應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法培訓(xùn)課件

1、應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：李書寶.中國鼠疫監(jiān)測現(xiàn)狀及疫情態(tài)勢分析俞東征.我國鼠疫形勢與鼠疫控制策略 沈爾禮, 張葦, 高崇華,等. 關(guān)于美國、秘魯鼠疫防治工作的考察報告J. HoltRD,DobsonAP,BegonM,etal.Parasiteestablishmentinhost communitiesJ.EcologyLetters,2003,6 (9) :8372842. PowerAG,MitchellCE.PathogenspilloverindiseaseepidemicsJ.AmericanNatur

2、alist,2004,164Suppl:S79288.應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：李書寶.中國鼠疫監(jiān)測現(xiàn)狀及疫情態(tài)勢分析應(yīng)用鼠目的:建立一種應(yīng)用鼠疫耶爾森菌全基因組芯片研 究黃連對鼠疫耶爾森菌抑制作用分子機(jī)制的方法。方法:應(yīng)用液體稀釋法測定黃連對鼠疫耶爾森菌的最小抑菌濃度( MI C)；鼠疫耶爾森菌全基因組芯片包含 4005條鼠疫耶爾森菌基因?；蛐酒磉_(dá)譜實(shí)驗(yàn)中黃連作用鼠疫耶爾森菌的濃度為10MI C，作用時間為30min； 提取并 純化鼠疫耶爾森菌總RNA；逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA；Cy3、Cy5染料標(biāo)記后，與鼠疫耶爾森菌全基因組芯片雜交；通過芯片掃描儀獲得表

3、達(dá)譜分析結(jié)果。應(yīng)用 S AM軟件處理結(jié)果，應(yīng)用SAM軟件處理結(jié)果。應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法3目的:建立一種應(yīng)用鼠疫耶爾森菌全基因組芯片研 究黃連結(jié)論：應(yīng)用鼠疫耶爾森菌全基因組 DNA芯片可以進(jìn)行黃連抑制鼠疫耶爾森菌的分子作用機(jī)制研究 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法4結(jié)論：應(yīng)用鼠疫耶爾森菌全基因組 DNA芯片可以進(jìn)行黃連抑制鼠 立項(xiàng)依據(jù)： 鼠疫耶爾森菌(以下簡稱鼠疫菌)可以引起烈性傳染病一鼠疫鼠疫，菌對常規(guī)的抗生素敏感，鏈霉素、氯霉素及四環(huán)素是鼠疫菌治療的首選藥物。抗生素的有效使用很好地控制了鼠疫的發(fā)生、流行以及蔓延。鏈霉素耐藥株的出現(xiàn)使得鼠疫菌治療藥物研究變得

4、尤為迫切。不斷探索新的治療藥物是擺在每一位鼠疫防治工作者面前的光榮使命。前期的研究結(jié)果表明，在傳統(tǒng)中藥中黃連對鼠疫菌有較強(qiáng)的抑菌作用。為了繼續(xù)深入探討黃連抑制鼠疫菌的作用機(jī)制，探索黃連應(yīng)用于鼠疫預(yù)防與治療的可能性，通過應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片建立研究黃連抑制鼠疫菌分子機(jī)制的方法。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法5 立項(xiàng)依據(jù)： 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方哈爾濱1910年特大鼠疫應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法6哈爾濱1910年特大鼠疫應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法培訓(xùn)課件1、材料與方法 1 、1 實(shí)驗(yàn)材料鼠

5、疫菌201菌株為布氏田鼠疫源地菌株，該菌株對人體無感染性，對小鼠具有高度毒力；分離自錫林郭勒高原布氏田鼠鼠疫疫源地 ( 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供) 。鼠疫菌全基因組基因芯片；由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供；掃描儀；為Scan Array 4100(Axon Instruments，Inc ) 處理軟件；為GenePix Pro41(Axon Instruments，Inc。) 黃連提取物 ：購自西安中鑫生物技術(shù)有限公司。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法81、材料與方法 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法1 2 黃連作用鼠疫菌最小抑菌濃度(MIC)的測

6、定黃連作用于鼠疫菌 的 MI C測定采用液體稀釋法進(jìn)行。準(zhǔn)備系列含有1ml TMH液體培養(yǎng)基的試管，將黃連配制成相應(yīng)濃度后加入含有培養(yǎng)基的試管中，以2倍比稀釋法逐管稀釋黃連，最終各管黃連的濃度分別為 01、0 05、0025、00125、000625gml ,在每個試管中加入15X108CFUml的細(xì)菌10ul ,試驗(yàn)設(shè)空白及重復(fù)對照,28培養(yǎng) 24h后，分別轉(zhuǎn)種普通瓊脂平板培養(yǎng)基，觀察細(xì)菌在平板培養(yǎng)基的生長現(xiàn)象 ，無細(xì)菌生長的試管濃度為黃連作用鼠疫菌的 MIC。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法91 2 黃連作用鼠疫菌最小抑菌濃度(MIC)的測定黃連作1 3 鼠疫菌基因芯片表達(dá)譜

7、實(shí)驗(yàn) 1 3 1 實(shí)驗(yàn)分組 選擇黃連作用鼠疫菌組作為試驗(yàn)組，等量生理鹽水相同條件作為對照組，進(jìn)行基因芯片表達(dá)譜試驗(yàn)。黃連作用 鼠疫菌的作用濃度為10MIC。作用時間為 3 0min。實(shí)驗(yàn)分組應(yīng)用系列重復(fù)設(shè)置，包括2個生物重復(fù)，以及2個技術(shù)重復(fù)。對不同分組采用不同熒光素交換標(biāo)記。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法101 3 鼠疫菌基因芯片表達(dá)譜實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研132 鼠疫菌RNA提取應(yīng)用細(xì)菌RNA保護(hù)劑(QiagenInc)分別對實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)菌進(jìn)行保護(hù)，保證細(xì)菌mRNA停留在進(jìn)行保護(hù)的時刻。分別應(yīng)用MasterPureTM RNA提取試劑盒(EpicentreInc

8、)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組與對照組鼠疫菌的總RNA提取，提取RNA后通過分光光度計與凝膠電泳鑒定提取RNA的質(zhì)與量。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法11132 鼠疫菌RNA提取應(yīng)用細(xì)菌RNA保護(hù)劑(Qiage1 3 3 探針標(biāo)記 采用Find GDPs軟件針對芯片上所有基因(4005個)為靶標(biāo)設(shè)計全基因組特異引物(GDPs)，同時應(yīng)用N6隨機(jī)引物，將二者等量混合用 于總RNA的逆轉(zhuǎn)錄。將獲得的 cDNA 用QIAquick PCR Purification Kit(QiagenInc)試劑盒純化，氨基標(biāo)記cDNA的熒光素標(biāo)記，應(yīng)用Cy3與Cy5分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組與對照組的cDNA，標(biāo)記完成后應(yīng)用Q

9、IAquick PCR純化試劑盒(QiagenInc)進(jìn)行純化。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法121 3 3 探針標(biāo)記 采用Find GDPs軟件針對134 芯片雜交與掃描雜交探針分別置于95 變性5min，然后立即將探針加在芯片上，蓋玻片封片置于雜交爐內(nèi)42雜交16h。然后依次以2SSC+ O 2SDS溶液、 01SSC+02SDS溶液及01 SSC溶液各洗滌2min，電吹風(fēng)吹干。用Scan Array 4100掃描儀掃描芯片。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法13134 芯片雜交與掃描雜交探針分別置于95 應(yīng)用鼠疫13 5 結(jié)果分析 利用 GenePi x Pr

10、o4 1軟件對掃描的熒光信號進(jìn)行處理，首先確定樣點(diǎn)信號和背景噪音，計算各個樣點(diǎn)扣除背景后的熒光信號值。剔除雙通道熒光信號中值小于2倍背景值的數(shù)據(jù)，再采用整體歸一法對雙色熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。應(yīng)用SAM軟件對獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法1413 5 結(jié)果分析 利用 GenePi x Pro4 結(jié)果：21 黃連作用鼠疫菌MIC的檢測黃連作用于鼠疫菌的最小抑菌濃度MIC為0 025ml，對鼠疫森菌有較強(qiáng)的抑菌作用 。 22 芯片雜交 芯片雜交后，啟動激光共聚焦掃描儀Genepix4100A的掃描程序，分別用波長6 3 5nm和 5 3 2nm進(jìn)行雙通道掃描，讀取

11、熒光信號后將圖保存。數(shù)據(jù)通過SAM 軟件分析，共獲得黃連作用鼠疫 菌差異基因360個，其中上調(diào)333個，下調(diào)27個。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法15 結(jié)果：應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法15 討論由于中藥的特殊性，細(xì)菌很少對中藥產(chǎn)生耐藥。而且中藥還具有來源廣泛，費(fèi)用低廉等優(yōu)勢。因此，研究和開發(fā)抗菌中藥對解決耐藥菌株的產(chǎn)生與抗生素短缺問題具有重要的現(xiàn)實(shí)與社會意義。黃連是一味具有廣泛藥效作用的傳統(tǒng) 中藥，經(jīng)常在臨床上被用于降熱鎮(zhèn)痛、抗腸道細(xì)菌感染。黃連的抗菌譜廣，很多細(xì)菌對其敏感。應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法16 討論應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑

12、菌機(jī)制的方法16應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法17應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法17如 肺炎雙球菌、白喉?xiàng)U菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌；大腸桿菌、傷寒桿菌、 霍亂弧菌、淋球菌等革蘭陰性菌；以及白色念珠菌、紅色毛癬菌等真菌。黃連的分布地區(qū)較廣，栽培簡便，資源豐富。因此，對黃連進(jìn)行深入研究，擴(kuò)大其藥效作 用，將有很大的社會效益和廣泛的開發(fā)前景?；蛐酒夹g(shù)的發(fā)展為進(jìn)行黃連的分子藥理學(xué)分析提供了一個有力的平臺?；蛐酒前殡S著人類基 因組計劃發(fā)展起來的一 項(xiàng)高通量篩選技術(shù)，具有大規(guī)模、高通量和高平行等特點(diǎn)，利用基因芯片可以進(jìn)行疾病相關(guān)基因篩選、新基因功能研究、藥物 作用

13、機(jī)制研究及藥物靶點(diǎn)的篩選等。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法18如 肺炎雙球菌、白喉?xiàng)U菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌；大腸通過對研究獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可以對黃連抑制鼠疫菌的分子機(jī)制進(jìn)行闡述，從而有望闡明黃連抑菌的分子作用機(jī)理。 應(yīng)用鼠疫菌全基因組芯片研究黃連抑菌機(jī)制的方法19通過對研究獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可以對黃連抑制鼠疫菌的參考文獻(xiàn)吳整軍，中醫(yī)藥抗感染治療的探討J中華醫(yī)院感染學(xué) 雜志，2004，14(11)；12961297 Shaw KJ，Miller N，Liu X，eta1 Comparison of the chan gesin global gene expressi on of Escherichia coli induced by four bacter