白腐真菌生物技術(shù)與應(yīng)用課件

1、白腐真菌生物技術(shù)與應(yīng)用環(huán)境工程專業(yè)選修課主講教師 胡長(zhǎng)慶1完整版課件ppt白腐真菌生物技術(shù)與應(yīng)用環(huán)境工程專業(yè)選修課主講教師 胡長(zhǎng)慶1課程安排與考核方式學(xué)時(shí)數(shù) 32學(xué)時(shí)（包括討論課時(shí)）白腐真菌生物學(xué)基礎(chǔ)（理論基礎(chǔ)）白腐真菌生物技術(shù)（應(yīng)用基礎(chǔ)）白腐真菌在環(huán)境保護(hù)中的作用（應(yīng)用實(shí)踐）考核方式 閉卷考核成績(jī)分配 平時(shí)占40% ；考核占60%2完整版課件ppt課程安排與考核方式學(xué)時(shí)數(shù) 32學(xué)時(shí)（包括討論課時(shí)）白腐真菌課程內(nèi)容簡(jiǎn)介1白腐真菌生物學(xué)基礎(chǔ) 白腐真菌研究的歷史、現(xiàn)狀與未來(lái) 白腐真菌生物學(xué)（概念、分類、特點(diǎn)、生物降解等）2白腐真菌生物技術(shù) 包括白腐真菌的培養(yǎng)、分離、酶技術(shù)、固定化技術(shù)等3白腐真菌在

2、環(huán)境保護(hù)中的作用 白腐真菌與水污染控制 白腐真菌與土壤污染控制 白腐真菌與重金屬污染 白腐真菌與大氣污染控制 白腐真菌與有機(jī)固體廢物資源化3完整版課件ppt課程內(nèi)容簡(jiǎn)介1白腐真菌生物學(xué)基礎(chǔ) 白腐真菌研究的歷史、現(xiàn)狀與1白腐真菌生物學(xué)基礎(chǔ) 白腐真菌研究的歷史、現(xiàn)狀與未來(lái)白腐真菌研究探索的歷史 20世紀(jì)70年代至20世紀(jì)90年代白腐真菌研究繁榮的現(xiàn)狀 以分子生物學(xué)為特征的理論研究白腐真菌研究發(fā)展的未來(lái) 以工業(yè)化應(yīng)用為終極目標(biāo)4完整版課件ppt1白腐真菌生物學(xué)基礎(chǔ) 白腐真菌研究的歷史、現(xiàn)狀與未來(lái)白腐真菌白腐真菌生物學(xué)1、白腐真菌（White Rot Fungi）的概念白腐真菌的概念不是生物學(xué)術(shù)語(yǔ)，而

3、是一種功能描述的概念纖維素木腐真菌Wood Rotting Fungi木質(zhì)纖維素Ligno-cellulose軟腐真菌Soft rot Fungi褐腐真菌Brown rot Fungi白腐真菌White rot Fungi木質(zhì)素半纖維素多糖類軟腐真菌：主要降解纖維素，對(duì)木質(zhì)素降解 緩慢且不徹底。褐腐真菌：主要降解纖維素、半纖維素和部 分多糖類，幾乎不降解木質(zhì)素。白腐真菌：主要降解木質(zhì)素和多糖類，對(duì)纖 維素和半纖維素降解能力弱。5完整版課件ppt白腐真菌生物學(xué)1、白腐真菌（White Rot Fungi）小結(jié)到底什么是白腐真菌？白腐真菌的概念是從功能角度對(duì)其進(jìn)行描述和界定的白腐真菌是一類能夠引起

4、木質(zhì)白色腐爛的絲狀真菌主要降解木質(zhì)素和多糖類，對(duì)纖維素和半纖維素降解能力弱白腐真菌嗜熱性好氧微生物6完整版課件ppt小結(jié)到底什么是白腐真菌？白腐真菌的概念是從功能角度對(duì)其進(jìn)行描2、白腐真菌的分類地位與主要種類2-1 白腐真菌的分類地位生物界細(xì)菌古菌真核生物“生物三界學(xué)說(shuō)” 示意圖 根據(jù)16S rRNA堿基序列特點(diǎn)，整個(gè)生物界被劃分為細(xì)菌（bacteria）、古菌（archaea）和真核生物（eukaryotes）3大超界（Domain）白腐真菌屬于真核生物超界。 木腐真菌已知的有16001700種，大多數(shù)是擔(dān)子菌和子囊菌。軟腐真菌：子囊菌、半知菌褐腐真菌：大部分屬于擔(dān)子菌白腐真菌：主要是擔(dān)子菌

5、，少 數(shù)為子囊菌7完整版課件ppt2、白腐真菌的分類地位與主要種類2-1 白腐真菌的分類地位生2-2 白腐真菌的主要種類 已知白腐真菌種類有400多種，研究最為透徹，被稱為白腐真菌研究模式菌種的是黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium Burdsal）。 黃孢原毛平革菌的生物學(xué)分類地位擔(dān)子菌門Basidiomycota伏革菌科Corticiaceae非褶菌目Aphyllophorales層菌綱Hymenomycetes原毛平革菌屬Phanerochaete門綱目科屬 黃孢原毛平革菌主要分布在北半球，其無(wú)性世代也被稱為多粉側(cè)孢霉（Sporotrichum pulv

6、erulentum Novobranova）。8完整版課件ppt2-2 白腐真菌的主要種類 已知白腐真菌種類有白腐真菌主要分布于 8個(gè)菌屬革蓋菌屬Coriolus原毛平革菌屬Phanerochaete臥孔菌屬Poria層孔菌屬Fomes多孔菌屬Polyporus煙管菌屬Bjerkandera側(cè)耳屬Pleurotus栓菌屬Trametes研究較多，且表現(xiàn)出較強(qiáng)降解能力的菌種有20種污色原毛平革菌絲核菌糙皮側(cè)耳、平菇紅孔菌變色栓菌、云芝韌革菌漏斗狀側(cè)耳、鳳尾菇多孔菌毛栓菌短射脈菌裂褶菌、樹花金孢霉菌煙管菌短孢射脈菌維氏針層孔菌擬蠟菌香菇、椎茸毛革蓋菌木蹄層孔菌射脈菌9完整版課件ppt白腐真菌主要分

7、布于 8個(gè)菌屬革蓋菌屬Coriolus原毛平革3、白腐真菌的生理特點(diǎn) 白腐真菌是一個(gè)龐大的生物家族，各成員的生理特點(diǎn)會(huì)表現(xiàn)出很大的差異。 籠統(tǒng)的談白腐真菌的生理生化特征和性質(zhì)，既不現(xiàn)實(shí)，也不準(zhǔn)確。黃孢原毛平革菌 黃孢原毛平革菌具有發(fā)達(dá)的菌絲體，菌絲常為多核，少有隔膜，無(wú)鎖狀聯(lián)合。多核分生孢子常為異核，擔(dān)孢子卻是同核體。交配系統(tǒng)有同宗交配和異宗交配。 黃孢原毛平革菌的生長(zhǎng)具有營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和子實(shí)體生長(zhǎng)期。10完整版課件ppt3、白腐真菌的生理特點(diǎn) 白腐真菌是一個(gè)龐大的生 鎖狀聯(lián)合：擔(dān)子菌的次生菌絲每一個(gè)細(xì)胞都有二個(gè)核，其中一個(gè)核來(lái)自母本，一個(gè)來(lái)自父本，當(dāng)雙核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂時(shí)，在二個(gè)核之間外生一個(gè)短

8、小彎曲的分枝，核移動(dòng)，在二核之間生出一個(gè)突起如鉤狀，一個(gè)核進(jìn)入鉤，一個(gè)留在菌絲。鉤中保留一個(gè)核，一個(gè)往后移，菌絲中二個(gè)核一往前一個(gè)往后移鉤狀突起向下彎曲與細(xì)胞壁接觸溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中間有孔道），在原分支外形成一隔膜，產(chǎn)生一個(gè)新細(xì)胞雙核體，在分隔處保留一個(gè)橋形結(jié)構(gòu)。11完整版課件ppt 鎖狀聯(lián)合：擔(dān)子菌的次生菌絲每一個(gè)細(xì)胞都有二個(gè)核，其中分生孢子 無(wú)性繁殖，通過(guò)菌絲體的裂殖產(chǎn)生。擔(dān)孢子 有性繁殖，必須通過(guò)菌絲體細(xì)胞的鎖狀聯(lián)合過(guò)程。12完整版課件ppt分生孢子 擔(dān)孢子 12完整版課件ppt同宗交配和異宗交配兩條可互相交配的單核菌絲融合擔(dān)孢子一次菌絲擔(dān)孢子一次菌絲單核萌發(fā)二次菌絲雙核二次

9、菌絲擔(dān)孢子 只要同一孢子萌發(fā)的單核菌絲間的互相結(jié)合生出雙核菌絲后，就可形成子實(shí)體，這種現(xiàn)象稱為同宗交配。反之，只有異性的單核菌絲（不同孢子），才能結(jié)合成雙核菌絲，這種結(jié)合方式稱為異宗交配。13完整版課件ppt同宗交配和異宗交配兩條可互相交配的單核菌絲融合擔(dān)孢子一次菌絲3-1 白腐真菌的生長(zhǎng)與代謝特點(diǎn)（黃孢原毛平革菌）營(yíng)養(yǎng)期初生生長(zhǎng)白腐真菌繁殖期次生生長(zhǎng)停滯期對(duì)數(shù)期細(xì)菌靜止期 生長(zhǎng)是線性的，生物量顯著增加。 生長(zhǎng)基本停滯，甚至發(fā)生生物量的下降。誘因： 氮限制（nitrogen limitation, N-L） 碳限制（carbon limitation, C-L ）14完整版課件ppt3-1 白

10、腐真菌的生長(zhǎng)與代謝特點(diǎn)（黃孢原毛平革菌）營(yíng)養(yǎng)期白腐N-L在木質(zhì)素降解中的作用: 實(shí)質(zhì)上是白腐真菌在進(jìn)化過(guò)程中對(duì)環(huán)境中氮缺乏的一種生理適應(yīng)。C-L在木質(zhì)素降解中的作用: 主要是它和菌絲體質(zhì)量的減少像偶聯(lián)，從而啟動(dòng)了次生代謝。與木質(zhì)素降解有關(guān)的幾個(gè)基本概念營(yíng)養(yǎng)限制N-L和C-L木質(zhì)素的降解木質(zhì)素降解酶的合成要求木質(zhì)素降解條件Ligninolytic condition培養(yǎng)體系生理特征參與的酶木質(zhì)素降解培養(yǎng)Ligninolytic culture木質(zhì)素降解活性（木質(zhì)素降解活動(dòng)）Ligninolytic activity木質(zhì)素降解酶Ligninolytic enzyme15完整版課件pptN-L在木質(zhì)

11、素降解中的作用:與木質(zhì)素降解有關(guān)的幾個(gè)基本概念營(yíng)白腐真菌對(duì)木質(zhì)素的降解過(guò)程是一個(gè)共代謝(cometabolized)過(guò)程木質(zhì)素完成降解過(guò)程白腐真菌？+生長(zhǎng)底物Growth substrate白腐真菌共代謝的兩種方式1、某種生物將一種底物轉(zhuǎn)化，卻無(wú)法在這種底物上生長(zhǎng)，即生物體不能利用這種底物氧化所產(chǎn)生的能量去維持生長(zhǎng)。2、一些生物為了共同的效應(yīng)，共用其生物化學(xué)資源，協(xié)同作用，對(duì)化合物進(jìn)行降解。白腐真菌降解木質(zhì)素屬于何種方式？16完整版課件ppt白腐真菌對(duì)木質(zhì)素的降解過(guò)程是一個(gè)共代謝(cometaboli小結(jié) 3-1白腐真菌的生長(zhǎng)與代謝特點(diǎn)白腐真菌的生長(zhǎng)具有營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期和子實(shí)體生長(zhǎng)期。鎖狀聯(lián)合 分生

12、孢子 擔(dān)孢子 同宗交配 異宗交配營(yíng)養(yǎng)期白腐真菌生長(zhǎng)是線性的，生物量顯著增加；繁殖期（子實(shí)體體生長(zhǎng)期）生長(zhǎng)基本停滯，甚至發(fā)生生物量的下降。氮限制（N-L） 碳限制（C-L ）白腐真菌對(duì)木質(zhì)素的降解過(guò)程是一個(gè)共代謝過(guò)程共代謝的兩種方式17完整版課件ppt小結(jié) 3-1白腐真菌的生長(zhǎng)與代謝特點(diǎn)白腐真菌的生長(zhǎng)具有營(yíng)養(yǎng)生3-2 白腐真菌在培養(yǎng)中的特點(diǎn)（黃孢原毛平革菌）這里的培養(yǎng)特指實(shí)驗(yàn)室中小規(guī)模的,以研究基本規(guī)律為目的的培養(yǎng)接種物接種方式菌絲體孢子按干重或是濕重計(jì)量?jī)?yōu)點(diǎn)：能準(zhǔn)確量化 能保證碳、氮營(yíng)養(yǎng)限制應(yīng)用范圍：基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研 究初期接種方式：制備孢子懸浮液 （spore suspension, SS）

13、按培養(yǎng)基量成一定比例接入關(guān)鍵是接種物的定量18完整版課件ppt3-2 白腐真菌在培養(yǎng)中的特點(diǎn)（黃孢原毛平革菌）這里的培養(yǎng)特培養(yǎng)方式(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的一般性培養(yǎng))按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)劃分半固體培養(yǎng)體系固體培養(yǎng)體系液體培養(yǎng)體系靜置培養(yǎng)Standing culture振蕩培養(yǎng)Shaking culture19完整版課件ppt培養(yǎng)方式(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的一般性培養(yǎng))半固體培養(yǎng)體系固體培養(yǎng)體系靜置培養(yǎng)Standing culture固定臺(tái)面孢子1-2天菌絲墊或菌墊Mycelial mat條件適宜10天左右白色粉狀物孢子1、盡量采取淺層培養(yǎng)方式；2、盡量避免菌墊起褶，尤其在培養(yǎng)初期菌墊很薄的時(shí)候；3、氧氣的擴(kuò)散速度是

14、靜置培養(yǎng)時(shí)決定白腐真菌降解木質(zhì)素能力的限制性因子；20完整版課件ppt靜置培養(yǎng)固定臺(tái)面孢子1-2天菌絲墊或菌墊條件適宜白色粉狀物振蕩培養(yǎng)Shaking culture振蕩培養(yǎng)儀器孢子1-3天菌絲團(tuán)或菌團(tuán)Mycelial pellets1、菌團(tuán)的大小及數(shù)量隨接種量和轉(zhuǎn)速而變化：接種量大，菌團(tuán)大；轉(zhuǎn)速越大，菌團(tuán)越小，數(shù)目越多；（100 mL三角燒瓶40 mL培養(yǎng)液）2、一般而言，在100200r/min條件下，菌團(tuán)直徑在35mm；3、主要為細(xì)菌系統(tǒng)建立的振蕩培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)際上并不適合直接應(yīng)用于白腐真菌系統(tǒng)，主要是由于白腐真菌對(duì)振蕩所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力高度敏感；21完整版課件ppt振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)儀器孢

15、子1-3天菌絲團(tuán)或菌團(tuán)1、菌團(tuán)的大小及固體培養(yǎng)體系白腐真菌的固體培養(yǎng)主要是平板培養(yǎng)，少量進(jìn)行斜面培養(yǎng)。平板培養(yǎng)的目的： 擴(kuò)大菌的生物量或是大量獲得孢子； 鑒定菌的酶活性 或掃描菌對(duì)化學(xué)物質(zhì)的降解能力； 用于菌種的分離篩選、 誘變、馴化或是短期的保藏；斜面培養(yǎng)的目的：菌種的中、長(zhǎng)期保藏；孢子或菌絲體平板培養(yǎng)斜面培養(yǎng)數(shù)日數(shù)日氣相生長(zhǎng)氣相生長(zhǎng)菌絲層菌絲層氣生孢子氣生孢子22完整版課件ppt固體培養(yǎng)體系白腐真菌的固體培養(yǎng)主要是平板培養(yǎng)，少量進(jìn)行斜面培3-3 環(huán)境因子對(duì)白腐真菌代謝活動(dòng)的影響（黃孢原毛平革菌）白腐真菌環(huán)境因子培養(yǎng)參數(shù)的操作、調(diào)控和優(yōu)化菌的代謝或降解潛能開發(fā)利用的關(guān)鍵建立一個(gè)合理的反應(yīng)體系

16、涉及的環(huán)境因子或培養(yǎng)條件包括： 培養(yǎng)基成分； 活性添加成分； 氧； pH； 溫度23完整版課件ppt3-3 環(huán)境因子對(duì)白腐真菌代謝活動(dòng)的影響（黃孢原毛平革菌）白培養(yǎng)基成分實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)最佳碳源為葡萄糖碳源物質(zhì)香草酸鈉:支持菌的生長(zhǎng),也可支持木質(zhì)素降解;葡萄糖酸鈉:支持菌的生長(zhǎng),但是木質(zhì)素礦化程度低于甘油和琥珀酸鈉;葡萄糖酸內(nèi)酯:支持菌的生長(zhǎng),但是木質(zhì)素礦化程度低于甘油和琥珀酸鈉;甘油:可當(dāng)碳源也可能源,支持木質(zhì)素降解,是篩選菌突變體的碳源;琥珀酸鈉:可當(dāng)碳源也可能源,支持木質(zhì)素降解;葡萄糖:支持菌的生長(zhǎng),支持木質(zhì)素礦化程度高;纖維素:支持菌的生長(zhǎng),支持木質(zhì)素礦化程度極高;優(yōu)劣24完整版課件ppt培養(yǎng)

17、基成分實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)最佳碳源為葡萄糖碳源物質(zhì)香草酸鈉:支持菌的氮源物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)氮源的種類對(duì)木質(zhì)素降解的影響不大，重要的是氮源的濃度；氮豐富狀態(tài)對(duì)木質(zhì)素代謝會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響；銨類氮源會(huì)抑制一些酶的合成，產(chǎn)生“氨代謝物抑制”現(xiàn)象；維生素緩沖成分金屬成分硫胺素是白腐真菌生長(zhǎng)和木質(zhì)素代謝的必須成分；乙酸鈉、琥珀酸鈉、酒石酸鈉是三種最為常用的緩沖成分；主要功能，或作為一般的營(yíng)養(yǎng)元素，或作為酶的結(jié)構(gòu)組成和活性因子；25完整版課件ppt氮源物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)氮源的種類對(duì)木質(zhì)素降解的影響不大，重要的是氮源的活性添加成分 活性添加成分（activated additive）有利于提高或保護(hù)木質(zhì)素降解系統(tǒng)，可以提高培養(yǎng)體系的反應(yīng)性。V

18、A（藜蘆醇，3,4-二甲氧基苯甲醇） 白腐真菌本身在生長(zhǎng)過(guò)程中可以產(chǎn)生VA（次生代謝物），外源加入一定量的VA可以顯著提高木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的合成及活性。芳族化合物 起到氧化還原調(diào)節(jié)劑的作用，常見的有3,4-二甲氧基苯甲醇和3-羥基鄰氨基苯甲酸鹽。26完整版課件ppt活性添加成分 活性添加成分（activated有機(jī)酸表面活性劑 有機(jī)酸，如甘醇酸（glycolate）、乙醛酸（glyoxylate）、草酸（oxalate）等，可以促進(jìn)木質(zhì)素降解活動(dòng)。其中，草酸的作用尤其引起重視，草酸具有刺激錳過(guò)氧化物酶及調(diào)節(jié)細(xì)胞外酸堿度的功能。 白腐真菌液體培養(yǎng)體系中加入表面活性劑可以有效地保護(hù)木質(zhì)素降解酶免受

19、因機(jī)械剪切力所造成的結(jié)構(gòu)破壞或活性喪失。 最為常用的表面活性劑Tween 80（吐溫80）27完整版課件ppt有機(jī)酸表面活性劑 有機(jī)酸，如甘醇酸（glyco氧 環(huán)境中氧的濃度對(duì)白腐真菌的生理代謝及木質(zhì)素降解活動(dòng)有很大影響。但是，絕對(duì)不能簡(jiǎn)單的認(rèn)為是氧的絕對(duì)濃度問(wèn)題，起關(guān)鍵作用的是白腐真菌真正所能獲得的有效氧的多寡。pH 白腐真菌生長(zhǎng)所需的適宜pH為5.5左右，稍高于木質(zhì)素降解所要求的最佳pH 4.5。當(dāng)培養(yǎng)體系pH低于3.5或是高于4.5的情況下，會(huì)顯著抑制木質(zhì)素的降解和降解酶系統(tǒng)的工作。溫度 白腐真菌生長(zhǎng)擴(kuò)增所需的溫度范圍在2539，要求并不十分嚴(yán)格。28完整版課件ppt氧 環(huán)境中氧的濃度對(duì)

20、白腐真菌的生理代謝及木質(zhì)素降解活動(dòng)4、白腐真菌酶學(xué)簡(jiǎn)介4-1 白腐真菌主要酶種概述H2O2產(chǎn)生酶系葡萄糖氧化酶乙二醛氧化酶甲醇氧化酶VA氧化酶其他酶其他酶系過(guò)氧化物歧化酶葡糖苷酶苯丙氨酸解氨酶還原脫鹵酶系統(tǒng)醌還原酶芳烴硝基還原酶蛋白酶木質(zhì)素氧化酶系需H2O2的過(guò)氧化酶漆酶Lac木質(zhì)素過(guò)氧化物酶LiP錳過(guò)氧化物酶MnP白腐真菌木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)（ligninolytic enzyme system ）29完整版課件ppt4、白腐真菌酶學(xué)簡(jiǎn)介4-1 白腐真菌主要酶種概述H2O2產(chǎn)生H2O2產(chǎn)生酶系共同作用：以小分子有機(jī)物為底物，將分子氧化還原為H2O2。葡萄糖氧化酶 細(xì)胞內(nèi)合成分泌到細(xì)胞外環(huán)境，將糖

21、類物質(zhì)氧化還原為H2O2。乙二醛氧化酶 為細(xì)胞外的含銅氧化酶，主要以醛類物質(zhì)為底物。而醛類物質(zhì)恰好是葡萄糖氧化的中間產(chǎn)物。其他酶 參與H2O2的產(chǎn)生。主要有甲醇氧化酶，VA氧化酶等。30完整版課件pptH2O2產(chǎn)生酶系共同作用：以小分子有機(jī)物為底物，將分子氧化還漆酶（Lac）木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP） 能氧化高氧化還原電位的化合物，催化酚類、非酚類物質(zhì)氧化，參與木質(zhì)素解聚。錳過(guò)氧化物酶（MnP） 表現(xiàn)出對(duì)錳二價(jià)離子的絕對(duì)需要，氧化氧化還原電位相對(duì)低的化合物，如胺類、染料，在脫色反應(yīng)中起主要作用，參與木質(zhì)素解聚。木質(zhì)素氧化酶系需H2O2的過(guò)氧化酶含鐵的血紅蛋白胞外酶含銅多酚氧化酶（對(duì)二酚氧化酶）

22、 以單酚、二酚、二胺、多酚類化合物為底物。對(duì)非酚類物質(zhì)，特別是蒽、苯并芘，多環(huán)芳烴類作用顯著。參與木質(zhì)素的解聚和降解。31完整版課件ppt漆酶（Lac）木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）錳過(guò)氧化物酶（MnP其他酶系過(guò)氧化物歧化酶 保護(hù)白腐真菌活細(xì)胞中過(guò)氧化物自由基免遭氧化壓力；葡糖苷酶 具有糖基化的活性，在廢水脫色中起著重要作用；苯丙氨酸解氨酶 與VA的生物合成密切相關(guān)；還原脫鹵酶系統(tǒng) 能還原鹵素基團(tuán)；醌還原酶 能產(chǎn)生氫醌，對(duì)木質(zhì)素及環(huán)境污染物的降解極其重要；芳烴硝基還原酶 是硝基芳香族化合物降解的關(guān)鍵；蛋白酶 具體情況尚不明確；32完整版課件ppt其他酶系過(guò)氧化物歧化酶32完整版課件ppt木質(zhì)素過(guò)氧

23、化物酶（LiP）的分離和檢測(cè)LiP的分離4-2 主要木質(zhì)素降解酶的分離、提純和檢測(cè)方法LiP的粗制品液體培養(yǎng)細(xì)胞外液6天上清液1200018000g 離心1030分鐘去除菌絲和孢子粗酶液4保存24hDEAE樹脂4，離子交換LiP的粗制品的純化DEAE離子交換柱LiP的純化制品NaCl梯度溶液洗脫33完整版課件ppt木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）的分離和檢測(cè)LiP的分離4-2 主LiP的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法基本原理藜蘆醇（VA）藜蘆醛（VAd）LiP催化H2O2320nm無(wú)吸收強(qiáng)烈吸收反應(yīng)體系操作要點(diǎn)2mmol/L VA50mmol/L 酒石酸（pH 3.03.5）0.4mmol/L H2O2一定量的酶液

24、H2O2使用前新鮮配制；30反應(yīng)時(shí)間10分鐘；pH保持在3.03.5；使用1cm石英比色皿，各比色皿總體積差額用蒸餾水補(bǔ)足；VA使用真空蒸餾或是在醚中萃取的方法進(jìn)行純化；34完整版課件pptLiP的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法基本原理藜蘆醇（VA）藜蘆醛（VAd）L錳過(guò)氧化物酶（MnP）的純化和檢測(cè)MnP的純化菌的培養(yǎng)液用玻璃棉過(guò)濾，獲得粗過(guò)濾液超過(guò)濾法濃縮過(guò)濾物，使其濃度增加20倍用去離子水按1:1比例進(jìn)行稀釋使用DEAE陰離子交換柱吸附洗滌50mL蒸餾水20mmol/L酒石酸鈉（含0.4mol/L NaCl）洗脫蛋白質(zhì)超過(guò)濾法除鹽或濃縮冰凍干燥，-20保存所有純化步驟在4進(jìn)行，通過(guò)上述方法制備的酶制品可以

25、保存1年不失活35完整版課件ppt錳過(guò)氧化物酶（MnP）的純化和檢測(cè)MnP的純化菌的培養(yǎng)液用玻MnP的基本測(cè)定方法利用各種芳香族底物，在補(bǔ)充錳（）離子的條件下，均可進(jìn)行MnP的測(cè)定。表 用于MnP測(cè)定的底物及相關(guān)波長(zhǎng)數(shù)據(jù)底物波長(zhǎng)/nm亞香草基丙酮3362,6-二甲氧基苯酚（DMP）568丁香酸260愈創(chuàng)木酚465姜黃素430丁香醛連氮525松柏醇263鄰聯(lián)（二）茴香胺46036完整版課件pptMnP的基本測(cè)定方法利用各種芳香族底物，在補(bǔ)充錳（）離子的MnP的基本測(cè)定方法具體步驟1mL反應(yīng)混合液0.1mmol/L酒石酸鈉（pH 5.0）0.1mmol/L底物0.1mmol/L MnSO4適量的酶

26、液光程1cm、體積1.5mL石英比色皿，室溫加入0.1mmol/L H2O2以不加H2O2的反應(yīng)體系為對(duì)照；1U為每分鐘氧化1微摩爾每升底物的MnP；啟動(dòng)反應(yīng)MnP其他具有代表性的測(cè)定方法還包括ABTS氧化法，Mn()氧化法和酚紅法。37完整版課件pptMnP的基本測(cè)定方法具體步驟1mL反應(yīng)混合液0.1mmol/漆酶（Lac）的定性和定量檢測(cè)方法Lac的定性檢測(cè)方法Lac的定量檢測(cè)方法愈創(chuàng)木酚法：在含0.02%（質(zhì)量濃度）愈創(chuàng)木酚的平板上可以鑒定細(xì)胞外液中Lac的活性，Lac催化愈創(chuàng)木酚聚合形成紅棕色的區(qū)帶。1mmol/L愈創(chuàng)木酚50mmol/L乙酸鈉pH4.5適量的酶液37，5分鐘465nm

27、處測(cè)定吸光度 一個(gè)酶活單位定義為每分鐘引起波長(zhǎng)465nm處吸光度一個(gè)0.01單位變化所需的酶液量。38完整版課件ppt漆酶（Lac）的定性和定量檢測(cè)方法Lac的定性檢測(cè)方法Lac5、白腐真菌分子生物學(xué)簡(jiǎn)介黃孢原毛平革菌的分子生物學(xué)其他白腐真菌的分子生物學(xué)木質(zhì)素降解過(guò)氧化物酶的分子生物學(xué)未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)：破解各類白腐真菌基因圖譜39完整版課件ppt5、白腐真菌分子生物學(xué)簡(jiǎn)介黃孢原毛平革菌的分子生物學(xué)其他白腐6、白腐真菌的生物降解6-1 白腐真菌生物降解的特點(diǎn)非專一性nonspecific非水解性nonhydrolytic細(xì)胞外性extracellular 白腐真菌能降解各種不同的化合物，具有廣譜的底

28、物范圍。其對(duì)作用底物的結(jié)構(gòu)和類型要求是高度非特異性的。 白腐真菌在生物降解過(guò)程中并不出現(xiàn)通常的酶的水解反應(yīng)。 白腐真菌通過(guò)細(xì)胞外酶的作用對(duì)木質(zhì)素類物質(zhì)進(jìn)行氧化分解。木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特征40完整版課件ppt6、白腐真菌的生物降解6-1 白腐真菌生物降解的特點(diǎn)非專一性6-2 白腐真菌生物降解系統(tǒng)白腐真菌生物降解系統(tǒng)的概念營(yíng)養(yǎng)限制N-L和C-L木質(zhì)素的降解木質(zhì)素降解酶的合成要求木質(zhì)素降解條件Ligninolytic condition參與的組分木質(zhì)素降解系統(tǒng)Lignin degradation system, LDS白腐真菌生物降解系統(tǒng) 泛指所有白腐真菌在適宜的條件下所形成的參與生物降解活動(dòng)的組分的集合

29、。41完整版課件ppt6-2 白腐真菌生物降解系統(tǒng)白腐真菌生物降解系統(tǒng)的概念營(yíng)養(yǎng)限白腐真菌生物降解系統(tǒng)的組成酶組分小分子有機(jī)物白腐真菌生物降解系統(tǒng)產(chǎn)過(guò)氧化氫的酶過(guò)氧化物酶其他酶種VA草酸HAA3-羥基-鄰氨基苯甲酸（氨茴酸）注意：1、葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶的區(qū)別； 葡萄糖氧化酶是細(xì)胞內(nèi)酶，乙二醛氧化酶為細(xì)胞外酶 2、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶的異同點(diǎn)； 相同點(diǎn)：均在細(xì)胞內(nèi)合成，分泌到細(xì)胞外，以H2O2為最初氧化底物，觸發(fā) 酶的催化循環(huán)； 不同點(diǎn)：Lip主要催化非酚類的芳香族化合物，只與木質(zhì)素解聚有關(guān)，MnP 主要催化酚類化合物，與H2O2產(chǎn)生和木質(zhì)素解聚均相關(guān)；42完整版課件ppt白腐

30、真菌生物降解系統(tǒng)的組成酶組分小分子有機(jī)物白腐真菌生物降解白腐真菌生物降解系統(tǒng)的基本要求1、一種共底物，不能以木質(zhì)素或是其他降解底物為唯一碳源；2、底物的不可誘導(dǎo)性；3、只在次生代謝期間得以表達(dá)；4、因碳、氮、硫等的限制而觸發(fā)；5、能被一些化學(xué)物質(zhì)所強(qiáng)烈抑制；6、對(duì)微量金屬元素平衡的敏感；7、相對(duì)狹窄的酸堿度范圍；8、明顯地受氧氣濃度的影響；43完整版課件ppt白腐真菌生物降解系統(tǒng)的基本要求1、一種共底物，不能以木質(zhì)素或6-3 白腐真菌生物降解的機(jī)制木質(zhì)素的降解機(jī)制木質(zhì)素的部分結(jié)構(gòu)示意圖 木質(zhì)素是由類苯丙烷亞單位非線性隨機(jī)連接形成的天然生物聚合物。木質(zhì)素主要前體物對(duì)豆香醇 松柏醇 芥子醇愈創(chuàng)木基

31、木質(zhì)素愈創(chuàng)木基丁香基木質(zhì)素愈創(chuàng)木基丁香基對(duì)羥苯基木質(zhì)素主要存在于草本植物中主要存在于裸子植物中主要存在于木本植物中木質(zhì)素的主要種類44完整版課件ppt6-3 白腐真菌生物降解的機(jī)制木質(zhì)素的降解機(jī)制木質(zhì)素的部分結(jié)木質(zhì)素的降解過(guò)程木質(zhì)素脫甲基化羥基化芳環(huán)開裂白腐真菌細(xì)胞外酶愈創(chuàng)木基和丁香基亞單位甲氧基含量減少鄰苯二酚脂肪羧酸水解1、側(cè)鏈中：發(fā)生氧化形成羰基和羧基；2、芳環(huán)中：脫甲基化形成鄰苯二酚后發(fā)生氧化開裂；3、環(huán)裂片段進(jìn)一步被降解，釋放出脂肪類產(chǎn)物和新的酚羥基單位，然后降解；4、側(cè)鏈斷裂與芳環(huán)開裂幾乎同時(shí)發(fā)生；45完整版課件ppt木質(zhì)素的降解過(guò)程木質(zhì)素脫甲基化羥基化芳環(huán)開裂白腐真菌細(xì)胞外酶化學(xué)

32、物質(zhì)的降解機(jī)制氧化機(jī)制 包括LiP和MnP的過(guò)氧化物酶，利用H2O2促進(jìn)化學(xué)物質(zhì)發(fā)生單電子氧化形成自由基。氧化機(jī)制依賴MnP催化的氧化氧化機(jī)制類似于LiP的直接氧化，但表現(xiàn)出對(duì)Mn的絕對(duì)需要。依賴LiP的氧化直接氧化間接氧化 被氧化化學(xué)物質(zhì)不必與酶發(fā)生結(jié)合，氧化通過(guò)簡(jiǎn)單的電子傳遞而發(fā)生。主要氧化的化學(xué)物質(zhì)為PAH類、氰化物和染料。 依靠某種中介物（調(diào)節(jié)劑）相助進(jìn)行氧化。主要氧化的化學(xué)物質(zhì)為木質(zhì)素、有機(jī)酸等。46完整版課件ppt化學(xué)物質(zhì)的降解機(jī)制氧化機(jī)制氧化機(jī)制依賴MnP催化的氧化氧化機(jī)還原機(jī)制 白腐真菌對(duì)化學(xué)物質(zhì)的降解過(guò)程中還原機(jī)制存在兩種類型，一是依賴LiP的還原，一是依賴MnP的還原。脫毒

33、機(jī)制 有機(jī)化合物之所以能抵御生物降解是由于其毒性，能對(duì)生物造成毒效應(yīng)。白腐真菌對(duì)化學(xué)物質(zhì)的降解過(guò)程就涉及到其解毒機(jī)制。白腐真菌的解毒機(jī)制主要有兩種，即酚類化合物的甲基化和化學(xué)物質(zhì)依賴于細(xì)胞質(zhì)膜的還原反應(yīng)。47完整版課件ppt還原機(jī)制 白腐真菌對(duì)化學(xué)物質(zhì)的降解過(guò)程中還原機(jī)制6-4 白腐真菌生物降解的廣譜性白腐真菌種類的多樣性白腐真菌特殊的降解機(jī)制白腐真菌對(duì)廣譜的化學(xué)物質(zhì)具有敏感性和進(jìn)攻性目前白腐真菌可以有效降解的具有代表性的化學(xué)物質(zhì)大類共有16類單苯化合物 苯、甲苯、乙苯和二甲苯（分別簡(jiǎn)稱為B、T、E和X，合稱BTEX），是一類重要的有機(jī)污染物。白腐真菌對(duì)這類有機(jī)污染物質(zhì)的降解效果，從底物的敏感

34、性來(lái)排序：ETXB（乙苯甲苯二甲苯苯）48完整版課件ppt6-4 白腐真菌生物降解的廣譜性白腐真菌種類的多樣性白腐真菌氯苯 氯苯是優(yōu)先污染物，作為溶劑、脫脂劑、甜味劑和各類農(nóng)藥，染料合成的中間體被廣泛使用。白腐真菌對(duì)這類有機(jī)污染物質(zhì)的降解效果，按照降解速率來(lái)排序：?jiǎn)温缺介g二氯苯鄰二氯苯對(duì)二氯苯苯胺 主要是降解3,4-二氯苯胺（DCA）。氯酚 氯酚是污染物的大類，也是造紙廢水的主要成分。白腐真菌主要降解五氯苯酚（PCP）、單氯苯酚（CP）、二氯苯酚（DCP）和三氯苯酚（TCP）。49完整版課件ppt氯苯 氯苯是優(yōu)先污染物，作為溶劑、脫脂劑、甜味聯(lián)苯 聯(lián)苯類物質(zhì)由于疏水性和穩(wěn)定性，在環(huán)境中可以長(zhǎng)期

35、存在，對(duì)人及各種生物構(gòu)成毒性。白腐真菌主要降解多氯聯(lián)苯（PCB）和聯(lián)苯。硝基芳烴化合物 硝基芳烴化合物是合成許多工業(yè)化學(xué)物質(zhì)的重要原料。白腐真菌主要降解2,4,6-三硝基甲苯（TNT）和2,4-二硝基甲苯。雜環(huán)化合物 雜環(huán)化合物大多數(shù)屬于雌性荷爾蒙類物質(zhì)，對(duì)人體危害極大。白腐真菌主要降解噻嗯類和二惡英類。50完整版課件ppt聯(lián)苯 聯(lián)苯類物質(zhì)由于疏水性和穩(wěn)定性，在環(huán)境中氰化物 氰化物是優(yōu)先污染物，作為L(zhǎng)iP的一種底物，在H2O2存在時(shí)，能被白腐真菌迅速礦化為CO2。殺蟲劑 白腐真菌主要降解DDT和有機(jī)磷殺蟲劑。除草劑 白腐真菌主要降解2,4,5-三氯苯氧乙酸。51完整版課件ppt氰化物 氰化物是

36、優(yōu)先污染物，作為L(zhǎng)iP的一種鹵化物 白腐真菌對(duì)于有機(jī)類鹵化物具有脫鹵作用。塑料及聚合物 白腐真菌主要降解木素-聚苯乙烯接枝共聚物，聚乙烯塑料和聚酰胺。揮發(fā)性有機(jī)物 白腐真菌對(duì)9種在排放的工業(yè)廢氣中普遍存在的揮發(fā)性有機(jī)物（VOC）具有降解能力。包括芳烴類（苯、甲苯、乙苯、苯乙烯）、酮類（甲乙基酮、甲基異丁基酮、甲基丙酮）、有機(jī)酸類（乙酸丁酯、乙基-3-乙氧基-丙酸酯）。52完整版課件ppt鹵化物 白腐真菌對(duì)于有機(jī)類鹵化物具有脫鹵作用煤 主要是針對(duì)低級(jí)煤（LRC），對(duì)其進(jìn)行液化、解聚、聚合和脫色。PAH 多環(huán)芳烴（PAH）是重要的環(huán)境污染物，危害極大。白腐真菌主要降解蒽油、芘、苯并芘、蒽、菲等PA

37、H類物質(zhì)。染料 白腐真菌主要降解偶氮染料、三苯甲烷染料、聚合染料、雜環(huán)染料和靛類染料，幾乎包括了染料的所有大類。53完整版課件ppt煤 主要是針對(duì)低級(jí)煤（LRC），對(duì)其進(jìn)行液化、6-5 白腐真菌生物降解的優(yōu)點(diǎn) 白腐真菌的生物降解具有其他生物體系，尤其是細(xì)菌體系，所不具備的優(yōu)點(diǎn)，共有六大優(yōu)勢(shì)。1、不需要進(jìn)過(guò)特點(diǎn)底物的預(yù)條件化；2、動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)；3、對(duì)其他微生物的拮抗；4、細(xì)胞外的降解特征；5、降解底物的非特異性；6、適用于固液兩種體系；54完整版課件ppt6-5 白腐真菌生物降解的優(yōu)點(diǎn) 白腐真菌的生物6-6 白腐真菌生物降解的意義白腐真菌在碳素循環(huán)中的地位和作用白腐真菌是生物修復(fù)的有力工具白腐真菌

38、在物質(zhì)轉(zhuǎn)化和資源利用中的應(yīng)用分解作用光合作用有機(jī)碳微生物動(dòng)物植物死亡死亡生物圈巖石圈埋葬有機(jī)碳大氣圈/土壤圈/水圈CO2呼吸作用CO、CH2CH4沉積作用 CaCO3和MgCO3礦物染料燃燒 CO2和CO；巖石風(fēng)化 CO2碳素循環(huán)（生物和地質(zhì)循環(huán)）示意圖55完整版課件ppt6-6 白腐真菌生物降解的意義白腐真菌在碳素循環(huán)中的地位和作白腐真菌生物技術(shù)白腐真菌生物技術(shù)體系基礎(chǔ)性技術(shù)體系應(yīng)用性技術(shù)體系以白腐真菌的生長(zhǎng)繁殖、培養(yǎng)保存等為主；以白腐真菌的生活史為線索以白腐真菌的分離誘變、反應(yīng)體系的建立等為主以菌的生理生化為線索白腐真菌生物技術(shù)的特點(diǎn)： 1、復(fù)雜性：條件的復(fù)雜性以及調(diào)控和操作的復(fù)雜性； 2

39、、綜合性：生物學(xué)問(wèn)題、化學(xué)問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題的結(jié)合；56完整版課件ppt白腐真菌生物技術(shù)白腐真菌生物技術(shù)體系基礎(chǔ)性技術(shù)體系應(yīng)用性技術(shù)1、白腐真菌培養(yǎng)技術(shù)白腐真菌生長(zhǎng)及保存培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基試管培養(yǎng)基保存培養(yǎng)基生長(zhǎng)培養(yǎng)基幾點(diǎn)說(shuō)明： 培養(yǎng)基的pH值，一般保持在5.5左右； 將固體培養(yǎng)基分裝在試管里，做成斜面，主要供菌種保存用； 將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿，制作平板，主要供菌種擴(kuò)增和獲得分生孢子、菌瓊脂塊等接種物； 不加瓊脂，即配制成液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基，主要為菌種的擴(kuò)增和獲得收集菌絲體用；57完整版課件ppt1、白腐真菌培養(yǎng)技術(shù)白腐真菌生長(zhǎng)及保存培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基平板培主要培養(yǎng)基種類PDA培養(yǎng)基這是培養(yǎng)真

40、菌生長(zhǎng)的經(jīng)典固體培養(yǎng)基，全稱土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar, PDA）。配方（L-1）：200g 土豆浸出液，3g KH2PO4 ，20g 葡萄糖，20g瓊脂， 1.5g MgSO47H2O。MEA培養(yǎng)基這是以麥芽汁為主要成分的固體培養(yǎng)基，全稱麥芽瓊脂培養(yǎng)基（malt extract agar, MEA）。配方（ L-1 ）：30g 麥芽浸膏，3g 大豆蛋白胨，15g 瓊脂。MEG培養(yǎng)基配方（ L-1 ）：5g 麥芽浸膏，10g 葡萄糖，10g 瓊脂。YMPG培養(yǎng)基主要由酵母抽提物，麥芽汁，蛋白胨和葡萄糖組成。配方（L-1）：10g 麥芽汁，2g 蛋白胨，2g

41、酵母抽提物，10g 葡萄糖，20g瓊脂， 1g MgSO47H2O， 2g KH2PO4 。58完整版課件ppt主要培養(yǎng)基種類PDA培養(yǎng)基這是培養(yǎng)真菌生長(zhǎng)的經(jīng)典固體培養(yǎng)基，促進(jìn)白腐真菌生長(zhǎng)的天然成分木材、玉米芯、土豆浸出液是目前比較常用的促進(jìn)白腐真菌生長(zhǎng)的天然成分。菌種的保存菌絲塊或孢子室溫或28或35 至39 下培養(yǎng)5 7天， -20或4 保存孢子混合硅膠密封4 保存斜面保存孢子懸浮液保存孢子的硅膠保存孢子-20或4 保存無(wú)菌蒸餾水59完整版課件ppt促進(jìn)白腐真菌生長(zhǎng)的天然成分木材、玉米芯、土豆浸出液是目前比較接種物的制備孢子懸浮液的制備孢子無(wú)菌蒸餾水或0.5%（質(zhì)量濃度）的Tween80溶

42、液培養(yǎng)過(guò)濾玻璃棉稀釋孢子懸浮液孢子懸浮液濃度測(cè)定血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（濃度測(cè)定的直接方法）分光光度法（濃度測(cè)定的間接方法）孢子懸浮液制備過(guò)程示意圖60完整版課件ppt接種物的制備孢子懸浮液的制備孢子無(wú)菌蒸餾水或0.5%（質(zhì)量濃瓊脂塊 主要是那些不形成分生孢子的菌種的接種物。 方法：從生長(zhǎng)旺盛的平板邊緣，切割0.51.0cm見方的瓊脂塊。菌絲體菌絲體洗滌研磨混合1min取出液體培養(yǎng)體系液體培養(yǎng)基菌絲體懸浮液確定生物量濕重計(jì)算法干重計(jì)算法菌絲體懸浮液制備方法示意圖孢子活力的測(cè)定使用美藍(lán)染色法測(cè)定白腐真菌分生孢子的存活率。61完整版課件ppt瓊脂塊菌絲體菌絲體洗滌取出液體培養(yǎng)體系液體培養(yǎng)基菌絲體懸浮液2、

43、白腐真菌的分離技術(shù)2-1 木腐擔(dān)子菌的分離與篩選技術(shù)步驟：擔(dān)子菌篩選鑒定菌的木質(zhì)素降解能力技術(shù)核心：從自然環(huán)境的固體介質(zhì)的混合微生物群體中，將木腐或白腐 擔(dān)子菌分離篩選出來(lái)?；舅悸罚航⑦x擇培養(yǎng)基，在固體的分離培養(yǎng)基中加入一些對(duì)其他類 別微生物的抑制劑。基本步驟：擔(dān)子菌的篩選擔(dān)子菌的純化具體菌種的純化擔(dān)子菌的分離62完整版課件ppt2、白腐真菌的分離技術(shù)2-1 木腐擔(dān)子菌的分離與篩選技術(shù)步驟以黃孢原毛平革菌的分離為例擔(dān)子菌的篩選利用選擇培養(yǎng)基初步分離擔(dān)子菌類（粗篩）常用選擇培養(yǎng)基配方干燥的麥芽汁提取物 3.0g真菌蛋白胨 0.5g瓊脂 2.5g蒸餾水 100mL鄰苯基苯酚 0.006g注意點(diǎn)

44、：1、鄰苯基苯酚的濃度可以根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，最大 濃度0.01%（質(zhì)量濃度）；2、使用乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，不影響對(duì)擔(dān)子菌的篩選；優(yōu)點(diǎn)： 能從受霉菌嚴(yán)重污染的土壤及其他介質(zhì)中分離擔(dān)子菌；真菌耐藥性試驗(yàn)細(xì)篩 利用擔(dān)子菌對(duì)各類天然和合成殺真菌物質(zhì)的忍耐性，進(jìn)一步從篩選體系中去除可能殘留的細(xì)菌和放線菌。常用的殺真菌物質(zhì)為玫瑰紅（四碘四氯熒光素），一般使用濃度30mg/L。63完整版課件ppt以黃孢原毛平革菌的分離為例擔(dān)子菌的篩選利用選擇培養(yǎng)基初步分離擔(dān)子菌的純化使用苯菌靈-麥芽瓊脂培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)（純化）純化的目的：是要去除培養(yǎng)物中可能存在的其他絲孢菌類（hyphomycetes）；

45、苯菌靈母液的配制：1g的50%苯菌靈粉末，加到500mL的蒸餾水中；一般使用濃度與方法：將母液按照1mg/L的濃度加入2%（質(zhì)量濃度）的麥芽瓊脂培養(yǎng)基中；擔(dān)子菌的分離以Poly R-478為指示劑分離能降解木質(zhì)素的菌種（分離）常用分離培養(yǎng)基配方大麻莖木 0.2%（質(zhì)量濃度）瓊脂 1.5 %（質(zhì)量濃度）苯菌靈 15mg/L愈創(chuàng)木酚 0.01 %（質(zhì)量濃度）分離使用0.02%（質(zhì)量濃度）含Poly R-478（聚合染料）的平板麥芽瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)分離菌種檢定使愈創(chuàng)木酚變成褐色的菌為目標(biāo)菌種 使含Poly R-478的平板麥芽瓊脂培養(yǎng)基脫色即可確認(rèn)分離成功64完整版課件ppt擔(dān)子菌的純化使用苯菌靈-麥

46、芽瓊脂培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)具體菌種的純化 根據(jù)需要篩選的特定菌種類型，使用與之匹配的選擇性分離培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)物反復(fù)多次培養(yǎng)，直至獲得目標(biāo)純菌種，然后采用16sRNA檢測(cè)鑒定。問(wèn)題假設(shè)已經(jīng)獲得某種白腐真菌的子實(shí)體，可以采取何種方法分離出純菌種？培養(yǎng)各類真菌子實(shí)體切割獲取子實(shí)體塊PDA培養(yǎng)基植入獲得菌絲體菌絲體純培養(yǎng)65完整版課件ppt具體菌種的純化 根據(jù)需要篩選的特定菌種類型，使2-2 具有降解異生物質(zhì)能力的白腐真菌的篩選篩選的必要性 白腐真菌對(duì)異生物質(zhì)的降解長(zhǎng)期以來(lái)集中在黃孢原毛平革菌，但是在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中其木質(zhì)素降解條件很難得到滿足。因此，篩選能在較寬泛環(huán)境條件下降解異生物質(zhì)的白腐真

47、菌對(duì)于應(yīng)用技術(shù)的開發(fā)具有重要意義。篩選的基本策略 理想的篩選方法，既要便宜，建立在相對(duì)無(wú)毒的底物基礎(chǔ)上，不依賴于煩瑣的分析之上，同時(shí)它應(yīng)該與木質(zhì)素降解酶所調(diào)節(jié)的異生物質(zhì)的降解有高度的相對(duì)應(yīng)性。利用聚合染料的篩選程序（常用）指示染料的選擇選擇培養(yǎng)基異生物質(zhì)的降解與染料脫色相關(guān)性判斷66完整版課件ppt2-2 具有降解異生物質(zhì)能力的白腐真菌的篩選篩選的必要性 2-3 白腐真菌木質(zhì)素降解性能的鑒定白腐真菌木質(zhì)素降解酶的平板定性方法一Poly R-478指示細(xì)胞外氧化酶 在平板上補(bǔ)充0.02%（質(zhì)量濃度） Poly R-478，用于檢測(cè)細(xì)胞外氧化酶。現(xiàn)象：平板脫色方法二平板系統(tǒng)定性測(cè)試木質(zhì)素降解酶加入

48、250mg/L的ABTS，菌絲周圍形成黑綠色環(huán)，指示Lac和過(guò)氧化物酶存在加入0.1g/L的MnCl24H2O，平板上形成黑棕色斑點(diǎn)，指示MnP的合成平板測(cè)試系統(tǒng)agar-plate test system25g/L瓊脂35mL接種直徑10mm的瓊脂菌絲塊ABTS-平板Mn-平板腐殖酸-平板加入1g/L的煤腐殖酸，平板上發(fā)生漂白反應(yīng)，指示木質(zhì)素降解酶的系統(tǒng)的存在67完整版課件ppt2-3 白腐真菌木質(zhì)素降解性能的鑒定白腐真菌木質(zhì)素降解酶的白腐真菌木質(zhì)素降解能力的平板鑒定這是一種快速評(píng)價(jià)白腐真菌木質(zhì)素降解能力的平板方法。經(jīng)典培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基去除土豆濾液基本瓊脂培養(yǎng)基BAM培養(yǎng)基ABTS-瓊脂培

49、養(yǎng)基SYR-瓊脂培養(yǎng)基Mn-瓊脂培養(yǎng)基加入100mg/L的ABTS加入100mg/L的MnCl24H2O加入100mg/L的丁香連氮（吖嗪）加入10mL的各培養(yǎng)基，并植入5mm的瓊脂菌絲塊，每23日檢測(cè)色變區(qū)和菌的放射性生長(zhǎng)菌絲周圍形成深綠色1周后在菌絲周圍積累紫色醌類物2周后形成黑棕色的MnO2條紋68完整版課件ppt白腐真菌木質(zhì)素降解能力的平板鑒定這是一種快速評(píng)價(jià)白腐真菌木質(zhì)3、白腐真菌反應(yīng)體系的建立白腐真菌反應(yīng)體系的種類平板反應(yīng)體系液體反應(yīng)體系靜置反應(yīng)體系搖床反應(yīng)體系主要用于酶和降解的定性研究 主要用于酶學(xué)研究和降解反應(yīng)的定性定量研究69完整版課件ppt3、白腐真菌反應(yīng)體系的建立白腐真菌

50、反應(yīng)體系的種類平板反應(yīng)體系建立白腐真菌反應(yīng)體系需要考慮的基本因素（6大因素）培養(yǎng)基經(jīng)典培養(yǎng)基的組成（L-1）0.2g KH2PO40.05g MgSO47H2O0.01g CaCl21mL 無(wú)機(jī)溶液0.5mL 維生素溶液1.2mmoL 酒石酸銨（氮源）56mmoL 葡萄糖（碳源）20mmoL DMS（緩沖成分）pH 4.5維生素溶液（ L-1 ）2mg 生物素2mg 葉酸5mg 維生素B15mg 煙酸5mg 維生素B210mg 維生素B6鹽酸鹽0.1mg 維生素B125mg DL-泛酸鈣5mg 對(duì)氨基苯甲酸5mg 硫辛酸無(wú)機(jī)溶液（ L-1 ）1.5g 氨基三乙酸酯3g MgSO47H2O0.5

51、g MnSO41g NaCl2100mg FeSO47H2O100mg CoSO482mg CaCl2100mg ZnSO4100mg CuSO45H2O10mg AlK(SO4)210mg H3BO310mg NaMoO4 為防止培養(yǎng)基的微生物污染可以考慮在培養(yǎng)基分裝前或是培養(yǎng)5天后加入20U/mL青霉素或是2mg/mL鏈霉素，不會(huì)影響木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生。70完整版課件ppt建立白腐真菌反應(yīng)體系需要考慮的基本因素（6大因素）培養(yǎng)基經(jīng)典活性成分反應(yīng)溫度底物加入時(shí)間接種方式及接種量VA 主要提高LiP的產(chǎn)量和活性；Mn() 主要提高M(jìn)nP的產(chǎn)量和活性；Cu ()和小分子芳烴化合物主主要提高L

52、ac的產(chǎn)量和活性；表面活性劑 保護(hù)酶的活性，提高對(duì)降解底物的利用性；主要有兩種反應(yīng)溫度，28 以上39 以下和25 以上28 以下；一般選擇在接種以后的第6天，防止底物毒性抑制孢子的萌發(fā)，菌絲體的生長(zhǎng)以及酶的合成及活性等；選擇孢子懸浮液或是菌絲塊，嚴(yán)格按照一定比例定量添加；71完整版課件ppt活性成分反應(yīng)溫度底物加入時(shí)間接種方式及接種量VA 主要提高L供氧供氧方式（主要針對(duì)液體反應(yīng)體系）人工通氣自然地復(fù)氧作用用通氣裝置或通氣管，直接將空氣或純氧導(dǎo)入反應(yīng)體系。一般間隔3天進(jìn)行氧的補(bǔ)充。培養(yǎng)體系自身與環(huán)境進(jìn)行氣體的交換和氧氣的補(bǔ)充。靜置培養(yǎng)搖床培養(yǎng)采用淺層培養(yǎng)的方式。三角燒瓶裝液量一般規(guī)律：10m

53、L/125mL, 20mL/250mL, 50mL/500mL。搖床轉(zhuǎn)速一般為100200r/min。優(yōu)點(diǎn)：加大了氧氣的傳輸和傳質(zhì)效率；缺點(diǎn)：機(jī)械剪切力破壞酶結(jié)構(gòu)與活性；解決途徑：一是加入表面活性劑，二是將孢子、菌絲體 或酶固定化；72完整版課件ppt供氧供氧方式人工通氣自然地復(fù)氧作用用通氣裝置或通氣管，直接將4、白腐真菌的固定化（immobilizayion）技術(shù)白腐真菌固定化技術(shù)的類型共固定吸附法包埋法瓊脂糖和瓊脂小珠海藻酸鈣小珠K-卡拉膠顆粒明膠包埋小塊PVA包埋法多孔的聚合物聚氨酯泡沫小塊多孔的聚氨酯顆粒植物纖維編織繩多孔陶瓷載體燒結(jié)玻璃載體73完整版課件ppt4、白腐真菌的固定化（i

54、mmobilizayion）技術(shù)白腐瓊脂糖和瓊脂小珠包埋法細(xì)胞或酶的包埋是生物固定化中最常用的方法。基本原理是將生物材料包裹和埋藏在水不溶性的凝膠聚合物的網(wǎng)絡(luò)骨架中。用于包埋的凝膠聚合物，分為天然的高分子多糖類物質(zhì)和合成的高分子化合物兩大類。將白腐真菌的孢子包埋于瓊脂糖膠和瓊脂膠小珠內(nèi)，制備方法如下：孢子懸浮液的制備要求孢子濃度達(dá)到107數(shù)量級(jí)每毫升配制2.5%（質(zhì)量濃度）的瓊脂糖或瓊脂水溶液滅菌20分鐘冷卻至451000mL瓊脂糖或瓊脂水溶液加入1mL混合已滅菌并冷卻至45的葵花油45g加入混合浸入冰水冷卻，繼續(xù)混合30分鐘無(wú)菌水洗滌至無(wú)油74完整版課件ppt瓊脂糖和瓊脂小珠包埋法細(xì)胞或酶的

55、包埋是生物固定化中最常用的方海藻酸鈣小珠方法一2g 海藻酸鈉溶解60mL蒸餾水海藻酸鈉水溶液108，10分鐘150mg干重的鮮菌團(tuán)過(guò)濾、研磨40mL蒸餾水（無(wú)菌）菌的細(xì)胞懸浮液2%（質(zhì)量濃度）海藻酸鹽溶液2%（質(zhì)量濃度）CaCl2溶液50mL滴入2h硬化海藻酸鈣小珠多次洗滌75完整版課件ppt海藻酸鈣小珠方法一2g 海藻酸鈉溶解60mL蒸餾水海藻酸鈉水方法二2g 瓊脂和0.75g海藻酸鈉溶解60mL蒸餾水海藻酸鈉水溶液108，10分鐘150mg干重的鮮菌團(tuán)過(guò)濾、研磨40mL蒸餾水（無(wú)菌）菌的細(xì)胞懸浮液2%（質(zhì)量濃度）海藻酸鹽溶液2.5%（質(zhì)量濃度）CaCl2溶液50mL10mL針筒，滴入海藻酸

56、鈣小珠多次洗滌形成小珠轉(zhuǎn)入磷酸緩沖溶液1.460%K2HPO40.226%KH2PO476完整版課件ppt方法二2g 瓊脂和0.75g海藻酸鈉溶解60mL蒸餾水海藻酸K-卡拉膠顆粒2g K-卡拉膠溶解60mL蒸餾水海藻酸鈉水溶液108，10分鐘150mg干重的鮮菌團(tuán)過(guò)濾、研磨40mL蒸餾水（無(wú)菌）菌的細(xì)胞懸浮液2%（質(zhì)量濃度）海藻酸鹽溶液2%（質(zhì)量濃度）KCl溶液50mL滴入2h硬化K-卡拉膠小珠多次洗滌K-卡拉膠顆粒常規(guī)制備方法條件優(yōu)化與改進(jìn)： 以生理鹽水為溶劑，卡拉膠濃度為3%（質(zhì)量濃度），常規(guī)菌量的1/2，在2%（質(zhì)量濃度）的KCl溶液中交聯(lián)2h，切成小塊。77完整版課件pptK-卡拉膠

57、顆粒2g K-卡拉膠溶解60mL蒸餾水海藻酸鈉水溶明膠包埋小塊含6.25g干重細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液25mL10mL的20%（質(zhì)量濃度）明膠10mL的1.875%（質(zhì)量濃度）海藻酸鈉40混合冷卻至5軟膠硬膠浸入40g/L CaCl2切割2mm明膠小塊0.05mol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.6）洗滌，使海藻酸鈣-明膠復(fù)合物中海藻酸鹽漏出，直至洗滌干凈海藻酸鈣-明膠復(fù)合物使用0.01mol/L的戊二醛（0.05mol/L磷酸鉀緩沖液）對(duì)多孔團(tuán)塊進(jìn)行交聯(lián)1h（ pH7.6 ）無(wú)菌蒸餾水洗滌78完整版課件ppt明膠包埋小塊含6.25g干重細(xì)胞的10mL的20%（質(zhì)量10PVA包埋法PVA，聚乙烯醇，相對(duì)分子

58、質(zhì)量7700079000，為人工合成的高分子化合物。PVA包埋最常用的是PVA-硼酸法濃縮的孢子（菌體）懸浮液含13% PVA和0.02%海藻酸鈉（質(zhì)量濃度）水溶液，60冷卻至35混合，滴入含有2%CaCl2的飽和硼酸中在溶液中硬化24小時(shí)無(wú)菌蒸餾水洗滌直徑3mm的PVA固定化小珠（約10%PVA，約10%活菌體細(xì)胞或孢子）79完整版課件pptPVA包埋法PVA，聚乙烯醇，相對(duì)分子質(zhì)量77000790白腐真菌包埋技術(shù)初探環(huán)本053 姚晶晶80完整版課件ppt白腐真菌包埋技術(shù)初探環(huán)本053 姚晶晶80完整版課研究背景白腐真菌處理有機(jī)固體廢物時(shí)存在問(wèn)題，即 降解效率低 ，產(chǎn)生機(jī)械剪切力白腐真菌包埋

59、技術(shù)能解決問(wèn)題，防止機(jī)械剪 切力的產(chǎn)生81完整版課件ppt研究背景白腐真菌處理有機(jī)固體廢物時(shí)存在問(wèn)題，即81完整版目的 通過(guò)對(duì)白腐真菌菌劑的復(fù)活率、保存效果和制備成本的比較來(lái)選擇制備白腐真菌菌劑的優(yōu)勢(shì)載體。 為白腐真菌處理有機(jī)固體廢物時(shí)減少雜菌感染率,尋求一種最佳的白腐真菌包埋手段。 82完整版課件ppt目的 通過(guò)對(duì)白腐真菌菌劑的復(fù)活率、保存效果和制實(shí)驗(yàn)用微生物菌種香菇（Lentinus edodes）： 購(gòu)自浙江省慶元縣食用菌科研中心黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）： 購(gòu)自中科院微生物菌種保藏中心鳳尾菇（Pleurotus pulmononanus）：

60、 購(gòu)自浙江省慶元縣食用菌科研中心平菇 （Pleurotus ostreatus）： 購(gòu)自浙江省慶元縣食用菌科研中心83完整版課件ppt實(shí)驗(yàn)用微生物菌種83完整版課件ppt純培養(yǎng)的白腐真菌菌絲體84完整版課件ppt純培養(yǎng)的白腐真菌菌絲體84完整版課件ppt85完整版課件ppt85完整版課件ppt結(jié)果及分析白腐真菌菌劑的感觀 四種白腐真菌菌劑的外觀形態(tài) PVA包埋小珠色澤透明、彈性度強(qiáng)是最優(yōu)選菌劑，K卡拉膠包埋小珠濕度較大處于劣勢(shì)地位。86完整版課件ppt結(jié)果及分析白腐真菌菌劑的感觀 四種白腐真菌菌劑白腐真菌菌劑菌絲體的生長(zhǎng)狀況黃孢原毛平革菌 用PVA對(duì)黃孢原毛平革菌進(jìn)行包埋在本次實(shí)驗(yàn)中復(fù)活率最快