蝮蛇蛇毒中提取的一種具有激肽原酶活性的蛋白水解酶

1、蝮蛇蛇毒中提取的一種具有激肽原酶活性的卵白水解酶摘要】目的:從蛇毒中得到大量高純度的具有激肽原酶活性的卵白水解酶。要領(lǐng):接納離子互換和親和層析技能舉行純化。效果:從江浙蝮蛇毒中提取出了一種高純度的具有激肽原酶活性的卵白水解酶,不需活化即可水解激肽原,開釋激肽,并具有精氨酸酯酶活性。粗毒經(jīng)提純,比活可達(dá)800u/g以上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物泉源的激肽原酶,純度可達(dá)95%以上。對(duì)其性子觀察,r為38000,n-末了的15個(gè)氨基酸序列闡發(fā)表白,該酶與蛇毒絲氨酸卵白酶及胰卵白酶激肽開釋酶同源。結(jié)論:這種要領(lǐng)得當(dāng)于產(chǎn)業(yè)化消費(fèi)?！娟P(guān)鍵詞】江浙蝮蛇蛇毒激肽原酶自從有人在美洲鋒芒蝮蛇(bthrpsjararaa)

2、蛇毒中創(chuàng)造激肽原酶后,蛇毒激肽原酶越來(lái)越受到寬大學(xué)者的器重1。我國(guó)蛇類資源富厚,但受提純工藝的限定,至今仍未開拓出蛇毒激肽原酶的藥物制劑。我們接納離子互換和親和層析技能,從江浙蝮蛇agkistrdnhalyspallas蛇毒中提取了高純度的激肽原酶,并對(duì)其性子舉行了研究。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料江浙蝮蛇蛇毒凍干粉遼寧省清源縣,deae-sepharse,瓊脂糖凝膠瑞典pharaia公司,苯甲酰精氨酸乙酯baee,對(duì)甲苯磺酰精氨酸甲酯tae,尺度卵白,激肽原,激肽等底物siga公司,低壓型高效液相色譜儀日本島津公司,8823b紫外檢測(cè)儀北京賓達(dá)英創(chuàng)科技,balb/小鼠7周齡由中國(guó)藥品生物成品檢定所

3、實(shí)行動(dòng)物中央提供。1.2要領(lǐng)2效果2.1蛇毒激肽原酶的分散純化蝮蛇毒經(jīng)deae-sepharse陰離子互換層析,親和層析,可將雜質(zhì)卵白撤除,得到的樣品經(jīng)hpl查驗(yàn),純度可達(dá)95%以上。圖1deae-sepharse離子互換色譜圖略透過(guò)峰事后,梯度洗脫得到5個(gè)峰,經(jīng)定性檢測(cè)3,4號(hào)峰為活性峰.圖2蛇毒激肽原酶親和色譜圖略1:平衡液洗脫透過(guò)峰;2:為親和洗脫液洗脫所得活性峰.圖3激肽原酶純度查驗(yàn)圖譜略色譜條件:tsk-2000凝膠柱,280n檢測(cè),流速1.0l/in,0.5l/l磷酸鹽緩沖液ph7.0為活動(dòng)相,對(duì)峰面積積分,主峰面積達(dá)95%以上.圖4激肽原酶sds聚丙烯酰胺電泳圖譜略:分子量尺度品

4、;s:蛇毒激肽原酶樣品.2.2活性測(cè)定與粗毒比擬,提純高的激肽原酶比活進(jìn)步了約300倍,活力接納率可達(dá)60%以上,水解baee的比活可到達(dá)800/g以上,水解tae活性較低,約是水解baee活性的5%。2.3理化性子經(jīng)sds聚丙烯酰胺電泳及hpl要領(lǐng)檢測(cè),江浙蝮蛇毒激肽原酶的r約為38000,與構(gòu)造型激肽原酶相似。2.4江浙蝮蛇毒激肽原酶與其他蛇毒絲氨酸卵白酶、哺乳動(dòng)物胰卵白酶n末了氨基酸序列4比力蛇毒激肽原酶與其他它絲氨酸卵白酶具有同源性,屬絲氨酸卵白酶的一種,且與哺乳動(dòng)物的胰卵白酶激肽開釋酶具有同源性。表1江浙蝮蛇毒激肽原酶與其他蛇毒絲氨酸卵白酶、哺乳動(dòng)物胰卵白酶n末了氨基酸序列比力略3討

5、論激肽原酶在體內(nèi)有緊張的生理成效5,如今臨床普及用于原性高血壓、心絞痛、動(dòng)脈硬化、視網(wǎng)膜血流停滯、肢端知覺非常,閉塞性血栓性血管炎等疾病的治療。但由于以往從哺乳動(dòng)物的胰腺提取的胰激肽原酶純度不高,具有必然的抗原性,進(jìn)入人體后,大概誘發(fā)過(guò)敏抗原抗體反響,已有報(bào)導(dǎo)注射胰激肽原酶導(dǎo)致結(jié)實(shí)性藥疹6及重癥多形紅斑藥疹7,且不克不及實(shí)現(xiàn)靜脈給藥,使藥物不克不及最大限度發(fā)揮效用。比年的提取工藝雖可得到高純度激肽原酶,但在提取歷程中,酶活力喪失較大,接納率低,難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化消費(fèi),因此探求高純度且無(wú)抗原性的激肽原酶并創(chuàng)立一套得當(dāng)產(chǎn)業(yè)范圍化消費(fèi)的工藝要領(lǐng)是如今面對(duì)的新課題。我們?cè)趥鹘y(tǒng)提取工藝的底子上,用離子互換,

6、親和層析兩步即可制備高純度的蛇毒激肽原酶,該要領(lǐng)裝備簡(jiǎn)樸,條件暖和,產(chǎn)物接納率高,產(chǎn)量大,完全切合產(chǎn)業(yè)化消費(fèi)的要求,彌補(bǔ)了蛇毒激肽原酶消費(fèi)工藝上的一項(xiàng)空缺。與哺乳動(dòng)物泉源的激肽原酶比擬,從江浙蝮蛇毒中提取的激肽原酶有如下特點(diǎn):比活高800u/g,r小約為38000,等活力單元給藥卵白含量低,不易引起過(guò)敏反響;純度高,提純后純度可達(dá)95%以上。假設(shè)用于藥物,大大進(jìn)步了藥物的寧?kù)o性;無(wú)病毒隱患。不攜帶大概同人類配合熏染的病毒。無(wú)酶原情勢(shì),不需活化即可開釋激肽,可直接發(fā)揮作用。該蛇毒激肽原酶最適ph值為7.08.0,且在ph4.09.0范疇內(nèi),活力根本保持穩(wěn)定,有利于在人血漿情況中保持其活性。該酶在

7、30以下活力根本穩(wěn)定,而在凍干狀態(tài)下,37安排90d,活力落落在5%以內(nèi),經(jīng)試驗(yàn),在整個(gè)凍干制劑消費(fèi)歷程中,酶活力的喪失率均在10%以內(nèi),因此可以消費(fèi)出相對(duì)穩(wěn)定的制劑產(chǎn)物。n-末了的氨基酸測(cè)序效果表白,蛇毒激肽原酶與其他它絲氨酸卵白酶同源,屬絲氨酸卵白酶的一種,大概也具備大多數(shù)蛇毒絲氨酸卵白酶的特性具有較長(zhǎng)的生理半衰期,大概成為臨床用藥;同時(shí),它與哺乳動(dòng)物的胰卵白酶激肽開釋酶具有同源性,可以部門說(shuō)明其與構(gòu)造激肽原酶的相似性。蛇毒激肽原酶具有一樣平常卵白酶的性子,不是金屬酶,而zn2+、2+對(duì)酶活性的影響的機(jī)制大概與改變其構(gòu)象有關(guān),有待進(jìn)一步證實(shí)?？傊?我們從蛇毒提取的激肽原酶將為藥學(xué)范疇提供一

8、條新的途徑,應(yīng)用于藥物必將帶到臨床新的治療要領(lǐng)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1yusefg,diaandisep.anverviefthekallikreingenefailiesinhuansandtherspeies:eergingandidatetuurarkersj.linbihe,2022,36(6):443-452.2王心民,戚正武.浙江蝮蛇agkistrdnhalyspallas蛇毒激肽開釋酶i的分散純化及其性子的研究j.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào),1984,161:15-25.3韋傳寶,陳建智.蛇毒卵白組分的斷定j.中國(guó)毒蛇學(xué),1995:370.4angy,angsr,tsaiih.serineprteaseisfrsfdeinagkistrdnautusven:lning,sequeningandphylgenetianalysisj.bihej,2001,(354):161-168.5華慧,周思翔,王正榮.構(gòu)造激肽開釋酶家屬、激肽開釋酶激肽原激肽體系及其緊張應(yīng)用j.