NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)課件

1、NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè) -乳酸脫氫酶釋放法1NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè) -乳酸脫氫酶釋放目的要求熟悉乳酸脫氫酶釋放法測(cè)定NK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)方法。2目的要求熟悉乳酸脫氫酶釋放法測(cè)定NK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)方法?！驹怼?乳酸脫氫酶 (LDH) 是活細(xì)胞胞漿內(nèi)含酶之一。正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)靶細(xì)胞受到效應(yīng)細(xì)胞的攻擊而損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質(zhì)中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶(NAD+) 變成還原型輔酶(NADH2)。后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽 (PMS) 還原硝基氯化四氮唑藍(lán)(NBT)，形成有色的甲臢類化合物，在490nm或570nm

2、波長處有一高吸收峰。利用讀取的A值，經(jīng)過計(jì)算即可得知NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的活性。3【原理】 乳酸脫氫酶 (LDH) 是活細(xì)胞胞漿內(nèi)實(shí)驗(yàn)原理 效應(yīng)細(xì)胞 靶細(xì)胞 釋放LDH 丙酮酸乳酸乳酸脫氫酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT 甲臢(OD570nm）吩嗪二甲酯硫酸鹽硝基氯化四氮唑藍(lán)4實(shí)驗(yàn)原理 效應(yīng)細(xì)胞 靶細(xì)胞 【試劑】1. 靶細(xì)胞 檢測(cè)人的NK 細(xì)胞活性常用的靶細(xì)胞為體 外傳代細(xì)胞株K562。2. 效應(yīng)細(xì)胞 從人外周血（肝素抗凝）分離的單個(gè)核 細(xì)胞。3. 1640 培養(yǎng)液4. LDH 底物溶液（臨用前配制） NBT 硝基氯化四氮唑藍(lán) 4mg NAD+I 氧化型輔酶I 10mg PMS 吩

3、嗪二甲酯硫酸鹽 1mg5【試劑】1. 靶細(xì)胞 檢測(cè)人的NK 細(xì)胞活性常用的靶細(xì)胞為【試劑】 加蒸餾水2ml 溶解，混勻后取上清液1.6ml，加1mol/L 乳酸鈉0.4ml，然后加入0.1mol/L pH7.4 PBS 至10ml。5. 1% NP40 ： 取1ml NP-40 加去離子水99ml。6. 1mol/L 檸檬酸終止液 取檸檬酸21g 加去離子水100ml6【試劑】 加蒸餾水2ml 溶解，混勻后取上清實(shí)驗(yàn)步驟效應(yīng)細(xì)胞的制備（分離外周血單個(gè)核細(xì)胞）靶細(xì)胞的制備效-靶細(xì)胞相互作用酶促反應(yīng)結(jié)果判讀7實(shí)驗(yàn)步驟效應(yīng)細(xì)胞的制備（分離外周血單個(gè)核細(xì)胞）靶細(xì)胞的制備效 取培養(yǎng)2448hr的靶細(xì)胞(

4、K562), 洗滌3次（1000rpm10min）, 最后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1105/ml, 備用。靶細(xì)胞的制備：8 取培養(yǎng)2448hr的靶細(xì)胞(K562), 效應(yīng)細(xì)胞的制備（分離外周血單個(gè)核細(xì)胞）采集靜脈血4 ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝分別吸取2ml淋巴細(xì)胞分層液置10ml離心管中，將管傾斜45，沿管壁緩緩注入抗凝血離心2000rpm20min9效應(yīng)細(xì)胞的制備采集靜脈血4 ml，加0.2ml肝素溶液（12密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞亞群10密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞亞群10用完全RPMI-1640定容細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度（加入0.2ml完

5、全RPMI-1640 ，混勻，1x 107）將所得PBMC用5倍體積的1640洗滌一次2000rpm10 min用毛細(xì)吸管輕輕吸去上層的血漿、稀釋液及血小板，再用另一支毛細(xì)吸管仔細(xì)吸取單個(gè)核細(xì)胞（灰白色層）11用完全RPMI-1640定容細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度將所得P計(jì)數(shù)PBMC1.計(jì)數(shù)4個(gè)大方格中（即64個(gè)小方格）所有細(xì)胞數(shù)2.計(jì)數(shù)原則：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。3.總數(shù)除以4，所得數(shù)據(jù)104即為1ml液體中的細(xì)胞總數(shù)4.每ml健康成人血可分離出11062106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞 12計(jì)數(shù)PBMC1.計(jì)數(shù)4個(gè)大方格中（即64個(gè)小方格）所有細(xì)胞數(shù)1313計(jì)數(shù)PBMC舉例數(shù)4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)分別為：87

6、，79，91，85總數(shù)為： 87+79+91+85=342一個(gè)大方格的平均數(shù)為：342/4=85.51ml液體中細(xì)胞量為：85.5104如果用染液稀釋后計(jì)數(shù)，則細(xì)胞數(shù)為該數(shù)據(jù)的2倍。14計(jì)數(shù)PBMC舉例數(shù)4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)分別為：87，79，91，效-靶細(xì)胞作用 將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中, 每份標(biāo)本設(shè)2個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照組 (0.1ml靶細(xì)胞+0.1ml RPMI-1640液)最大釋放對(duì)照組 (0.1ml靶細(xì)胞+0.1ml1NP-40液), 1000r/min, 2min后, 置37、5CO2溫箱中孵育2-4h。15效-靶細(xì)胞作

7、用 將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各0.1ml(E/T=A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 實(shí)驗(yàn)組 自然釋放組 最大釋放組 1 2 3 4 5 6 效應(yīng)細(xì)胞（100l） + + - - - -靶細(xì)胞（100l） + + + + + +RPMI1640 （100l） - - + + - - 1%NP-40 （100l） - - - - + + 16A 1 2 3 4 5【操作方法】酶促反應(yīng) ：從37溫箱中取出培養(yǎng)物，吸取各孔上清0.1ml 加于另一培養(yǎng)板孔中。17【操作方法】酶促反應(yīng) ：從37溫箱中取出培養(yǎng)物，吸取各孔上酶促反應(yīng)置37預(yù)溫10min, 加入新鮮配制的底物溶液0.1ml,

8、 37避光反應(yīng)1015min。終止酶促反應(yīng)（用毛細(xì)吸管滴一滴1mol/L檸檬酸30l）A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1218酶促反應(yīng)置37預(yù)溫10min, A 1 2 結(jié)果計(jì)算 用酶標(biāo)檢測(cè)儀在570nm波長下讀取各孔OD值, 并計(jì)算NK細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)組OD值-自然釋放對(duì)照組OD值NK細(xì)胞活性（%）最大釋放對(duì)照組OD值-自然釋放對(duì)照組OD值=100%19結(jié)果計(jì)算 用酶標(biāo)檢測(cè)儀在570nm波長下讀取各孔OD值1、無論采用何種試驗(yàn)方法, 靶細(xì)胞的質(zhì)量是影響細(xì) 胞標(biāo)記率、自然釋放率及實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的重要因 素。一般要求靶細(xì)胞的自然釋放率10。2、分離PBMC時(shí)，應(yīng)用毛細(xì)吸管盡可能吸取

9、灰白 層，切勿攪動(dòng)各層。3、吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清時(shí), 應(yīng)盡可能不吸動(dòng)沉淀的細(xì) 胞。4、用此法測(cè)得NK活性的正常值范圍在10-40%。注意事項(xiàng):201、無論采用何種試驗(yàn)方法, 靶細(xì)胞的質(zhì)量是影響細(xì)注意事項(xiàng):2實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的原理、方法、 結(jié)果。21實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的原理、方法、21 T淋巴細(xì)胞檢查1T細(xì)胞檢查（1）T細(xì)胞花環(huán)形成試驗(yàn) （Erythrocyte rosette formation test, ERFT）22 T淋巴細(xì)胞檢查1T細(xì)胞檢查22E花環(huán)形成試驗(yàn)（Erythrocyte rosette formation test, ERFT）【目的要求】1.掌握T淋巴

10、細(xì)胞E花環(huán)試驗(yàn)的原理、正常值， 了解其方法和用途。2.熟悉光鏡下E花環(huán)的形態(tài)和計(jì)數(shù)方法。23E花環(huán)形成試驗(yàn)23【實(shí)驗(yàn)原理】 T細(xì)胞表面具有能與綿羊紅細(xì)胞（SRBC）表面糖肽結(jié)合的受體，稱為E受體（CD2）。已證實(shí)E受體是人類T細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志。當(dāng)T細(xì)胞與SRBC混合后，SRBC便粘附于T細(xì)胞表面，呈現(xiàn)花環(huán)狀。通過花環(huán)形成檢查T細(xì)胞的方法，稱為E花環(huán)形成試驗(yàn)。24【實(shí)驗(yàn)原理】24根據(jù)花環(huán)形成的多少，可測(cè)知T細(xì)胞的數(shù)目，從而間接了解機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，判斷疾病的預(yù)后，考核藥物療效等。25根據(jù)花環(huán)形成的多少，可測(cè)知T細(xì)胞的數(shù)目，從而間接了解機(jī)體細(xì)胞2626 【實(shí)驗(yàn)方法】淋巴細(xì)胞與SRBC按一定比例(1:10)混合 37 5分鐘， 420分鐘 取樣涂片瑞氏染色、鏡檢。 計(jì)數(shù)E花環(huán)數(shù)，算出總花環(huán)形成率。 正常值為60%80%。 27 【實(shí)驗(yàn)方法】27 【結(jié)果觀察】高倍鏡檢查：淋巴細(xì)胞呈藍(lán)色，SRBC呈紅色圍繞淋巴細(xì)胞形成花環(huán)