宏基因組學(xué)課件

1、 宏基因組學(xué)通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的 DNA,構(gòu)建宏基因組文庫,利用基因組學(xué)的研究策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。 宏基因組學(xué)通過直接從環(huán)境樣品中 宏基因組學(xué)研究已滲透到各個領(lǐng)域,包括海洋、 土壤、 熱液口、 熱泉、 人體口腔及胃腸道等,并在醫(yī)藥、 替代能源、 環(huán)境修復(fù)、 生物技術(shù)、 農(nóng)業(yè)、生物防御及倫理學(xué)等各方面顯示了重要的價值。 宏基因組學(xué)研究已滲透到各個領(lǐng)域,包括海洋、 土壤、 熱宏基因組學(xué) 也稱微生物環(huán)境基因組學(xué), 環(huán)境基因組學(xué)，元基因組學(xué),生態(tài)基因組學(xué)。 環(huán)境基因組學(xué)建立在對疾病病因認識的基礎(chǔ)上 ,深入探討環(huán)境脅迫 - 基因、 基因- 基因間交互

2、作用。其目標是研究環(huán)境脅迫對機體遺傳變異的過程和機理 ,包括發(fā)掘環(huán)境應(yīng)激和應(yīng)答基因的多態(tài)性 ,探究這些多態(tài)性基因的功能及其與患病風(fēng)險的關(guān)系 ,其與毒理基因組學(xué)密切相關(guān) ,是在人類基因組基礎(chǔ)上發(fā)展的功能基因組學(xué)內(nèi)容之一。宏基因組學(xué) 環(huán)境基因組學(xué)建立在對疾病病因認識的基礎(chǔ)上 ,為什么要研究宏基因組學(xué)呢？99%以上的微生物未 (難 )被純培養(yǎng), 對微生物世界的認識集中在不到1%的微生物上人們對微生物的認識主要基于實驗室純培養(yǎng)的單一微生物物種,對微生物群落作為整體的功能的認識遠遠落后于對其個體的認識為什么要研究宏基因組學(xué)呢？99%以上的微生物未 (難 )被純宏基因組學(xué)課件環(huán)境基因組學(xué)的研究方法 以基因

3、組學(xué)技術(shù)為依托 主要的程序包括: 1、從環(huán)境樣品 (例如土壤 )中直接提取 DNA; 2、將 DNA克隆到合適的載體中; 3、將載體轉(zhuǎn)化到宿主細菌建立環(huán)境基因組文庫; 4、對得到的環(huán)境基因組文庫進行分析和篩選。 環(huán)境基因組學(xué)的研究方法 宏基因組學(xué)課件由于環(huán)境基因組的高度復(fù)雜性 ,需要通過高通量和高靈敏度的方法來篩選和鑒定文庫中的有用基因。篩選技術(shù)大致可分為4類: 第 1類基于核酸序列差異分析 (序列驅(qū)動 )； 第 2類基于克隆子的特殊代謝活性 (功能驅(qū)動 )； 第 3類基于底物誘導(dǎo)基因的表達 ； 第 4類基于包括穩(wěn)定性同位素和熒光原位雜交在內(nèi)的其它技術(shù)。由于環(huán)境基因組的高度復(fù)雜性 ,需要通過高

4、通量和高靈敏度的方法序列分析法 需要根據(jù)已知的基因和基因表達產(chǎn)物的保守序列設(shè)計引物和探針，PCR是序列分析中最常用的技術(shù)。對鑒定新的基因成員有一定的局限性 ,但它已被有效地用于鑒定系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中的標志基因(如 16S rRNA基因 )和帶有高度保守域的酶基因(如聚酮化合物合成酶、 葡萄糖酸還原酶和腈水合酶等 ) 。序列分析法 需要根據(jù)已知的基因和基因表達產(chǎn)物的保守序列設(shè)計引序列分析法微序列技術(shù) (Micr oarray)采用集約化和平面處理原理 ,在微小片基上高密度而有序地排列大量基因片段、 EST或寡核苷酸片段 ,從而形成 DNA微矩陣 ,又稱基因芯片。 焦磷酸測序技術(shù)( Pyrosequen

5、cing) 是在焦磷酸鹽測序法的基礎(chǔ)上結(jié)合一種乳膠材料和皮升級反應(yīng)孔 ,將基因組 DNA進行隨機切割 ,批量地進行整個測序反應(yīng)，能夠在相同的時間內(nèi)破譯 6 106組以上的基因組序列 ,比 Sanger法要快100倍 ,提高了測序的效率。序列分析法微序列技術(shù) (Micr oarray)采用集約化和焦磷酸測序技術(shù)由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。原理：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術(shù)的

6、反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構(gòu)成。反應(yīng)底物為5-磷酰硫酸、熒光素。焦磷酸測序技術(shù)由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反反應(yīng)過程脫氧核苷酸三磷酸(dNTP) DNA聚合酶（能和DNA模板的下一個堿基配對） 添加到測序引物的3末端 （釋放） 焦磷酸(PPi) ATP硫酸化酶加入 APS 特異的檢測峰 （微弱光檢測） ATP氧化熒光素（產(chǎn)生可見光） 加入熒光素反應(yīng)過程脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)宏基因組學(xué)課件序列分析法鳥槍法測序 ( Shotgun sequencing) 將一條完整的目標序列隨機打斷成小的片段 ,分別測序 ,然后利用計算機根據(jù)序列間的重疊關(guān)系進行排序和重新

7、組裝, 并確定它們在基因組中的正確位置 。序列分析法鳥槍法測序 ( Shotgun sequencin優(yōu)點：為篩選新的天然產(chǎn)物提供了一種可選擇的途徑, 從中挖掘上百萬個新基因,揭示不可培養(yǎng)微生物的代謝途徑.缺點：耗費大,需大量人力和物力。與個體微生物基因相比,對序列片段進行分析則極為困難。優(yōu)點：為篩選新的天然產(chǎn)物提供了一種可選擇的途徑, 從中挖掘上功能篩選法方法一：對具有特殊功能的克隆子進行直 接檢測 ；方法二：基于異源基因的宿主菌株與其突 變體在選擇性條件下功能互補生 長的特性進行。功能篩選法方法一：對具有特殊功能的克隆子進行直 功能篩選法以活性測定為基礎(chǔ) ,通過建立和優(yōu)化合適的方法從基因組

8、文庫中獲得具有特殊功能的克隆.依賴于功能基因或編碼功能蛋白在外源宿主中的表達 。功能篩選法以活性測定為基礎(chǔ) ,通過建立和優(yōu)化合適的方法從基因底物誘導(dǎo)基因表達法 代謝相關(guān)基因或酶基因往往在有底物存在的條件下才表達 ,反之則不表達 ,SIGEX即利用這個原理來篩選目的代謝基因。底物誘導(dǎo)基因表達法 代謝相關(guān)基因或酶基因往往在有底物存底物誘導(dǎo)基因表達法第一步：以 p18GFP為載體構(gòu)建宏基因組文庫；第二步：在無底物情況下以異丙基 2 D硫代半乳糖苷 ( IPTG)為誘導(dǎo)物去除陰性克隆和綠色熒光蛋白 基因 ( gfp)表達的克隆子； 第三步：在培養(yǎng)基中添加底物誘導(dǎo)代謝關(guān)基因的表達；第四步：根據(jù) gfp基

9、因的表達從宏基因克隆庫中篩選出表 達代謝基因的克隆子 ,利用熒光激活細胞分離儀 ( FACS)從瓊脂培養(yǎng)平板上將GFP表達的克隆子分 離出來。底物誘導(dǎo)基因表達法第一步：以 p18GFP為載體構(gòu)建宏基因組穩(wěn)定性同位素標記技術(shù) 通過 SIP實驗使參與特定代謝過程 (例如甲烷氧化 )的生物基因組富集 ,克隆從 SIP實驗中獲得的13C標記的核酸 ,從而構(gòu)建一個因吸收了特定的基質(zhì)而在環(huán)境中執(zhí)行特定代謝功能的微生物宏基因組文庫 ,這極大地減少了需要篩選的克隆數(shù)量。穩(wěn)定性同位素標記技術(shù) 通過 SIP實驗使參與特定代謝過程 (應(yīng)用和研究現(xiàn)狀應(yīng)用和研究現(xiàn)狀水體宏基因組學(xué)海表層水樣 為研究海洋生命的代謝潛力和海

10、洋生態(tài)學(xué)提供了前所未有的原始素材；海洋蘊藏著巨大的生物多樣性和復(fù)雜性 ,宏基因組學(xué)研究將大大促進人們對它的認識。極端環(huán)境水體 (如酸性礦水、 深海 ) 由于其苛刻的物理化學(xué)條件,使得其中的微生物群落也較為獨特 ；利用環(huán)境基因組學(xué)對其開展微生物生物群落結(jié)構(gòu)及生理代謝對環(huán)境變化響應(yīng)的研究 ,將促進我們更好地理解這些極端環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)并對其加以調(diào)控和利用。 水體宏基因組學(xué)海表層水樣土壤宏基因組學(xué)從土壤宏基因組文庫中獲得新編碼基因是該技術(shù)的主要功能所在 ,已發(fā)現(xiàn)的新基因主要有生物催化劑基因、 抗生素抗性基因以及編碼轉(zhuǎn)運蛋白基因 土壤宏基因組學(xué)技術(shù)最引人注目的貢獻是新生物催化劑的發(fā)現(xiàn) , 包括腈水解酶和淀粉酶( Rondon