幽門螺桿菌IgG抗體膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制

1、幽門螺桿菌IgG抗體膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制【摘要】目的創(chuàng)立一種快速檢測抗H.pylriIgG抗體的膠體金免疫層析試紙條，并優(yōu)化制備中各關(guān)鍵步調(diào)的實(shí)行條件。要領(lǐng)以檸檬酸三鈉復(fù)原法制備20n的膠體金溶液，葡萄球菌A卵白SPA，制備免疫膠體金復(fù)合物，組裝膠體金免疫層析快速診斷試紙條。效果用檸檬酸復(fù)原法制備的20n膠體金溶液呈亮赤色。膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA的最低穩(wěn)定濃度5g/l，最適穩(wěn)定量為6g/l。SPA標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的最適pH為6.0。以此試紙條檢測臨床血清標(biāo)本與入口ELISA試劑盒比力，組間陽性率比力差異無明顯性。結(jié)論膠體金免疫層析試紙條質(zhì)量穩(wěn)定性不單與抗原抗體的選擇、用量優(yōu)化、層析

2、質(zhì)料的選擇、膠體金的制備與標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟等因素嚴(yán)密相干，并且緩沖體系的優(yōu)化、幫助添加劑的選擇與優(yōu)化組合也非常緊張。【關(guān)鍵詞】幽門螺桿菌；膠體金；免疫層析檢測ResearhndevelpentfgldiunhratgraphitestkitfrseruH.pylriantibdyIgG【Keyrds】helibaterpylri;llidgld;gldiunhratgraphiassay在幽門螺桿菌Helibaterpylri，Hp熏染的診斷中，細(xì)菌造就、構(gòu)造病理學(xué)查抄、尿素酶試驗(yàn)、呼氣試驗(yàn)等要領(lǐng)或由于給患者造成的侵入性痛楚，或必要必然的條件和技能，或由于必要特別儀器，或由于用度昂貴等，其臨床推廣

3、及屢次重復(fù)追蹤復(fù)查受到限定。而血清學(xué)檢測因其非侵入性、快速、正確，可同時(shí)處置懲罰大量標(biāo)本，檢測差異范例的抗體，在臨床查驗(yàn)、底子研究中倍受青睞。20世紀(jì)80年代鼓起的膠體金免疫層析檢測gldiunhragraphyassay，GIA，操縱簡樸快捷、效果清楚易于斷定、無需龐大的實(shí)行技能和特別裝備，特別適于下層衛(wèi)生單元利用。本研究預(yù)接納H.pylri超聲全菌體抗原、葡萄球菌A卵白SPA抗原，實(shí)行研制一種按照雙抗原夾心法檢測原理檢測血清、唾液中抗H.pylri的IgG抗體的膠體金免疫層析檢測試劑，優(yōu)化膠體金免疫層析快速診斷試紙條研制各關(guān)鍵步調(diào)的實(shí)行條件，為進(jìn)一步研制和開拓奠基實(shí)行基矗1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1

4、質(zhì)料幽門螺桿菌菌種SS1為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與盛行病研究所保存；TSB肉湯Tryptisybrth為DIF公司產(chǎn)物；氯金酸HAul4.H2，上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)物；檸檬酸三鈉Na36H57.2H2，北京北化精致化學(xué)品產(chǎn)物；葡萄球菌A卵白SPA、牛血明凈卵白BSA，均為Siga公司產(chǎn)物；聚乙二醇PEG20000，F(xiàn)LUKA公司產(chǎn)物;以上試劑均為闡發(fā)純。厭氧造就罐AnaerPakRetangularJar為三菱化學(xué)公司產(chǎn)物。1.2要領(lǐng)制備膠體金的所用容器均應(yīng)重復(fù)洗濯，并硅化處置懲罰玻璃容器的內(nèi)外貌，末了用Q超純水沖洗晾干備用。取1%氯金酸溶液1l，加99l超純水成終濃度0.01%的氯金酸溶液，加熱

5、沸騰后，取1%檸檬酸三鈉1.6l一次性敏捷參加煮沸的氯金酸溶液中，繼承加熱至溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍(lán)玄色終極變?yōu)榱脸嗌?，顏色穩(wěn)定后繼承加熱5in，室溫冷卻，增補(bǔ)失水至原體積。目測法確定膠體金與待標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟卵白質(zhì)用量比例：用0.1l/L的碳酸鉀溶液調(diào)治膠體金溶液的pH至5.96.2，取11支干凈試管分裝膠體金溶液1l/管。將待標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟卵白質(zhì)SPA逐級(jí)稀釋后由210g另設(shè)比較管，各取等體積挨次參加一系列裝有1l膠體金的試管中，混勻；5in后，在上述各管內(nèi)別離參加10%氯化鈉溶液0.1l，混勻，室溫靜置。依表1挨次舉行。表1膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA的最低穩(wěn)定濃度實(shí)行略(1)室溫靜置2h以上不雅察效果

6、；(2)未加SPA的11號(hào)管為比較管；1號(hào)管既不加SPA也不加氯化鈉溶液同樣設(shè)為比較；(3)未加卵白及參加卵白量不敷以穩(wěn)定膠體金的試管，即出現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉征象，而參加卵白量到達(dá)或凌駕最低穩(wěn)定量的試管那么保持膠體金的赤色穩(wěn)定。以此使膠體金赤色穩(wěn)定而卵白質(zhì)含量最低的試管的卵白量，即為穩(wěn)定1l膠體金的必須卵白量，也即最低穩(wěn)定量。在此底子上再加20%即為穩(wěn)定1l膠體金所需卵白質(zhì)的現(xiàn)實(shí)最實(shí)用量。調(diào)治膠體金溶液pH依次為4、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，共同上述最低穩(wěn)定量實(shí)行，確定標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟卵白的最正確標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟pH。當(dāng)卵白質(zhì)的最適

7、穩(wěn)定量及標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的最正確pH值被確定以后便可舉行標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟。詳細(xì)步調(diào)如下：按最低穩(wěn)定量的120%盤算出所需待標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟卵白質(zhì)的總量。在磁力攪拌下，將卵白質(zhì)溶液參加膠體金溶液中pH已調(diào)至5.96.2，參加卵白質(zhì)時(shí)應(yīng)逐滴參加，1g的卵白質(zhì)約莫5in加完。別離取1l膠體金-SPA結(jié)合物液實(shí)行組和1l膠體金原液比較組于試管中加10%氯化鈉溶液0.1l，室溫靜置1h，不雅察效果：假設(shè)比較組試管溶液由赤色轉(zhuǎn)為藍(lán)色，乃至可以看到聚合物沉淀，而實(shí)行組溶液仍保持赤色，無沉淀，方可繼承下一步實(shí)行，不然需補(bǔ)加標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟用卵白SPA。末了參加終濃度為0.2%的聚乙二醇PEG20000，繼承攪拌30in。超速

8、離心法純化免疫膠體金復(fù)合物。先以3500rp離心20in4，棄沉淀將上清以13500rp離心35in4，棄上清，用保存液懸起較疏松的赤色沉積物；再以11000rp離心35in4，警覺移棄上清后，用保存液懸起較疏松的赤色沉積物至原體積1/10，即為開端純化的免疫膠體金復(fù)合物。定量測定：以保存液作比較測530n處D值，4避光保存。質(zhì)量斷定：用有Frvar膜的鎳網(wǎng)沾取金標(biāo)卵白溶液，氣氛中枯燥后醋酸鈾負(fù)染，在Tenai10透射電鏡下不雅察。純化的膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA作差異程度稀釋后，勻稱等量浸于同樣巨細(xì)的玻璃纖維素膜制成金標(biāo)墊。組裝試紙條，在其他條件穩(wěn)定的環(huán)境下，按照反響效果，確定到達(dá)試紙條敏感度

9、要求的最適膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA的稀釋度，或稱為事情濃度。保存液稀釋膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA復(fù)合物原液至事情濃度，按比例勻稱浸于玻璃纖維素膜，-20凍存，冷凍真空枯燥后，密封保存。幽門螺桿菌SS1接納TSB固體歪面造就基微需氧5%2、10%2、85%N237造就，72h后轉(zhuǎn)種TSB液體造就基，37振蕩造就60h后網(wǎng)絡(luò)菌體。H.pylri菌體用小體積生理鹽水懸浮，冰浴條件下超聲破壞有用時(shí)間5in150，超聲破壞置顯微鏡下不雅察呈勻稱細(xì)顆粒狀；4，12000r/in離心20in，網(wǎng)絡(luò)上清；細(xì)菌沉渣再重復(fù)超聲5in，重復(fù)離心歷程取上清；歸并2次上清，于0.01l/L的PB緩沖液pH7.2中透析24

10、h，中心換液3次，末了12000r/in離心20in，上清測卵白濃度后分裝，于-20保存。H.pylr抗原室溫融化后，12000r/in離心10in，取上清2g/l用0.01l/L的PB緩沖液pH7.2以250g/l隔斷，經(jīng)BI-DT型XYZ3000點(diǎn)樣儀dispenser線形包被于硝酸纖維素膜的不雅察效果的測試反響區(qū)，界說為檢測帶T，間隔檢測帶5遠(yuǎn)的質(zhì)控帶用dispenser線形包被正常兔IgG(2g/l)。37枯燥2h，4密封保存。選擇得當(dāng)?shù)年P(guān)閉試劑、外貌活性劑和(或)非離子型去污劑單獨(dú)或以得當(dāng)比例組合后勻稱浸于玻璃纖維素膜，室溫枯燥備用。按照成效差異可將試紙條分為四個(gè)部門：上段A區(qū)為手持

11、部位吸水濾紙：汲取檢測樣品中多余液體，中段B區(qū)為實(shí)行反響區(qū)硝酸纖維素膜：包羅判讀效果的檢測帶T和指示試紙條質(zhì)量的質(zhì)控帶，下段D區(qū)為樣品區(qū)玻璃纖維素膜：打仗待檢測樣品，在中下段之間區(qū)安排浸有膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA復(fù)合物的金標(biāo)墊；而整個(gè)試紙條貼附于雙面膠白色塑料背板見圖1。2實(shí)行效果2.1膠體金顆粒制備我們實(shí)行所用檸檬酸復(fù)原法制備的20n膠體金溶液呈亮赤色，用預(yù)先處置懲罰好的覆有Frvar膜的鎳網(wǎng)浸膠體金后在透射電鏡下不雅察，可見金顆粒巨細(xì)根本同等，漫衍勻稱，圓形圖2。丈量100個(gè)膠體金顆粒直徑，盤算均勻直徑約20n。2.2膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA的最低穩(wěn)定濃度、最適穩(wěn)定量及最適pH參加差異濃度

12、SPA的膠體金溶液在參加氯化鈉后出現(xiàn)差異顏色由藍(lán)色伴聚合物沉淀漸漸過渡到亮赤色，使膠體金溶液赤色穩(wěn)定而卵白質(zhì)含量最低的試管中參加5gSPA，因此確定本次制備的20n膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA的最低穩(wěn)定量是每毫升膠體金溶液5gSPA，最適穩(wěn)定量為每毫升膠體金溶液6gSPA。膠體金與卵白質(zhì)的結(jié)合樂成與否，取決于pH值，一樣平常只有在卵白質(zhì)等電點(diǎn)PI略偏堿的條件下二者才氣安穩(wěn)地結(jié)合，實(shí)行證明SPA標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的最適pH為6.0，切公正論猜測。2.3膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟SPA復(fù)合物的制備與純化將膠體金溶液pH值調(diào)至6.0，30l膠體金溶液在磁力攪拌下徐徐參加180lSPA溶液1g/l，參加PEG20000

13、增長膠體金溶液的穩(wěn)定性，超速離心純化后在Tenai10透射電鏡下不雅察，可見金顆粒外圍有顯著的低電子密度暈圈，表白金顆粒外貌吸附有卵白圖3。53份受檢血清中抗Hp血清抗體IgG膠體金法陽性21份，疑似7份，陰性25份；ELISA法陽性19份，疑似6份，陰性28份。組間陽性率比力差異無明顯性U查驗(yàn)，P0.05。表3兩種要領(lǐng)檢測臨床血清標(biāo)本H.pylr抗體IgG效果比力略3討論膠體金標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟技能是以膠體金作為示蹤標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反響的一種新型免疫標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟技能，如今已樂成用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、卵白染色、體外診斷制劑的制造等范疇。膠體金的制備并不難，但要制備高質(zhì)

14、量的膠體金卻并非易事，通過重復(fù)實(shí)行我們總結(jié)出如下履歷：(1)所用化學(xué)試劑應(yīng)為闡發(fā)純試劑，試劑質(zhì)量直接影響膠體金制備的樂成與否；(2)配制溶液用水應(yīng)為雙蒸水或Q超純水，并且必須留意到差異泉源的水其pH和離子強(qiáng)度有很大差異；(3)玻璃器皿的干凈黑白常關(guān)鍵的一步。假設(shè)玻璃器皿內(nèi)不干凈大概有塵土落入就會(huì)滋擾膠體金顆粒的天生，形成的顆粒巨細(xì)不一，顏色微紅、無色或渾濁不透明。及格膠體金溶液應(yīng)清澈透明，假設(shè)渾濁或液體外貌有漂泊物，提示此次制備膠體金有較多凝集顆粒。膠體金粒子巨細(xì)差異，顏色亦差異2：520n之間，呈葡萄酒赤色；2040n之間液體為深赤色；60n金溶液呈紫赤色，日光下細(xì)致不雅察比力膠體金的顏色，

15、可以大概預(yù)計(jì)制得金顆粒大校差異巨細(xì)的膠體金粒子具有差異的光散射作用，據(jù)此可用可見光光譜法評(píng)價(jià)膠體金的粒徑及漫衍3。斷定膠體金最有說服力的是在透射電鏡下不雅察，抱負(fù)的金顆粒是巨細(xì)根本相稱，勻稱同等，無橢圓形及多角形的金顆粒存在。拍片放大后丈量金顆粒直徑，切合制備要求。小顆粒膠體金根本是圓球形，3080n金顆粒那么多為偏愛圓形2。假設(shè)金顆粒巨細(xì)不等或有橢圓形、三角形金顆粒存在應(yīng)重新制備，造成這種環(huán)境的重要緣故原由一樣平常與在加復(fù)原劑時(shí)沒有敏捷一次性參加以及攪拌不勻稱有關(guān)；別的制備量的幾多、容器的大孝加熱的時(shí)間等也影響膠體金顆粒的大校制備好的膠體金可因電解質(zhì)、溫度、金溶液的濃度變革而有不穩(wěn)定和聚沉。

16、因此，制備后最幸虧20天以內(nèi)舉行標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟，室溫或4保存，制止低溫凍存。實(shí)行中我們選擇添加牛血明凈卵白作為穩(wěn)定劑以維持膠體金的穩(wěn)定性，使之便于恒久保存，并防范或淘汰免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反響。牛血明凈卵白、PEG20000是最為常用的高分子穩(wěn)定劑4。膠體金顆粒與卵白質(zhì)的結(jié)合一樣平常通過靜電感到、卵白質(zhì)疏水作用吸附于金顆粒外貌，或通過卵白質(zhì)中半胱氨酸的硫殘基與金顆粒的電子層產(chǎn)生配位結(jié)合5。無論其作用機(jī)制為何，環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的重要因素，一樣平常只有在卵白質(zhì)等電點(diǎn)略偏堿的條件下二者才氣安穩(wěn)地結(jié)合，因此，標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟之前須用0.1l/L碳酸鉀溶液或0.1N鹽酸將膠體金溶液的pH值調(diào)

17、至待標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟卵白質(zhì)等電點(diǎn)略偏堿。由于膠體金會(huì)壅閉pH計(jì)電極，不成直接將電極插入膠體金溶液中，用細(xì)密的pH試紙測定其pH即可。標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟好的免疫膠體金純化處置懲罰的目的是撤除此中未標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的卵白質(zhì)、未充實(shí)標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的膠體金以及在標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟歷程中大概形成的種種聚合物。按照膠體金顆粒巨細(xì)差異和所標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟卵白質(zhì)的特性差異，選擇并調(diào)解離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間可以到達(dá)一樣平常的純化目的。如有必要可將上述開端純化免疫膠體金用10%30%蔗糖或甘油溶液做密度梯度離心或用凝膠過濾法進(jìn)一步純化。膠體金免疫層析試紙條的研制不但在抗原抗體的選擇、用量優(yōu)化、層析質(zhì)料的選擇、膠體金的制備與標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟等方面至關(guān)緊張，并且緩沖體系的優(yōu)化尤其是種種幫助添加劑的選擇，優(yōu)化組合也必不成少。為確保試劑盒的穩(wěn)定性，試紙條的組裝須在干凈枯燥的環(huán)境下舉行，氣氛濕度20%為宜。本試驗(yàn)制備的檢測H.pylriIgG抗體的膠體金免疫層析試紙條經(jīng)臨床血清標(biāo)本檢測，開端效果與國產(chǎn)ELISA試劑盒比力差異無明顯性，說明