法醫(yī)療器械微生物檢驗34細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)2. 薄膜過濾法菌數(shù)報告規(guī)則：以相當于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌生長，以1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾 1g或1ml供試品），或1乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。 醫(yī)療器械微生物檢驗講義34細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)2. 薄膜過濾法醫(yī)療器械微生物檢驗

21、35細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細菌，則應分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)較高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結果。醫(yī)療器械微生物檢驗講義35細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長36醫(yī)療器械微生物檢驗講義36醫(yī)療器械微生物檢驗講義37控制菌檢查法驗證菌種（菌液制備同前）大腸埃希菌CMCC（B）44 102金黃色葡萄球菌CMCC（B） 26 003乙型副傷寒沙門菌CM

22、CC（B） 50 094銅綠假單胞菌 CMCC（B） 10 104生孢梭菌 CMCC(B) 64 941醫(yī)療器械微生物檢驗講義37控制菌檢查法驗證菌種（菌液制備同前）醫(yī)療器械微生物檢驗講38控制菌檢查法驗證（1）試驗組 取規(guī)定量供試液及10cfu100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。（2）陰性菌對照組 設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證

23、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。結果判斷 陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法 、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。 醫(yī)療器械微生物檢驗講義38控制菌檢查法驗證（1）試驗組 取規(guī)定量供試液及10c39大腸埃希菌檢驗 取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，必要時可延長至

24、48小時。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性，不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性；呈試劑本色，為靛基質陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質陰性。醫(yī)療器械微生物檢驗講義39大腸埃希菌檢驗 取供試液10ml（相當于供試品1g、1m40大腸埃希菌檢驗MUG 靛基質試驗醫(yī)療器械微生物檢驗講義40大腸埃希菌檢驗MUG 41大腸埃希菌檢驗如MUG陽性、靛基質陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰

25、性，靛基質陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質陰性，或MUG陰性、靛基質陽性，均應取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌 。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗，確認是否為大腸埃希菌。醫(yī)療器械微生物檢驗講義41大腸埃希菌檢驗如MUG陽性、靛基質陽性，判供試品檢出大腸42大腸埃希菌檢驗大腸埃希菌菌落形態(tài)特征 培養(yǎng)基菌 落 形 態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色、菌落

26、中心呈 深紫色或無明顯暗色中心、圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂 鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤醫(yī)療器械微生物檢驗講義42大腸埃希菌檢驗大腸埃希菌菌落形態(tài)特征 培養(yǎng)基菌 落 43大腸菌群檢驗取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或 0.1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或 0.01ml ）、1：1000的供試液1ml（含供試品0.001g或 0.001ml），另取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基加入稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng)1824小時。醫(yī)療

27、器械微生物檢驗講義43大腸菌群檢驗取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)醫(yī)療器械微生物檢驗講義培訓課件45大腸菌群檢驗大腸菌群落形態(tài)特征 培養(yǎng)基菌 落 形 態(tài)曙紅亞甲藍瓊脂 呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤 麥康凱瓊脂 鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤醫(yī)療器械微生物檢驗講義45大腸菌群檢驗大腸菌群落形態(tài)特征 培養(yǎng)基菌 落 形 46大腸菌群檢驗確證試驗 從上述分離平板上挑選45個疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時。若產酸產氣，判該乳糖發(fā)酵管檢 出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。根據大腸菌群的檢出管數(shù)，

28、按下表報告1g或1ml供試品 中的大腸菌群數(shù)。醫(yī)療器械微生物檢驗講義46大腸菌群檢驗確證試驗 從上述分離平板上挑選447可能的大腸菌群數(shù)表醫(yī)療器械微生物檢驗講義47可能的大腸菌群數(shù)表醫(yī)療器械微生物檢驗講義48沙門菌檢驗取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞藍瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時（必要時延長至4048小時）。若平板上無菌生長，或生

29、長的菌落不同于下表所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。醫(yī)療器械微生物檢驗講義48沙門菌檢驗取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適49沙門菌檢驗沙門菌菌落形態(tài)特征 醫(yī)療器械微生物檢驗講義49沙門菌檢驗沙門菌菌落形態(tài)特征 醫(yī)療器械微生物檢驗講義50沙門菌檢驗若平板上生長的菌落與上表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進行適宜的生化試驗和血清凝集試驗，確認是否為沙門菌。 醫(yī)療器械微生物檢驗講義

30、50沙門菌檢驗若平板上生長的菌落與上表所列的菌落形態(tài)特征相符51銅綠假單胞菌檢驗 取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板上的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時。取斜面培養(yǎng)物進行革蘭

31、染色、鏡檢及氧化酶試驗。醫(yī)療器械微生物檢驗講義51銅綠假單胞菌檢驗 取供試液10ml（相當于供試品1g、152銅綠假單胞菌檢驗氧化酶試驗 取潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配置的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。綠膿菌素試驗 取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時，加三氯甲烷35ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/l鹽酸試

32、液約1ml,振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應繼續(xù)進行適宜的生化試驗，確認是否為銅綠假單胞菌。醫(yī)療器械微生物檢驗講義52銅綠假單胞菌檢驗氧化酶試驗 取潔凈濾紙片置于平皿內，53金黃色葡萄球菌檢驗取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中

33、，培養(yǎng)1824小時，必要時可延至48小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)2472小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于下表所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落特征相符或疑似，應挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進行革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，作血漿凝固酶試驗。醫(yī)療器械微生物檢驗講義53金黃色葡萄球菌檢驗取供試液10ml（相當于供試品1g、154金黃色葡萄球菌檢驗金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌 落 形 態(tài)甘露醇氯化鈉瓊

34、脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑0.71mm 卵黃氯化鈉瓊脂 金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑12mm 醫(yī)療器械微生物檢驗講義54金黃色葡萄球菌檢驗金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌 55金黃色葡萄球菌檢驗血漿凝固酶試驗 取滅菌小試管3支，各加入血漿和 無菌水混合液（1：1）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養(yǎng)，3小時后開始觀察直至24小時。陰性對照管的血漿應流動自如，陽性 對照管血漿應凝固，若試驗管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時，應另制備血漿，重新試驗。醫(yī)療器械微生物檢驗講義55金黃色葡萄球菌檢驗血漿凝固酶試驗 取滅菌小試管3支，56金黃色葡萄球菌檢驗若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。醫(yī)療器械微生物檢驗講義56金黃色葡萄球菌檢驗若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固57梭菌檢驗取供試液10ml （相當于供試品1