亞硒酸鈉對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)p38MAPK和MCP

1、亞硒酸鈉對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)p38MAPK和MCP【關(guān)鍵詞】亞硒酸鈉；p38絲裂原活化蛋白激酶；單核細(xì)胞趨化蛋白R(shí)lefsdiuseleniteinregulatingexpressinsfp38APKandP1inratesangialells【Abstrat】AI:Tbservetheeffetfsdiuselenitenexpressinsfp38itgenativatedprtEinkinase(p38APK)andnyteheattratantprtein1(P1)inratesangialelllineHBZY1,andtstudytheehanisfsdiuselenitei

2、npreventingdiabetinephrpathy.ETHDS：elllineHBZY1asinubatedithhighgluse,highinsulin,H22andadvanedglysylatinendprduts(AGEs),respetively(ntrlgrup);siultaneusly,theelllineHBZY1pretreatedithsdiuseleniteasalsinubatediththeabvefatrs(experientalgrup).Theexpressinsfp38APKandP1eredetetedandparedinthe2grups.RES

3、ULTS：Furfatrsinreasedtheexpressinsfp38APKandP1indepently;sdiuseleniteinhibitedtheexpressinsfp38APKandP1bythe4fatrsdistintly.NLUSIN：Sdiuseleniteansuppresstheexpressinsfp38APKandP1intheelllineHBZY1,hihsuggeststhatsdiuseleniteayplayasignifiantrleinthepreventinfdiabetinephrpathybytheinhibitinftheexpress

4、insfp38APKandP1intheelllineHBZY1.【Keyrds】sdiuselenite;p38itgenativatedprteinkinase;nyteheattratantprtein1;esangialells;diabetinephrpathy【摘要】目的：觀察亞硒酸鈉對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞系HBZY1表達(dá)p38絲裂原活化蛋白激酶p38APK和單核細(xì)胞趨化蛋白1(P1)的影響，從而研究硒在防治糖尿病腎病DN中的作用機(jī)制.方法：分別以高葡萄糖、高胰島素、過(guò)氧化氫和糖基化終末產(chǎn)物AGEs刺激HBZY1細(xì)胞；先給予100nl/L亞硒酸鈉預(yù)處理后，再分別以上述4種刺激因素孵育

5、HBZY1細(xì)胞，分別檢測(cè)HBZY1細(xì)胞p38APK和P1的表達(dá)并比擬.結(jié)果：4種刺激因素均可作為獨(dú)立因素，導(dǎo)致HBZY1細(xì)胞p38APK和P1表達(dá)量增加；亞硒酸鈉能抑制上述4種因素所致的p38APK和P1的表達(dá).結(jié)論：亞硒酸鈉通過(guò)抑制p38APK和P1在HBZY1細(xì)胞的表達(dá),從而有效防治DN的發(fā)生開展，說(shuō)明硒在DN的防治過(guò)程中發(fā)揮積極作用.【關(guān)鍵詞】亞硒酸鈉；p38絲裂原活化蛋白激酶；單核細(xì)胞趨化蛋白1；系膜細(xì)胞；糖尿病腎病【中圖號(hào)】R587.240引言近年來(lái)國(guó)外研究說(shuō)明單核細(xì)胞趨化蛋白1(nyteheattratantprtein1，P1)與糖尿病腎病diabetinephrpathy,DN

6、有親密關(guān)系1.p38APK是細(xì)胞信號(hào)傳遞的交匯點(diǎn)或共同通路2-3，但它在DN發(fā)生中的作用及其與P1關(guān)系仍不非常清楚；硒是機(jī)體必需微量元素之一，其缺乏可加劇DN的氧化應(yīng)激，并可產(chǎn)生擬高血糖病理狀態(tài)，從而加劇DN的發(fā)生開展4.但其是否作用于p38APK和P1國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.我們分別給予高葡萄糖(HG)、高胰島素(HI)、過(guò)氧化氫(H22)和糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)孵育HBZY1細(xì)胞，觀察HBZY1細(xì)胞p38APK和P1的表達(dá)以及亞硒酸鈉對(duì)HBZY1細(xì)胞p38APK和P1表達(dá)的影響.從而明確二者在DN形成中的作用及硒在防治DN中的作用機(jī)制.1材料和方法1.1材料大鼠腎小球系膜細(xì)胞系HBZY1，

7、中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心T；新生牛血清、RPI1640培養(yǎng)液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗北京中山生物技術(shù)；亞硒酸鈉(KarlinskaInstitute贈(zèng)送)；柱離心式總RNA抽提試劑盒、RTPR兩步法試劑盒、PR相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)TaKaRa公司；PR引物合成上海博亞生物技術(shù)，蛋白質(zhì)相對(duì)分子量標(biāo)記物BiRad公司；磷酸化p38APK兔多抗(Prega公司).1.2方法1.2.1細(xì)胞系HBZY1的培養(yǎng)HBZY1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于200L/LRPI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37，飽和濕度50L/L2，每23日用0.2g/L乙二胺四乙酸EDTA消化傳代.HBZY1細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底40%后分為9組

8、，以無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓24h,然后按實(shí)驗(yàn)分組參加刺激及干預(yù)因素.1.2.2體外制備AGEs參考文獻(xiàn)5，按牛血清白蛋白bvineserualbuin,BSA50g/L，與葡萄糖90g/L，0.5l/LEDTA及0.2l/LPBSpH7.4混勻后過(guò)濾除菌，37恒溫培養(yǎng)箱卵孵育60d.0.1l/LPBSpH7.4中透析48h，測(cè)定蛋白含量及熒光強(qiáng)度，分裝后存于-80冰箱保存?zhèn)溆?1.2.3實(shí)驗(yàn)分組分別以一定濃度HG,HI,H22和AGEs刺激細(xì)胞系HBZY1一定時(shí)間；先給予亞硒酸鈉100nl/L預(yù)處理HBZY1細(xì)胞48h后，再分別以上述4種刺激因素濃度、時(shí)間同前孵育HBZY1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)對(duì)照組.分組情

9、況如下：對(duì)照組：用等體積PBS培養(yǎng)細(xì)胞;HG組：用25l/L葡萄糖刺激HBZY1細(xì)胞72h;HI組：用100nl/L胰島素刺激HBZY1細(xì)胞24h;H22組：用100l/LH22刺激HBZY1細(xì)胞1h;AGEs組：用100g/LAGEs刺激HBZY1細(xì)胞6h;亞硒酸鈉+HG組：依次以100nl/L亞硒酸鈉和25l/L葡萄糖分別刺激HBZY1細(xì)胞48h和72h;亞硒酸鈉+HI組：依次以100nl/L亞硒酸鈉和100nl/L胰島素分別刺激HBZY1細(xì)胞48h和24h;亞硒酸鈉+H22組：依次以100nl/L亞硒酸鈉和100l/LH22分別刺激HBZY1細(xì)胞48h和1h;亞硒酸鈉+AGEs組：依次以

10、100nl/L亞硒酸鈉和100g/LAGEs分別刺激HBZY1細(xì)胞48h和6h.1.2.4RTPR法檢測(cè)P1RNA表達(dá)以柱離心式總RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞系HBZY1總RNA，測(cè)定總RNA濃度，計(jì)算純度，A260n/A280n均在1.82.0之間.P1引物序列按文獻(xiàn)6：上游引物：5ATAAGAGAGGTGTAAAGAAGT3；下游引物：5AGAAGTGTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度258bp.atin引物序列：上游引物：5TTTGATTAAAGGAA3;下游引物：5TTTTTTTTGTGTTTGG3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度228bp.以兩步法RTPR試劑盒進(jìn)展反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，擴(kuò)

11、增條件：94變性30s，55退火1in,72延伸1in,共35個(gè)循環(huán)，72最后延伸7in.每次PR反響至少重復(fù)3次.PR產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果經(jīng)圖象分析系統(tǒng)掃描存圖，并對(duì)目的條帶進(jìn)展密度分析.1.2.5esternblt法檢測(cè)p38APK蛋白表達(dá)培養(yǎng)的細(xì)胞系HBZY1，經(jīng)4胞漿蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12000g4離心10in，沉淀參加4預(yù)冷核蛋白提取液，震蕩混勻，冰浴1h，再12000g4離心30in，取上清為核蛋白，其蛋白濃度經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法定量.磷酸化p38APK表達(dá)量采用esternblt法檢測(cè)，核蛋白中參加等體積2上樣緩沖液煮沸5in.進(jìn)展10l/LSD

12、SPAGE，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5g/LBSA室溫下封閉2h，分別用12000抗磷酸化p38APK兔多抗4孵育過(guò)夜，用PBS充分洗滌，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG15000，37孵育1h，用PBS充分洗滌，DAB顯色試劑盒顯色.結(jié)果經(jīng)圖象分析系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)展掃描存圖并進(jìn)展密度分析.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：資料采用SAS8.0進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比擬用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，P0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.2結(jié)果2.1細(xì)胞系HBZY1P1RNA表達(dá)細(xì)胞系HBZY1P1RNA表達(dá)以atin作為內(nèi)參照物調(diào)整后進(jìn)展半定量分析，HG，HI，H22和AGEs均可作為獨(dú)立因素使細(xì)胞系HBZY1P1RNA表達(dá)量均明

13、顯增加P0.01，表1，圖1.表1各組細(xì)胞系HBZY1P1RTPR和磷酸化p38APKesternblt半定量結(jié)果略2.2細(xì)胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白表達(dá)細(xì)胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白表達(dá)以atin作為內(nèi)參照物調(diào)整后進(jìn)展半定量分，HG，HI，H22和AGEs均可作為獨(dú)立因素激活p38APK，使細(xì)胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白表達(dá)明顯增加P0.01，表1，圖2.圖1RTPR法檢測(cè)各組細(xì)胞系HBZY1P1RNA和atinRNA表達(dá)略圖2esternblt法檢測(cè)各組細(xì)胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白和atin蛋白表達(dá)略2.3細(xì)胞系HBZY1P1RNA表達(dá)細(xì)胞系HBZY1P

14、1RNA表達(dá)以atin作為內(nèi)參照物調(diào)整后進(jìn)展半定量分析.亞硒酸鈉預(yù)處理后，再分別給予以上4種刺激因素孵育細(xì)胞系HBZY1，可見(jiàn)P1RNA表達(dá)量分別較相應(yīng)未經(jīng)亞硒酸鈉預(yù)處理各組明顯減少P0.01，表1，圖1.2.4細(xì)胞系HBZY1磷酸化p38APK蛋白表達(dá)的影響HBZY1細(xì)胞磷酸化p38APK蛋白表達(dá)以atin作為內(nèi)參照物調(diào)整后進(jìn)展半定量分析.先以亞硒酸鈉預(yù)處理細(xì)胞系HBZY1后，再分別給予上述4種刺激因素刺激細(xì)胞系HBZY1，可見(jiàn)磷酸化p38APK蛋白表達(dá)量分別較相應(yīng)未經(jīng)亞硒酸鈉預(yù)處理各組顯著減少P0.01，但與對(duì)照組比擬仍有顯著差異P0.01，表1，圖2.3討論本研究結(jié)果顯示HG,HI,H2

15、2和AGEs均可單獨(dú)誘導(dǎo)細(xì)胞系HBZY1，使其P1RNA表達(dá)量明顯增加.4種刺激素誘導(dǎo)HBZY1細(xì)胞P1RNA表達(dá)增加的機(jī)制，結(jié)合文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為有以下幾點(diǎn)：高糖有直接刺激P1RNA及蛋白表達(dá)增高的作用，該作用是PK，APKs所介導(dǎo)，這可能是DN時(shí)腎小球中單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的重要原因;大量AGEs可以和系膜細(xì)胞上的AGEs受體RAGE互相作用，使IB磷酸化而導(dǎo)致NFB激活；新近的研究說(shuō)明8，AGEs與AGEs受體RAGE互相作用可消耗細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽，產(chǎn)生大量的氧自由基，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)改變，激活核轉(zhuǎn)錄因子NFB/AP1.同時(shí)NFB也是調(diào)節(jié)RAGE表達(dá)的一個(gè)啟動(dòng)子，它的位點(diǎn)1和位點(diǎn)2的

16、激活可使RAGE表達(dá)上調(diào)，NFB的激活作為一種正反響，又進(jìn)一步促進(jìn)了AGEs與RAGE的結(jié)合，導(dǎo)致NFB的持續(xù)活化，而活化的NFB可以上調(diào)P1RNA和蛋白表達(dá)，從而在糖尿病所致腎臟損害中發(fā)揮重要作用;過(guò)氧化氫可導(dǎo)致系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激加劇，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RS產(chǎn)生，從而迅速激活NFB，上調(diào)P1表達(dá)，在DN發(fā)生開展早期起重要作用8;HI可能是通過(guò)激活PK，APKs信號(hào)通路，引起系膜細(xì)胞氧化復(fù)原狀態(tài)發(fā)生變化，使細(xì)胞內(nèi)RS產(chǎn)生增加，導(dǎo)致NFB激活，從而使P1表達(dá)上調(diào).P1介導(dǎo)糖尿病腎小球損傷.P1不僅對(duì)血液中單核細(xì)胞有很強(qiáng)的趨化活性，也能通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NFB和AP1來(lái)誘導(dǎo)非炎癥細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和黏附分子，在

17、誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷入內(nèi)皮下間隙及滲入腎小球的過(guò)程中起重要作用7-8；同時(shí)，滲入到腎小球的單核巨噬細(xì)胞反過(guò)來(lái)又刺激部分腎小球細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞衍化生長(zhǎng)因子如PDGF和TGF等作用下導(dǎo)致系膜增生和細(xì)胞外基質(zhì)聚集；此外通過(guò)炎癥細(xì)胞因子作用，還可上調(diào)黏附分子和趨化因子的分泌，從而進(jìn)一步有利于白細(xì)胞滲入到腎小球7.近年來(lái)通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及對(duì)人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物DN的研究發(fā)現(xiàn)，P1在DN的發(fā)病機(jī)制中起重要作用.p38APK可被多種細(xì)胞外刺激激活，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和調(diào)控某些因子表達(dá)9-11.本研究以糖尿病時(shí)存在的4種應(yīng)激因素孵育大鼠腎小球系膜細(xì)胞系HBZY1，可見(jiàn)p38APK被激活，磷酸化表達(dá)增加.硒是機(jī)體必需微量元

18、素之一，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的重要組成部分，缺硒可出現(xiàn)擬高血糖癥病理狀態(tài)，引起白蛋白尿和腎小球硬化，從而加劇DN的發(fā)生開展；補(bǔ)充硒不僅可預(yù)防氧化應(yīng)激，而且可防止腎臟損傷4,12.本研究結(jié)果還顯示，亞硒酸鈉具有類似p38APK抑制劑所產(chǎn)生的作用，其機(jī)制可能是：通過(guò)保護(hù)系膜細(xì)胞免遭氧化損傷而抑制P1的分泌；通過(guò)抑制p38APK信號(hào)通路而抑制P1在系膜細(xì)胞的表達(dá).說(shuō)明亞硒酸鈉可能通過(guò)抑制p38APK而延緩DN的發(fā)生開展，但亞硒酸鈉是否通過(guò)抗氧化而抑制p38APK亦或作用于信號(hào)通路的其它環(huán)節(jié)尚需進(jìn)一步深化討論，提示硒在防治DN發(fā)生開展過(guò)程中發(fā)揮著積極作用.【參考文獻(xiàn)】1BanbaN,NakauraT,

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