食品安全地方標準 動物源性食品中沙門菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法

1、 食品安全地方標準 動物源性食品中沙門菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法警告警告使用本標準的人員應有正規(guī)實驗室工作的實踐經驗。本標準并未指出所有可能的安全問題。使用者有責任采取適當的安全和健康措施，并保證符合國家有關法規(guī)規(guī)定的條件。范圍本標準規(guī)范了沙門菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法。本標準適用于肉、蛋、奶等動物源性食品中沙門菌的鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 4789.42010 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方

2、法術語及定義下列術語和定義適用于本標準。沙門菌屬（Salmonella）沙門菌屬是一群寄生于人和動物腸道內的一大群形態(tài)、生化性狀及抗原構造相似的革蘭氏陰性桿菌。無芽胞，無莢膜，多數細菌有周身鞭毛和菌毛，有動力，生化特性和抗原構造相似，需氧或兼性厭氧的一類細菌。環(huán)介導等溫擴增技術（loop mediated isothermal amplication，LAMP）環(huán)介導等溫擴增技術是針對靶基因的6 個區(qū)域設計4 種特異引物，利用一種鏈置換DNA 聚合酶在等溫條件（63 左右）保溫30 min-60 min，即可完成核酸擴增反應。擴增產生的特異性產物量大，肉眼、電泳或比濁儀均可判度結果，適于病原檢

3、測。試劑與材料特異性引物根據沙門菌STN基因，設計LAMP檢測引物，濃度與序列，特異性引物濃度及序列引物種類引物名稱濃度核苷酸序列外引物F32.5 mol/L5-CCTTTCCCGCTATCGGTAAC -3B32.5 mol/L5- GGATGCCCAAAGCAGAGAG -3內引物FIP20 mol/L5 -GGCCGCCAGGGAACGATTAG-TGATGATAACGCGGTCGGT-3BIP20 mol/L5-TTCAACAGCACCTGAGTCAGCC-TTCACGGCGAATGAGACG-3環(huán)引物LF10 mol/L5 -CGTAGAGGCAAAAGAAAGTGGG-3LB10

4、mol/L5 -TGTCCGGGTCAGCCTGA-3試劑培養(yǎng)基緩沖蛋白胨水（BPW）增菌液：。亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液：。四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：。DNA抽提試劑DNA抽提試劑如下：TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1 mmol/L EDTA，pH8.0）：；10%（W/V）十二烷基硫酸鈉（SDS）；20mg/mL蛋白酶K；5 mol/L氯化鈉（NaCl）溶液；CTAB-NaCl溶液（10%CTAB，0.7 mol/L NaCl）；氯仿-異戊醇（24：1，V/V）；酚-氯仿-異戊醇（25：24：1V/V）；異丙醇；70%乙醇：。LAMP試劑LAMP試劑如

5、下：10Bst DNA聚合酶緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L （NH4）2SO4，20 mmol/L MgSO4，1% Triton-100，pH8.8，25）；25 mmol/L MgCl2；10 mmol/L dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP；8 U/L Bst DNA聚合酶；5 mol/L Betaine；滅菌雙蒸水。其他試劑DNA染料溴化乙錠（EB）或其替代品，10mg/mL溴化乙錠：；凝膠加樣緩沖液：；1倍Tris-硼酸電泳緩沖液：；瓊脂糖；DNA分子質量標準；SYBR Green I 染料

6、。材料本方法使用下列一次性耗材： PE無菌手套或乳膠手套；EP離心管；PCR反應管；吸頭。儀器設備本方法使用下列儀器設備：恒溫培養(yǎng)箱：36 1 ，42 1 。；均質器；振蕩器；電子天平：感量 0.1 g；無菌錐形瓶：容量 500 mL，250 mL；小型高速離心機：5 000 r/min-16 000 r/min；PCR儀、LAMP儀或水浴鍋：室溫-100；電泳儀；紫外光透射儀或凝膠成像系統(tǒng)；微量加樣器；pH 計或pH 比色管或精密 pH 試紙。操作程序樣品前處理根據樣品來源具體情況，選擇以下一種或多種方法。稱取25 g（mL）樣品放入盛有225 mL BPW 的無菌均質杯中，以8 000 r

7、/min10 000 r/min 均質1 min2 min，或置于盛有225 mL BPW 的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min2 min。若樣品為液態(tài)，不需要均質，振蕩混勻。如需測定pH值，用1 mol/mL無菌NaOH或HCl調pH至6.80.2。無菌操作將樣品轉至500 mL錐形瓶中，如使用均質袋，可直接進行培養(yǎng)，于37 培養(yǎng)4 h18 h。見GB 4789.42010 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗。培養(yǎng)基培養(yǎng)取10 mL BPW增菌液，加入100 mL亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液中，37 培養(yǎng)24 h；或取10 mL BPW增菌液，加入100 mL四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增

8、菌液中，42 培養(yǎng)24 h，增菌液備用。DNA模板的制備以下兩種提取方法均能達到預期效果，方法一提取速度比方法二更快速。水煮模板法取1 mL增菌液放入1.5毫升EP管中，5 000 r/min離心5 min，用滅菌生理鹽水洗滌兩次，最后用滅菌蒸餾水懸浮，置100煮沸15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清作為DNA模板，-20備用。CTAB-NaCl細菌DNA提取法取1 mL增菌液放入1.5毫升EP管中，5 000 r/min離心5 min，用滅菌生理鹽水洗滌兩次，12 000 r/min離心2 min，棄上清；沉淀物加入567 L的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮。加入

9、30 L 10% SDS和3 L蛋白酶K，混勻，置37溫育1 h；加入 100 L 5 mol/L NaCl，充分混勻，再加入80 L CTAB-NaCl溶液，混勻，置65溫育10 min；加入等體積的氯仿-異戊醇，混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清放入EP管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇，混勻，10 000 r/min離心5 min；取上清放入EP管中，加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混合，10 000 r/min離心5 min，棄上清。沉淀中加入1 mL 70%乙醇中洗滌，10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀重溶于100 L的TE緩沖液作為DNA模板，-2

10、0備用。陰性及陽性對照：陰性對照H2O代替模板，作陰性對照。陽性對照用沙門菌參考菌株抽提的DNA為模板，作陽性對照。LAMP檢測方法反應體系按下列試劑用量在PCR反應管中分別加入各成分：10Bst DNA聚合酶緩沖液：2.5 L；引物： 1.0 L；25 mmol/L MgCl2： 6.0 L；10 mmol/L dNTPs混合物： 3.5 L；8 U/L Bst DNA聚合酶： 1.0 L；5 mol/L Betaine： 4.0 L；待檢樣品模板： 1.0 L；滅菌雙蒸水： 6.0 L，至總體積為25 L。引物終濃度FIP和BIP為0.8 mol/L，F(xiàn)3和B3為0.1 mol/L，LF和

11、LB為0.4 mol/L。反應程序將反應管混勻，瞬時離心后置65反應40 min，80 10 min終止反應。結果觀察眼觀沉淀將反應管12 000 r/min，離心1 min，觀察管底白色沉淀。有沉淀者為陽性，無沉淀者為陰性。眼觀顏色反應管加入1 000SYBR Green I 染料 l L，充分混勻，觀察顏色變化，綠色為陽性，橙色為陰性。如預先已在反應管中加入染料可直接觀察。凝膠電泳瓊脂糖凝膠制備制膠板的準備將凝膠托架水平放置在工作臺上，放上梳子，使梳齒下沿距離托架底板0.5 mm1.0 mm。1.5%瓊脂糖凝膠的制備稱取1.5 g瓊脂糖于三角燒瓶中，加入100 mL 1倍Tris-硼酸電泳

12、緩沖液，加熱溶解瓊脂糖。待瓊脂糖溶液冷卻至約50 時，加入10 mg/mL溴化乙錠溶液5 L，使其終濃度為0.5 g/mL，充分混合，避免起泡。倒入凝膠托架，凝膠厚度控制在3 mm5 mm之間。將凝膠連同托架一起放入電泳槽中，加入1倍Tris-硼酸電泳緩沖液，使之沒過凝膠表面約2 mm，輕輕拔出梳子，以備加樣電泳。加樣取3 L擴增產物1.5%電泳條件以5V/cm凝膠長的穩(wěn)壓電泳，直至溴酚藍指示劑到達瓊脂糖凝膠長度的1/3時停止電泳。結果判定結果判定在陰性對照、陽性對照符合時，判定樣品檢測結果。根據8.1和8.2結果，可做出現(xiàn)場判定?；蛘吒鶕?.3可做出判定。注：實驗結果圖見附錄B。廢棄物處理和

13、防止污染的措施檢測過程中分區(qū)操作，防止交叉污染。檢測廢棄物高壓滅菌等無害化處理。實驗前后，實驗室用紫外線消毒。（規(guī)范性附錄）溶液配制緩沖蛋白胨水（BPW）增菌液按下列方法配制：蛋白胨：10.0 g；氯化鈉：5.0 g；磷酸氫二鈉（含 12 個結晶水）：9.0 g；磷酸二氫鉀：1.5 g；蒸餾水：1 000 mL。將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約 10 min，煮沸溶解，調節(jié)pH 7.20.2，高壓滅菌121 ，15min。亞硒酸胱氨酸（SC）增菌液基礎液蛋白胨：10.0 g；牛肉膏：5.0 g；氯化鈉：3.0 g；碳酸鈣：45.0 g；蒸餾水：1 000 mL。除碳酸鈣外，將各成分加入蒸

14、餾水中，煮沸溶解，再加入碳酸鈣，調節(jié)pH7.00.2，高壓滅菌121 ，20 min。硫代硫酸鈉溶液硫代硫酸鈉（含5個結晶水）：50.0 g；蒸餾水：100 mL。高壓滅菌121 ，20 min。碘溶液碘片：20.0 g；碘化鉀：25.0 g；蒸餾水：100 mL將碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中，再投入碘片，振搖玻瓶至碘片全部溶解為止，然后加蒸餾水至規(guī)定的總量，貯存于棕色瓶內，塞緊瓶蓋備用。0.5煌綠水溶液煌綠：0.5 g；蒸餾水：100 mL。溶解后，存放暗處，不少于1 d，使其自然滅菌。牛膽鹽溶液牛膽鹽：10.0 g；蒸餾水：100 mL。加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121 ，20 min

15、。增菌液基礎液：900 mL硫代硫酸鈉溶液：100 mL碘溶液：20.0 mL煌綠水溶液：2.0 mL牛膽鹽溶液：50.0 mL臨用前，按上列順序，以無菌操作依次加入基礎液中，每加入一種成分，均應搖勻后再加入另一種成分。緩沖蛋白胨水（BPW）按下列方法配制：蛋白胨：5.0 g；乳糖：4.0 g；磷酸氫二鈉：10.0 g；亞硒酸氫鈉：4.0 g；L-胱氨酸：0.01 g；蒸餾水：1 000 mL。除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，冷至55 以下，以無菌操作加入亞硒酸氫鈉和1 g/L L-胱氨酸溶液 10 mL（稱取 0.1 g L-胱氨酸，加 1 mol/L 氫氧化鈉溶

16、液 15 mL，使溶解，再加無菌蒸餾水至 100 mL 即成，如為 DL-胱氨酸，用量應加倍）。搖勻，調節(jié) pH7.00.2。TE的配制TE按下列方法進行配制：10 mmol/L Tris-Cl pH 8.0；1 mmol/L EDTA pH 8.0；分裝后，1.034105 Pa高壓滅菌30 min。室溫保存。70%酒精的配制70%酒精按下列方法配制：無水乙醇：700 mL；滅菌雙蒸水：300 mL。在700 mL無水酒精中加入300mL滅菌雙蒸水，-20 保存。10 mg/mL溴化乙錠的配制10mg/mL溴化乙錠按下列方法配制：溴化乙錠（EB）：1.0 g；雙蒸水：100 mL。在100

17、mL雙蒸水中加入1.0 g溴化乙錠，用鋁箔包裹容器，磁力攪拌數小時以確保其完全溶解，然后移至棕色瓶中，保存于室溫。溴化乙錠是強誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時應戴上手套，稱量時要戴面罩。廢棄溴化乙錠或含溴化乙錠的電泳液、凝膠等要集中回收處理，處理方法按照附錄D。凝膠加樣緩沖液的配制凝膠加樣緩沖液按下列方法配制：蔗糖：40.0 g；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）：20 mL；10%SDS：5 mL；溴酚藍：50.0 mg；雙蒸水：75 mL。先將蔗糖完全溶解于雙蒸水，然后按順序加入其余各成份，待所有成分溶解混合均勻后，用0.22m的微孔濾膜過濾除菌，4保存。Tris-硼酸電泳緩沖液的配制5 倍 Tris-硼酸電泳緩沖液的配制5倍Tris-硼酸電泳緩沖液配制方法如下：Tris：54 g；硼酸：27.5 g；0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）：20 mL；雙蒸水：定容至 1 000 mL。 在800 mL 雙蒸水中加入54 g Tris、27.5 g硼酸和20 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），磁力攪拌以確保其完全溶解，移至棕色瓶中，室溫保存。1倍Tris-硼酸電泳緩沖液的配制1倍Tris-硼酸電泳緩沖液配制如下：5 倍Tris-硼酸電泳緩沖液：100 mL；雙蒸水：400 mL。在400 mL