功能基因組學以及其研究方法

1、關(guān)于功能基因組學及其研究方法第1頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四 基因組(genome)是德國遺傳學家H. Winkler在1920年將gene（基因）和chromosome(染色體)兩個詞縮合而創(chuàng)造的一個新詞，意思是指染色體上的全部基因。幾十年來，隨著分子生物學的發(fā)展，其含義擴展為在個體水平代表一個個體所有遺傳性狀的總和，在細胞水平代表一個細胞所有不同染色體（單倍體）的總和，在分子水平代表一個物種所有DNA分子的總和。 一、基因組學概念第2頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因組學（genomics） 研究生物基因組的結(jié)構(gòu)和功能的科學，即從整

2、體水平上來研究一個物種的基因組的結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控的一門科學。 1986年提出，至今20年，已經(jīng)發(fā)展成為遺傳學中最重要的分支學科。第3頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因組學研究的最終目標 獲得生物體全部基因組序列; 鑒定所有基因的功能; 明確基因之間的相互作用關(guān)系; 闡明基因組的進化規(guī)律.第4頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四第5頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因組學包括2-3個亞領(lǐng)域 亞領(lǐng)域 內(nèi)容結(jié)構(gòu)基因組學 整個基因組的遺傳制圖、物理 制圖、DNA測序； 功能基因組學 認識、分析整個基因組所包含 的基因、非基因序

3、列及其功能； 蛋白質(zhì)組學 研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活 動規(guī)律。第6頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四結(jié)構(gòu)基因組學結(jié)構(gòu)基因組學，顧名思義，就是研究生物基因組結(jié)構(gòu)的科學。它是基因組研究的第一階段的工作，建立功能基因組學的基礎(chǔ)。其主要目標是繪制生物的遺傳圖（genetic map）、物理圖（physical map）、轉(zhuǎn)錄圖（transcript map）和序列圖（sequence map）?；蚪M測序是結(jié)構(gòu)基因組學最基本的研究工作。結(jié)構(gòu)基因組學(structural genomics)是通過人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP) 的實施來完成

4、的。結(jié)構(gòu)基因組學第7頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四HGP的內(nèi)容就是制作高分辨率的人類遺傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測定。自1990年開始實施人類基因組計劃以來，在它的影響下，迄今已完成了400多個物種的基因組DNA序列的測定，其中包括流感嗜血桿菌、大腸桿菌、酵母、秀麗線蟲等多個病原微生物和模式生物以及人類基因組的測序。結(jié)構(gòu)基因組學第8頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四模式生物是指一類被深入研究旨在揭示特定生命現(xiàn)象普遍規(guī)律的生物物種。大多數(shù)生物學過程在長期的進化過程中是高度保守的，因此，許多生物學過程在大多數(shù)

5、或所有的模式生物中都是類似的，模式生物也因此在生物學研究中具有不可替代的重要作用。 第9頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四 人類基因 組計劃第10頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因定位基因組作圖測定核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因組學第11頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四The E.coli genome第12頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四A portion of the E.coli chromosome showing genes and operons. A dot indicates the p

6、romoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.第13頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四功能基因組學 概念：利用結(jié)構(gòu)基因組學提供的信息，以高通量，大規(guī)模實驗方法及統(tǒng)計與計算機分析為特征，全面系統(tǒng)

7、地分析全部基因的功能的學科。近年來應(yīng)用計算機生物信息技術(shù)，分析研究已測序完DNA序列的生物基因組后，發(fā)現(xiàn)了未知功能的許多基因，這促進了基因定位和基因表達調(diào)控的研究。但目前功能基因組學的研究，還只局限于RNA水平。今后隨著蛋白質(zhì)分析技術(shù)的發(fā)展，例如，高效和超高靈敏度的雙向凝膠電泳、色譜儀的出現(xiàn)，人們有可能在蛋白質(zhì)水平上，分析基因組中基因間的相互作用，進而進一步地豐富和發(fā)展功能基因組學。第14頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四主要具體內(nèi)容包括以下方面（一）鑒定DNA序列中的基因（二）同源搜索預(yù)測基因功能 （三）實驗性研究基因功能 （四）描述基因表達模式（五）蛋白質(zhì)相互作用的

8、模式第15頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四（一）鑒定DNA序列中的基因 計算機對基因組序列(DNA序列)進行分析，包括鑒定和描述推測的基因、非基因序列及其功能。 第16頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四根據(jù)序列分析搜尋基因 查找開放閱讀框（open reading frame, ORF） 開放閱讀框都有一個起始密碼子，ATG，還要有終止密碼子。 從ATG開始，然后向下游尋找終止密碼子。 起始密碼子和終止密碼子之間的堿基數(shù)目要能夠被3整除 每一條鏈都有3種可能的閱讀框，2條連共計有6種可能的閱讀框.第17頁，共51頁，2022年，5月20日，12

9、點22分，星期四（二）同源搜索設(shè)計基因功能同源基因在進化中來自共同的祖先，通過核苷酸序列或氨基酸序列的同源性比較推測基因組內(nèi)相似功能的基因。同源基因起源于同一個祖先，在不同的物種中結(jié)構(gòu)和功能相同或相似的基因。第18頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四同源查詢的依據(jù) 有親緣關(guān)系的物種，基因組可能存在某種程度的相似性： 存在某些完全相同的序列；ORF演繹的氨基酸序列相似；ORF的排列相似，如等長的外顯子；模擬的多肽鏈的高級結(jié)構(gòu)相似，等。第19頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四生物信息學(bioinformatics)是運用計算機技術(shù)和信息技術(shù)開發(fā)新的算

10、法和統(tǒng)計方法，對生物實驗數(shù)據(jù)進行分析，確定數(shù)據(jù)所含有的生物學意義，并開發(fā)新的數(shù)據(jù)分析工具以實現(xiàn)對各種信息的獲取和管理的學科。利用生物信息學能夠分析從微生物、動物、植物以及人類基因組序列測定產(chǎn)生的大量資料，闡明遺傳信息。 研究內(nèi)容兩大類：DNA 數(shù)據(jù)分析； 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析。第20頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四DNA序列分析基因結(jié)構(gòu)域分析，包括啟動子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列、內(nèi)含子、外顯子、重復(fù)序列、開放讀碼框架等。同源分析和檢索，包括DNA數(shù)據(jù)庫、EST數(shù)據(jù)庫、STS數(shù)據(jù)庫、Unigene數(shù)據(jù)庫、Swissprot數(shù)據(jù)庫等。第21頁，共51頁，2022年，5月20日，12點

11、22分，星期四蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)分析蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析： 結(jié)構(gòu)特點分析，包括等電點、信號肽、穿膜區(qū)、DNA結(jié)合序列等同源分析和檢索，包括Nr數(shù)據(jù)庫、Swissprot 數(shù)據(jù)庫等功能區(qū)分析，包括Prosite、Emotif、Identify分析等。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析： 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫檢索，如PDB數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測，如Homology等軟件分析。第22頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四（三）實驗性研究基因功能 基因克隆 基因敲除（knock-out） 轉(zhuǎn)座子插入突變 基因的超表達 反義RNA技術(shù) RNAi 第23頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，

12、星期四基因克隆的策略基因文庫傳統(tǒng)方法PCR 擴增 后基因組時代第24頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因敲除技術(shù)（gene knockout)通過基因工程的方法將一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又稱基因敲入,基因替換），然后從整體觀察生物體，從而推測相應(yīng)基因的功能。這種人為地把生物體某一種有功能的基因完全缺失的技術(shù)稱為基因敲除技術(shù)。第25頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因替換轉(zhuǎn)座子誘變整合突變自殺質(zhì)粒介導的缺失突變第26頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四（四）描述基因表達模式采用DNA微

13、點陣進行整體基因表達譜-轉(zhuǎn)錄組分析；采用蛋白質(zhì)或多肽微點陣、改進的雙向電泳結(jié)合飛行質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)表達譜-蛋白質(zhì)組分析。 第27頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四轉(zhuǎn)錄組(transcriptome): 一個細胞內(nèi)的一套mRNA轉(zhuǎn)錄物，包含了某一環(huán)境條件、某一生命階段、某一生理或病理(功能)狀態(tài)下，生命體的細胞或組織所表達的基因種類和水平。第28頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四轉(zhuǎn)錄組學的研究方法DNA芯片技術(shù)第29頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因表達譜類型:1，組織、細胞表達譜2，差異的組織、細胞表達譜3，誘導的細

14、胞表達譜表達譜專用技術(shù):1，SAGE分析2，生物芯片技術(shù)(基因芯片，細胞芯片，組織芯片)3，其它第30頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)用于定量地、平行地分析大量的轉(zhuǎn)錄本。若要知道一種組織，器官或細胞的基因表達譜，首先從組織細胞里分離出短的診斷性Tags ，歸類并克隆。測定數(shù)千個克隆的DNA序列就可以了解代表這種組織、器官或細胞的功能的基因表達譜。所以SAGE提供了一種廣泛應(yīng)用的工具，定量地分析比較各種正常組織細胞，各種發(fā)育狀態(tài)和各種病理狀態(tài)下的基因表達譜。/網(wǎng)站搜集了大量的SAGE供研

15、究者檢索。Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)第31頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四Sequencingthausands tagsLivercDNA Express sequence tagcloningDetermining a gene expression pattern characteristic oflivers functionmRNA第32頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因芯片技術(shù)信息時代的產(chǎn)物90年代興起的一項前沿生物技術(shù) 橫跨： 生命科學、 物理學、 計算機科學、微電子技術(shù)

16、 光電技術(shù)、 材料科學 等現(xiàn)代高科技高度集約化 高靈敏度 大通量平行分析第33頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四DNA微列陣(DNA microarrays)是利用DNA芯片技術(shù)，同時進行大量分子雜交，以分析比較不同組織或器官的基因表達水平，篩選突變基因，從核酸水平分析基因表達模式。是后基因組學研究中的重要方法之一。第34頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四基因芯片發(fā)展歷史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray第35頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四第36頁，

17、共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四 其基本原理是將一系列的核酸片段固定在芯片載體上作為固相靶片段（target）， 待測的核酸片段人工標記上不同的熒光、或同位素等作為探針（probe），一定條件下兩者雜交，根據(jù)雜交后不同的信號即可獲得靶片段的信息，進行計算機分析。第37頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四制備靶片段結(jié)果觀察，信息分析制備固相探針對照組（組織，細胞）實驗組（組織，細胞）提取mRNA提取mRNACy5標記Cy3標記雜交第38頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四掃描圖第39頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22

18、分，星期四蛋白質(zhì)組(proteom)：一個細胞內(nèi)的全套蛋白質(zhì)，反映了特殊階段、環(huán)境、狀態(tài)下細胞或組織在翻譯水平的蛋白質(zhì)的表達譜。基因是遺傳信息的攜帶者,而全部生物功能的執(zhí)行者卻是蛋白質(zhì), 僅僅從基因的角度來研究是遠遠不夠的。第40頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四蛋白質(zhì)組學(proteomics)研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律。旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式,內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)表達、存在方式、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用方式等。第41頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四蛋白質(zhì)組學比基因組學更為復(fù)雜：DNA線狀結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)的功能差異不大，但

19、多肽鏈需折疊成一定的三維空間結(jié)構(gòu)才形成有功能的蛋白質(zhì)；同一種蛋白質(zhì)經(jīng)不同的加工修飾可形成不同的功能，因此蛋白質(zhì)的多樣性遠復(fù)雜于基因本身。第42頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四蛋白質(zhì)組學的研究方法雙向電泳（two dimension electrophoresis,2-DE）： 蛋白質(zhì)具有等電點和分子量的特異性，將蛋白質(zhì)混合物在電荷（等電聚焦，IEF）和分子量（變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS）兩個水平上進行分離。第43頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四第44頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期四MolecularsIons 生物質(zhì)譜技術(shù) Mass Spectrometry： 通過測定樣品離子的質(zhì)荷比（m/z）來進行成分和結(jié)構(gòu)分析。第45頁，共51頁，2022年，5月20日，12點22分，星期