人教版高中生物選修一專題5課題3《血紅蛋白的提取和分離》-課件-(共38張)

1、課題3 血紅蛋白的提取和分離課題3 血紅蛋白的提取和分離 血紅蛋白只存在于紅細(xì)胞內(nèi)，含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)血紅蛋白的特點(diǎn)：Fe2+ 血紅蛋白只存在于紅細(xì)胞內(nèi)，含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一、基礎(chǔ)知識(shí):1 、分離生物大分子的基本思路是什么？本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純？ 選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2、蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)：不同種類蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)不同： 蛋白質(zhì)形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、

2、吸附性質(zhì)、對(duì)其他分子親和力等千差萬別。從而分離不同種類的蛋白質(zhì)。 一、基礎(chǔ)知識(shí):1 、分離生物大分子的基本思路是什么？本課題我一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)提取和分離原理 提取分離方法凝膠色譜法 凝膠電泳法 3 、分離不同的蛋白質(zhì)方法：一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)提取和分離原理 提取分離方法凝膠色譜法2、原理：1、材料- 實(shí)際上就是一些微小的多孔球體。小球內(nèi)部有許多貫穿的通道. 大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，如葡聚糖、瓊脂糖。凝膠(一)凝膠色譜法（分配色譜法）：根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法 當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)， 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)：容易進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速

3、度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)：無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部間隙中移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。2、原理：1、材料- 實(shí)際上就是一些微小的多孔3、具體過程：一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)分離和提取的原理3、具體過程：一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)分離和提取的原理9、要學(xué)生做的事，教職員躬親共做；要學(xué)生學(xué)的知識(shí)，教職員躬親共學(xué)；要學(xué)生守的規(guī)則，教職員躬親共守。2022/10/112022/10/11Tuesday, October 11, 202210、閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。2022/10/112022/10/112022/10/1110/11/2022 12:46:15 AM11

4、、只有讓學(xué)生不把全部時(shí)間都用在學(xué)習(xí)上，而留下許多自由支配的時(shí)間，他才能順利地學(xué)習(xí)（這）是教育過程的邏輯。2022/10/112022/10/112022/10/11Oct-2211-Oct-2212、要記住，你不僅是教課的教師，也是學(xué)生的教育者，生活的導(dǎo)師和道德的引路人。2022/10/112022/10/112022/10/11Tuesday, October 11, 2022 13、He who seize the right moment, is the right man.誰把握機(jī)遇，誰就心想事成。2022/10/112022/10/112022/10/112022/10/1110/1

5、1/202214、誰要是自己還沒有發(fā)展培養(yǎng)和教育好，他就不能發(fā)展培養(yǎng)和教育別人。11 十月 20222022/10/112022/10/112022/10/1115、一年之計(jì)，莫如樹谷；十年之計(jì)，莫如樹木；終身之計(jì)，莫如樹人。十月 222022/10/112022/10/112022/10/1110/11/202216、教學(xué)的目的是培養(yǎng)學(xué)生自己學(xué)習(xí)，自己研究，用自己的頭腦來想，用自己的眼睛看，用自己的手來做這種精神。2022/10/112022/10/1111 October 202217、兒童是中心，教育的措施便圍繞他們而組織起來。2022/10/112022/10/112022/10/11

6、2022/10/11 You have to believe in yourself. Thats the secret of success. 人必須相信自己，這是成功的秘訣。9、要學(xué)生做的事，教職員躬親共做；要學(xué)生學(xué)的知識(shí)，教職員躬親分子量大小直徑大小運(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)速度運(yùn)動(dòng)路徑洗脫次序一、基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)分離和提取的原理大于凝膠顆粒孔隙直徑，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆?？紫吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部垂直向下移動(dòng)垂直向下移動(dòng)，無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部較快較慢較短較長(zhǎng)先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來分子量大小直徑大小運(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)速度運(yùn)動(dòng)路徑洗脫次序一、基礎(chǔ)知1 、什么是緩沖液？2、 緩沖液的作用

7、是什么？【思考2 】:（二）、緩沖溶液- 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉， NaH2PO4/Na2HPO4等 能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變。洗脫劑1 、什么是緩沖液？2、 緩沖液的作用是什么？【思考2 】:3、 緩沖液是如何配制的？4、 本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？ 通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。磷酸緩沖液在本課題中使用的緩沖液是:_ ,其目的是:利用緩沖

8、液模擬細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)3、 緩沖液是如何配制的？4、 本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何 2 .原理：(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程. 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 2 .原理：(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場(chǎng)的作用凝膠電泳原理

9、示意圖凝膠電泳原理示意圖 在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”， SDS所帶負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的電荷差異，使蛋白質(zhì)遷移速率完全取決于分子大小。 (三)電泳3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。4 . SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離過程： 在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電二、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大

10、的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用哺乳動(dòng)物的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料？二、實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：（一）樣品處理血液血漿水 分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì) 胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90）兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)血液的成分（一）樣品處理血液血漿水 分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂（一）樣品處理及粗分離1、紅細(xì)胞的洗滌： （2）目的：去除雜蛋白。血液檸檬酸鈉低速短時(shí)離心吸出上層黃色血漿暗紅色紅細(xì)胞液5倍體積生理鹽水 緩慢攪拌10min低速短時(shí)離心吸出上清液反復(fù)洗滌直至上清液

11、無黃色（1）步驟：柜式離心機(jī)初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果？（一）樣品處理及粗分離1、紅細(xì)胞的洗滌： （2）目的：洗滌好的紅細(xì)胞+蒸餾水+甲苯磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?0min 紅細(xì)胞破裂釋放血紅蛋白2 、血紅蛋白的釋放：蒸餾水的作用是加入甲苯的作用是充分?jǐn)嚢璧哪康氖鞘辜t細(xì)胞大量吸水脹破溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂攪拌器轉(zhuǎn)子磁力攪拌器攪拌器正在工作洗滌好的紅細(xì)胞+蒸餾水+甲苯磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?0min 3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液中速離心10min 離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯紅細(xì)胞破碎混合液轉(zhuǎn)移離心管中中速長(zhǎng)時(shí)離心（2000r/min10min）濾紙過濾除去脂質(zhì)分液漏斗靜置片刻分出

12、下層的紅色透明液體。3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞中速離心離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑 無色透明的甲苯層脂類物質(zhì) 白色脂溶性物質(zhì)沉淀層血紅蛋白溶液 紅色透明液體紅細(xì)胞破碎物沉淀 暗紅色沉淀物分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑 無色透明的甲苯層脂類物質(zhì)20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL4、透析（粗提?。喝?ML血紅蛋白溶液裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析12小時(shí)。透析袋：小分子自由通過，而大分子保留在袋內(nèi)。去除小分子的雜質(zhì)20mmol/L磷酸緩沖液4、透析（粗提?。喝?ML血紅蛋利用透析袋透析利用透析袋透析透析過程透析過程（二）純化凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作

13、：2.凝膠色譜柱的裝填：3.樣品的加入和洗脫（二）純化凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜（二）凝膠色譜操作1、凝膠色譜柱的制作： 取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：選擇適合封堵玻璃管口的橡皮塞打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。如P68圖5-19注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。（二）凝膠色譜操作1、凝膠色譜柱的制作： 如P68圖5-19

14、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒洗脫液沸水浴 凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液2.注意： 1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 3、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果

15、。4、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。注意： 3、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣 裝配好的凝膠柱如圖5-21裝配好的凝膠柱如圖5-213.樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱

16、底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功） 注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。3.樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)3.樣品的加入和洗脫3.樣品的加入和洗脫開始進(jìn)行層析開始進(jìn)行層析收集得到的純化后的蛋白收集得到的純化后的蛋白知識(shí)總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原 理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組 成作 用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗 分 離純 化純度鑒定知識(shí)總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原 教學(xué)反饋 1凝膠

17、色譜法是根據(jù)（ ）分離蛋白質(zhì)的有效方法。 A分子的大小 B相對(duì)分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（ ）基本不變。 A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度BB教學(xué)反饋 1凝膠色譜法是根據(jù)（ ）分離蛋白質(zhì)的有效3電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（ ）的電極移動(dòng)。 A相同 B相反 C相對(duì) D相向4. 哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（ ）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。 A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動(dòng)蛋白 D肌球蛋白BA3電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（ 5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ ）的含量最多。 A白細(xì)胞 B血小板

18、C紅細(xì)胞 D淋巴細(xì)胞6為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)?）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸餾水 D.檸檬酸鈉CD5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ ）的含量最多。7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（ ） A無色透明的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液 D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物C7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是A 弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B 弄清各種蛋白質(zhì)的功能C 弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D 獲得高純度的蛋白質(zhì)練習(xí)鞏固1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述