細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)課程課件

1、細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞免疫Cellmediated immunity is an immune response that does not involve antibodies but rather involves the activation of phagocytes, natural killer cells (NK), antigenspecific cytotoxic Tlymphocytes, and the release of various cytokines in response to an antigen. 細(xì)胞免疫（cellular immunity

2、） T細(xì)胞受到抗原刺激后，增殖、分化、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞(也叫效應(yīng)T細(xì)胞)，當(dāng)相同抗原再次進(jìn)入機(jī)體的細(xì)胞中時(shí)，致敏T細(xì)胞（效應(yīng)T細(xì)胞）對(duì)抗原的直接殺傷作用及致敏T細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子的協(xié)同殺傷作用，統(tǒng)稱為細(xì)胞免疫。細(xì)胞免疫Cellmediated immunity is a細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)課程課件檢測(cè)對(duì)象免疫細(xì)胞數(shù)量（E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)）T細(xì)胞亞群 （間接免疫熒光法，流式細(xì)胞術(shù), 免疫磁珠）細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)（ELISA，定量PCR, Elispot）免疫細(xì)胞活性 (淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn))檢測(cè)對(duì)象免疫細(xì)胞數(shù)量（E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)）應(yīng)用范圍1、測(cè)定患病個(gè)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)與水平

3、，以分析其發(fā)病機(jī)制；2、測(cè)定動(dòng)物疫苗免疫或抗原注射后機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)3、篩選免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑藥物，或研究化學(xué)藥物、營(yíng)養(yǎng)成分以及物理療法對(duì)機(jī)體免疫功能的影響4、在研制細(xì)胞因子制劑過程中，測(cè)定其活性及效價(jià)應(yīng)用范圍1、測(cè)定患病個(gè)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)與水平，以分析其發(fā)病機(jī)T細(xì)胞表面受體一、T細(xì)胞抗原受體二、細(xì)胞因子受體 三、綿羊紅細(xì)胞受體四、有絲分裂原受體T細(xì)胞表面受體一、T細(xì)胞抗原受體T細(xì)胞亞群輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+）、抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD8+）、CD4+T細(xì)胞純真亞群（CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+）和記憶亞群（CD4+CD45RA/

4、CD4+CD45RO+）、功能亞群（CD28+）、激活亞群（CD38+、HLADR+）、凋亡亞群（CD95+） T細(xì)胞亞群輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+）、抑制/細(xì)1. E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn) erythocyte rosette test實(shí)驗(yàn)原理人和動(dòng)物外周血中T細(xì)胞表面有紅細(xì)胞受體（即CD2分子），在體外能直接和異種或同種動(dòng)物紅細(xì)胞（SRBC）結(jié)合形成玫瑰花樣細(xì)胞團(tuán)，以此來區(qū)分T、B。 TTBSRBCCD2檢測(cè)技術(shù)1. E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn) erythocyte rosett左:（甲紫染色，800）：可見2個(gè)被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫瑰環(huán)的T淋巴細(xì)胞；右:（吖啶橙染色）：圖中可見3個(gè)染成橙

5、黃色熒光的T淋巴細(xì)胞被綿羊紅細(xì)胞所包圍。左:（甲紫染色，800）：可見2個(gè)被綿羊紅細(xì)胞包圍而形成玫B細(xì)胞沒有紅細(xì)胞受體，但有免疫球蛋白Fc受體和補(bǔ)體C3受體，故可用抗紅細(xì)胞抗體（A）或者補(bǔ)體（C）搭橋，形成EA玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)和EAC玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)。B細(xì)胞沒有紅細(xì)胞受體，但有免疫球蛋白Fc受體和補(bǔ)體C3受體，在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。免疫細(xì)胞數(shù)量（E玫瑰花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)）免疫細(xì)胞活性 (淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn))免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。將指定數(shù)目的能產(chǎn)

6、生 IFN- 的T細(xì)胞與一百萬個(gè)抗原呈現(xiàn)細(xì)胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和 ELISA 法（下圖）分別測(cè)量產(chǎn)生 IFN- 的細(xì)胞的數(shù)目。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù) T細(xì)胞亞群細(xì)胞合成的DNA越多，則所摻入的3HTdR就越多，因此，檢測(cè)所摻入的3HTdR就可反映細(xì)胞增殖的程度。一種細(xì)胞分選或分析技術(shù)。B細(xì)胞沒有紅細(xì)胞受體，但有免疫球蛋白Fc受體和補(bǔ)體C3受體，故可用抗紅細(xì)胞抗體（A）或者補(bǔ)體（C）搭橋，形成EA玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)和EAC玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)。定義流式細(xì)胞術(shù)(F

7、lowCytometry,FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。092，淋巴細(xì)胞為1.加分裂原共同培養(yǎng)后，觀察形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) ELISPOTBCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果.MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。2.流式細(xì)胞術(shù)定義流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化

8、學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。它不僅可測(cè)量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等,可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析,在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)分析大量細(xì)胞,并收集、儲(chǔ)存和處理數(shù)據(jù),進(jìn)行多參數(shù)定量分析;能夠分類收集(分選)某一亞群細(xì)胞,分選純度95%。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。 一種細(xì)胞分選或分析技術(shù)。即以熒光素標(biāo)記抗體結(jié)合相應(yīng)細(xì)胞，用激光束激發(fā)單行流動(dòng)的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞所攜帶熒光(強(qiáng)度或類別)進(jìn)行分選或分析。 檢測(cè)技術(shù)在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)課程課件將待

9、測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，不含細(xì)胞的磷 酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測(cè)區(qū)域。將待測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)流式細(xì)胞術(shù) T細(xì)胞亞群具有CD3抗原的T細(xì)胞外周血成熟的T細(xì)胞具有CD4抗原的T細(xì)胞TH（機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動(dòng)細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞免疫應(yīng)答，活化的TH細(xì)胞可釋放IL2及IFNr）具有CD8抗原的T細(xì)胞Tc（在TH輔助下特異性殺傷或溶解靶細(xì)胞）流式細(xì)胞術(shù) T細(xì)胞亞群具有CD3抗原的T細(xì)胞外周

10、血成熟的T細(xì)細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)課程課件3. 間接免疫熒光法檢測(cè)淋巴細(xì)胞CD抗原免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。 檢測(cè)技術(shù)3. 間接免疫熒光法檢測(cè)淋巴細(xì)胞CD抗原免疫熒光技術(shù)就是將不一種細(xì)胞分選或分析技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理人和動(dòng)物外周血中T細(xì)胞表面有紅細(xì)胞受體（即CD2分子），在體外能直接和異種或同種動(dòng)物紅細(xì)胞（SRBC）結(jié)合形成玫瑰花樣細(xì)胞團(tuán)，以此來區(qū)分T、B。4、在研制細(xì)胞因子制劑過程中，測(cè)定其活性及效價(jià)4、在研制細(xì)胞因子制劑過程中，測(cè)定其活性及效價(jià)細(xì)胞受到ConA 作用后發(fā)生增殖活化，其胞

11、內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT 作為其底物參與反應(yīng)，形成藍(lán)色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)溶劑溶解后為藍(lán)色溶液，可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD 值，測(cè)定波長(zhǎng)570nm。MTT 是一種噻唑鹽，化學(xué)名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。2、測(cè)定動(dòng)物疫苗免疫或抗原注射后機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)磁珠(microbead)1、雞脾淋巴細(xì)胞懸液制備間接免疫熒光法檢測(cè)淋巴細(xì)胞CD抗原實(shí)驗(yàn)孔cpm SI= 對(duì)照孔cpm用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞取集于玻璃纖維濾紙上。3HTdR的結(jié)果則為73，A組細(xì)胞的增殖是B組的2.BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔

12、板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果.2、測(cè)定動(dòng)物疫苗免疫或抗原注射后機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)（ELISA，定量PCR, Elispot）一種細(xì)胞分選或分析技術(shù)。置5% CO2，37培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3HTdR 20L，使其終濃度為（3.細(xì)胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。4. 免疫磁珠分離法 * 免疫磁珠分離法將針對(duì)細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞，然后用強(qiáng)磁場(chǎng)可將具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞分離出來。磁珠(mic

13、robead)標(biāo)記細(xì)胞上的磁珠在掃描電鏡下也幾乎看不到檢測(cè)技術(shù)一種細(xì)胞分選或分析技術(shù)。4. 免疫磁珠分離法 * 免疫磁珠分磁珠分離策略一. 陽(yáng)性分選磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞未標(biāo)記細(xì)胞先行流出移出磁場(chǎng)后收集目的細(xì)胞CD4+T細(xì)胞分離柱CD4-T細(xì)胞磁珠分離策略一. 陽(yáng)性分選磁珠標(biāo)記目的細(xì)胞未標(biāo)記細(xì)胞先行流出磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞目的細(xì)胞先行流出二. 陰性分選磁珠標(biāo)記非目的細(xì)胞目的細(xì)胞先行流出二. 陰性分選5. 固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) ELISPOT 細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP

14、/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果. 檢測(cè)技術(shù)5. 固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) ELISPOT 細(xì)胞受到刺激后與ELISA的區(qū)別 1、ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出定量的可溶性蛋白總量。 2、ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)活性細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白或者細(xì)胞因子的細(xì)胞的頻率3、由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA和有限

15、稀釋法等更靈敏，能從 20萬30萬 細(xì)胞中檢出 1個(gè) 分泌該蛋白的細(xì)胞。 4、捕獲抗體不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。 與ELISA的區(qū)別 1、ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶圖注：ELISPOT 法在檢測(cè)低頻率產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞時(shí)具有獨(dú)一無二的敏感性。將指定數(shù)目的能產(chǎn)生 IFN- 的T細(xì)胞與一百萬個(gè)抗原呈現(xiàn)細(xì)胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和 ELISA 法（下圖）分別測(cè)量產(chǎn)生 IFN- 的細(xì)胞的數(shù)目。 圖注：ELISPOT 法在檢測(cè)低頻率產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞時(shí)具有細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)課程課件6. T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)

16、化實(shí)驗(yàn)T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖。檢測(cè)技術(shù)6. T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受原兒茶酸對(duì)SPF雞的免疫刺激試驗(yàn)MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。4、在研制細(xì)胞因子制劑過程中，測(cè)定其活性及效價(jià)抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對(duì)小鼠有作用）則刺激B細(xì)胞發(fā)生增殖；定義流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)（ELISA，定

17、量PCR, Elispot）B細(xì)胞沒有紅細(xì)胞受體，但有免疫球蛋白Fc受體和補(bǔ)體C3受體，故可用抗紅細(xì)胞抗體（A）或者補(bǔ)體（C）搭橋，形成EA玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)和EAC玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)。加分裂原共同培養(yǎng)后，觀察形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)3HTdR即（甲基3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前體。受試樣品組的SI值顯著高于對(duì)照組的SI值，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。移出磁場(chǎng)后收集目的細(xì)胞092，淋巴細(xì)胞為1.MTT 是一種噻唑鹽，化學(xué)名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。3HTdR的結(jié)果則為73，A組細(xì)胞的增殖是B組的2.將指定數(shù)目的能產(chǎn)生 IFN- 的T細(xì)胞與一百萬個(gè)抗原呈

18、現(xiàn)細(xì)胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和 ELISA 法（下圖）分別測(cè)量產(chǎn)生 IFN- 的細(xì)胞的數(shù)目。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果.固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù) ELISPOT右:（吖啶橙染色）：圖中可見3個(gè)染成橙黃色熒光的T淋巴細(xì)胞被綿羊紅細(xì)胞所包圍。細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)（ELISA，定量PCR, Elispot）BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISP

19、OT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果.細(xì)胞受到ConA 作用后發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT 作為其底物參與反應(yīng)，形成藍(lán)色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)溶劑溶解后為藍(lán)色溶液，可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD 值，測(cè)定波長(zhǎng)570nm。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作為多克隆刺激劑可選擇性地刺激T細(xì)胞增殖；抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對(duì)小鼠有作用）則刺激B細(xì)胞發(fā)生增殖；美洲商陸（PWM）、腫瘤刺激劑PMA對(duì) T、B細(xì)胞的增殖均有刺激作用。 原兒茶酸對(duì)SPF雞的免疫

20、刺激試驗(yàn)植物血凝素（PHA）、刀豆蛋淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法 形態(tài)計(jì)數(shù)法MTT 法同位素?fù)饺敕馨图?xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法 形態(tài)計(jì)數(shù)法形態(tài)計(jì)數(shù)法加分裂原共同培養(yǎng)后，觀察形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞的百分?jǐn)?shù) 細(xì)胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。形態(tài)計(jì)數(shù)法加分裂原共同培養(yǎng)后，觀察形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算轉(zhuǎn)化為母細(xì)MTT 法MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。MTT 是一種噻唑鹽，化學(xué)名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。細(xì)胞受到ConA 作用后發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT 作為其底物參與反應(yīng)，形成藍(lán)色的甲臜（Formazan）

21、顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)溶劑溶解后為藍(lán)色溶液，可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD 值，測(cè)定波長(zhǎng)570nm。根據(jù)OD 值的大小計(jì)算反應(yīng)體系中細(xì)胞增殖程度。MTT 法MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。同位素法3HTdR 摻入法細(xì)胞增殖的基本條件或前提為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的復(fù)制，這是正常細(xì)胞增殖過程缺一不可的前提。3HTdR即（甲基3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前體。加入細(xì)胞培養(yǎng)液中后被細(xì)胞攝取作為DNA合成的原料。細(xì)胞合成的DNA越多，則所摻入的3HTdR就越多，因此，檢測(cè)所摻入的3HTdR就可反映細(xì)胞增殖的程度。因該方法有同位素污染問題，故我們實(shí)習(xí)中仍用MTT法。同位素法3HTd

22、R 摻入法細(xì)胞增殖的基本條件或前提為細(xì)胞質(zhì)和同位素法優(yōu)勢(shì)3HTdR=增殖細(xì)胞數(shù)；MTT=總細(xì)胞數(shù)。所以前者更能反映細(xì)胞增殖指數(shù)。例，培養(yǎng)10個(gè)細(xì)胞，3天后A組為17個(gè)，B組為13個(gè)，此為MTT的結(jié)果；3HTdR的結(jié)果則為73，A組細(xì)胞的增殖是B組的2.3倍。 同位素法優(yōu)勢(shì)3HTdR=增殖細(xì)胞數(shù)；MTT=總細(xì)胞數(shù)。所以前實(shí)驗(yàn)步驟1、雞脾淋巴細(xì)胞懸液制備淋巴細(xì)胞的分離用1640培養(yǎng)液配成106細(xì)胞/ml實(shí)驗(yàn)步驟1、雞脾淋巴細(xì)胞懸液制備淋巴細(xì)胞的分離用1640培養(yǎng)2、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)將脾細(xì)胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，200L/孔，每一份脾細(xì)胞懸液分裝6個(gè)孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3個(gè)孔不

23、加ConA 作為對(duì)照。置5% CO2，37培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3HTdR 20L，使其終濃度為（3.718.5）104Bq/mL。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測(cè)量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)（cpm）。3、數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示增殖程度，用刺激指數(shù)（SI）來表示 實(shí)驗(yàn)孔cpm SI= 對(duì)照孔cpm受試樣品組的SI值顯著高于對(duì)照組的SI值，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。2、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)原兒茶酸對(duì)SPF雞的免疫刺激試驗(yàn)Poultry Science, 2012,91 :16041609 原兒茶酸對(duì)SPF雞

24、的免疫刺激試驗(yàn)Poultry Scienc免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法受試樣品組的SI值顯著高于對(duì)照組的SI值，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。流式細(xì)胞術(shù) T細(xì)胞亞群濾紙片充分干燥后置測(cè)量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)（cpm）。細(xì)胞體積增大，代謝旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖。定義流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)是七十年

25、代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。一種細(xì)胞分選或分析技術(shù)。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果.具有CD4抗原的T細(xì)胞TH（機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動(dòng)細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞免疫應(yīng)答，活化的TH細(xì)胞可釋放IL2及IFNr）將待測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。具有CD4抗原的T細(xì)

26、胞TH（機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動(dòng)細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞免疫應(yīng)答，活化的TH細(xì)胞可釋放IL2及IFNr）它不僅可測(cè)量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等,可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析,在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)分析大量細(xì)胞,并收集、儲(chǔ)存和處理數(shù)據(jù),進(jìn)行多參數(shù)定量分析;能夠分類收集(分選)某一亞群細(xì)胞,分選純度95%?？笽gM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對(duì)小鼠有作用）則刺激B細(xì)胞發(fā)生增殖；細(xì)胞免疫（cellular immunity） T細(xì)胞受到抗原刺激后，增殖、分化、轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞(也叫效應(yīng)T細(xì)胞)，當(dāng)相同抗原再次進(jìn)入機(jī)體的細(xì)胞中時(shí)，

27、致敏T細(xì)胞（效應(yīng)T細(xì)胞）對(duì)抗原的直接殺傷作用及致敏T細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子的協(xié)同殺傷作用，統(tǒng)稱為細(xì)胞免疫。加分裂原共同培養(yǎng)后，觀察形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示增殖程度，用刺激指數(shù)（SI）來表示T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖。MTT 是一種噻唑鹽，化學(xué)名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。MTT 是一種噻唑鹽，化學(xué)名3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。2、測(cè)定動(dòng)物疫苗免疫或抗原注射后機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物

28、學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。受試樣品組的SI值顯著高于對(duì)照組的SI值，即可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。具有CD8抗原的T細(xì)胞Tc（在TH輔助下特異性殺傷或溶解靶細(xì)胞）免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。MTT 法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。將待測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。定義流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一

29、體,同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。移出磁場(chǎng)后收集目的細(xì)胞一種細(xì)胞分選或分析技術(shù)。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果.抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對(duì)小鼠有作用）則刺激B細(xì)胞發(fā)生增殖；* 免疫磁珠分離法將針對(duì)細(xì)胞某種表面標(biāo)記的特異性抗體包被在磁性微珠上，與磁珠交聯(lián)的抗體能夠特異性結(jié)合具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞，然后用強(qiáng)磁場(chǎng)可將具有這種表面標(biāo)記的細(xì)胞分離出來。3HTdR即（甲基3H）胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前體。將指定數(shù)目的能產(chǎn)生 IFN- 的T細(xì)胞與一百萬個(gè)抗原呈現(xiàn)細(xì)胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上圖）、胞質(zhì)內(nèi)染法（中圖）和 ELISA 法（下圖）分別測(cè)