毒物分析第四章課件

1、第4章 毒物分析常用方法-色譜分析新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分析/藥分教研室2022/10/121Chapter one Generalyzation of chromatography 色譜法概述一、 origins 起源 俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置。1-1origins and development of chromatography 色譜法起源與發(fā)展Animation動畫 2022/10/122試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相stationary phase； 色譜法是一種分離技術(shù)，另一相是攜帶試樣混

2、合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相mobile phase。2022/10/123 1-2 Classification of chromatography色譜法分類2022/10/124流動相為氣體，固定相為固體吸附劑GC氣相色譜GSC氣固色譜GLC氣液色譜流動相為氣體，固定相為液體流動相為液體，固定相為固體吸附劑。LC液相色譜LSC液固色譜LLC液液色譜流動相為液體，固定相為液體一、classified according to the molacular state of liquid and solid phase 按流動相和固定相的分子聚集狀態(tài)分類2022/10/125

3、名稱操作形式柱層析固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達(dá)分離（正相與反相色譜）薄層層析將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣、流動相展開，使各組份分離紙層析用濾紙作液體的載體，點樣后用流動相展開，使各組份分離薄膜層析將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進行物質(zhì)的分離2022/10/127column chromatographyCC柱色譜plane chromatographyPC平面色譜packed column填充柱色譜capillary column毛細(xì)管柱色譜microbore packed column column微填充柱色譜paper chromatograp

4、hyPC 紙色譜thin layer chromatographyTLC薄層色譜Thin filmchromatographyTFC薄膜色譜2022/10/1281-3 Process of chromatography and basic principle色譜過程和色譜圖 一、 process of chromatography 色譜過程 該過程主要利用試樣中各組分在固定相和流動相間具有不同的溶解和解析能力；或不同的吸附和脫附能力；或其它親和性能的差異進行分離的。2022/10/12102、 partion factor分配系數(shù) K 組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過

5、程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的濃度（單位：g / mL）比，稱為分配系數(shù)，用K 表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。2022/10/1211二、 chromatogram色譜圖 試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，按先后次序經(jīng)過檢測器時，檢測器就將流動相中各組分濃度變化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號，由記錄儀所記錄下的信號時間曲線或信號流動相體積曲線，稱為色譜流出曲線，或色譜圖。2022/10/12121-4 qualitative analysis and quantitative analysis in chromatograph 色譜定性和定量分析一、 qualitative m

6、ethod色譜定性鑒定方法1、利用純物質(zhì)定性的方法 利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。2022/10/1214利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。 2、利用文獻保留值定性 利用相對保留值r21定性 相對保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進行定性鑒定。2022/10/1215Chapter two Plane chromatography，PC 平面色譜法Plane chromatograp

7、hyThin layer chromatographyPaper chromatography2022/10/12172-1、 paper chromatography，PC 紙色譜法一、basic priciple 基本原理 紙色譜法是以層析濾紙為載體的液相色譜法。濾紙中的纖維素通常吸收20%-25%的水分，其中約6%的水分子通過氫鍵與纖維素上的羥基結(jié)合，在分離過程中不隨有機溶劑流動，形成紙色譜中的固定相。Animation動畫 2022/10/1218 紙色譜法是以濾紙作為載體，吸附在紙上的水份作為固定相（有時也可用濾紙吸收其它物質(zhì)作為固定相），展開劑為不與水相溶的有機溶劑。在操作方法上類

8、似于薄層色譜法（點樣、展開、定位、分析），其定性參數(shù)也為Rf。 2022/10/1219由于毛細(xì)管作用，展開劑將沿著濾 紙條上升;(2) 展開劑攜帶試液中的各組分上升， 并在兩相間進行反復(fù)多次分配；(3) 在流動相中溶解度較小，在固定相中溶解度較大 的物質(zhì), 將沿著濾紙條向上移動較短的距離, 停留在紙條的較下端。反之，則停留在濾紙條的較上端。試樣中的各組份得以彼此分離。2022/10/12202022/10/1221 2-2 Thin layer chromatography TLC 薄層色譜法 比紙色譜具有速度快、分離清晰、靈敏度高、可以采用各種方法顯色等特點。層析裝置2022/10/122

9、22022/10/12242022/10/12252-3 High perfomence thin layer chromatography scanning,HTLCS高效薄層色譜掃描由來和特點 TLC具有樣品預(yù)處理簡單、固定相一次性使用；平面開放型色譜有多路柱效應(yīng)，可同時進行多個樣品分析；同一板上不同區(qū)域可使用不同顯色劑、可同時定性定量。因此在實際工作中至今仍然經(jīng)常應(yīng)用。但是其主要的缺點是操作費時、精密度和靈敏度較低，限制了應(yīng)用范圍。為此，將HPLC和GC的技術(shù)引進TLC。建立高效薄層色譜掃描和TLC不同： 、采用高效固定相； 、利用光譜分析等各種檢測手段; 、實現(xiàn)計數(shù)機和自動化操作。 在

10、復(fù)雜樣品、天然產(chǎn)物分析領(lǐng)域得到普遍的應(yīng)用。2022/10/1227儀器系統(tǒng)、薄層制備系統(tǒng):制板、活化、點樣)；、光學(xué)系統(tǒng):光源、雙單色器、聚焦系統(tǒng)、反射和透射檢測器；、機械系統(tǒng):完成行掃描或鋸齒掃描；、PC儀器控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng):數(shù)據(jù)處理、繪圖、報告打印。2022/10/1228得到薄板斑點圖及掃描色譜圖2022/10/12294，應(yīng)用 藥物分析、 毒物分析等2022/10/1230工作方式 、薄層工作：制板、活化、點樣、噴霧顯色、紫外照射、目測； 、固定斑點掃描：采用單波長掃描，得到吸收光譜、反射光譜或熒光發(fā)射光譜。用對照品對照，用于定性鑒別和尋找定量分析測試條件。 、斑點雙波長直線掃描(行

11、掃描)：雙波長測定可消除固定相產(chǎn)生的噪音。獲得比較光滑的色譜曲線與積分峰面積。通常用對照品采用工作曲線法、內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法，依據(jù)A-C曲線或F-C曲線作定量分析。 、斑點雙波長鋸齒掃描：鋸齒掃描可克服行掃描時因斑點形狀不同引起的誤差。色譜曲線積分峰面積定量，通常用對照品采用工作曲線法、內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)法定量分析。 、常規(guī)方法：“雙波長”+“鋸齒掃描”透射或反射法，可獲得較滿意的色譜曲線和良好的線性關(guān)系及良好的重現(xiàn)性。2022/10/1231Chapter three Gas chromatography 氣相色譜法 2022/10/12322022/10/1233 氣相色譜系流動相為氣體的一類色譜儀器

12、分析。常用用H2和N2。有高選擇性、高靈敏性、用樣量少、分析速度快。適用于組分復(fù)雜和具有揮發(fā)性的混合物和微量組分，在毒物分析、體內(nèi)藥物分析和興奮劑檢測(GC-MS)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。 氣相色譜（Gas Chromatography，GC）2022/10/12342022/10/12353-1 analitical process of gas chromatography 氣相色譜分析流程2022/10/1236氣相色譜流程1、載氣系統(tǒng)：包括氣源、氣體凈化、氣體流速的控 制和測量；2、進樣系統(tǒng)：包括進樣器、氣化室；3、色譜柱：柱體、固定相；4、檢測系統(tǒng)：包括檢測器、放大器、記錄儀，有的 還帶有數(shù)

13、據(jù)處理裝置。載氣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)溫控系統(tǒng)2022/10/1237 隨著載氣的流動，溶解、揮發(fā),或吸附、脫附的過程反復(fù)地進行。Animation動畫 2022/10/1238斜率=K對稱峰前沿峰拖尾峰2022/10/1239Animation動畫 2022/10/1240Animation動畫 2022/10/1241Animation動畫 2022/10/1242 應(yīng)用 ，環(huán)境污染物、食物添加劑、農(nóng)藥殘留量; ，藥物組份(如揮發(fā)油各種組份)、水分、雜質(zhì)、溶劑； ，體內(nèi)藥物分析、興奮劑和毒品。2022/10/1243 Chapter four High Performance Liqu

14、id chromatography HPLC 高效液相色譜法2022/10/1244在經(jīng)典色譜和GC的理論基礎(chǔ)上發(fā)展形成。在自動化、分離能力、速度及適用范圍等方面有飛躍進步。 1，儀器系統(tǒng)：高壓輸液泵和梯度洗脫系統(tǒng)；進樣器(六通進樣閥)；檢測器(UV、NP、IR、MS)等組成 高效液相色譜（HPLC）2022/10/12452022/10/12462022/10/12472022/10/1248一、Feature of HPLC高效液相色譜法的特點 特點：高壓、高效、高速 高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2022/10/1249儀器結(jié)構(gòu), 載氣系統(tǒng), 進樣器系統(tǒng), 柱系統(tǒng)：普

15、通填充柱:F=3-6mm,L=2-4m,毛細(xì)管柱:F=0.1- 0.5mm, L=10-200m,有空心和填充兩類)。, 檢測系統(tǒng) 2022/10/1250二、 process and main assembly of HPLC流程及主要部件1、 process 流程2022/10/12512022/10/12522、main assembly 主要部件(1) 高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性

16、Animation動畫 2022/10/1253(2)梯度淋洗裝置外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/10/1254(3) 進樣裝置 流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/10/1255 3，應(yīng)用 體內(nèi)藥物分析、中藥成分分析、毒物分析，分析血清、血漿、尿、全血、組織等不同試樣中的多種類型藥物、毒物及代謝產(chǎn)物。 3.1，HPLC-IR聯(lián)用 測定生物樣品的興 奮劑和毒品2022/10/125

17、62022/10/1257 六、質(zhì) 譜（Mass spectra，MS） 質(zhì)譜儀是一種將原子、離子或分子轉(zhuǎn)變成帶電離子，然后在質(zhì)量分析器中使其分離，獲得按質(zhì)量順序排列的圖譜，橫坐標(biāo)為離子質(zhì)量m和電荷e之比(質(zhì)荷比m/e)，縱坐標(biāo)為相對豐度(以基峰的離子電流強度作為100)。GC-MS、HPLC-MS廣泛應(yīng)用于毒物分析。 1，儀器結(jié)構(gòu)Animation動畫 2022/10/1258 1.1 離子源 將進樣系統(tǒng)引入的樣品分子轉(zhuǎn)化成離子。由于離子化所需要的能量差異很大，對不同的分子應(yīng)選擇不同電離方法。給樣品較大能量的電離方法稱硬電離方法，較小能量的電離方法為軟電離方法，后一種方法適用于易破裂的樣品。離子源有多種，如電子轟擊、化學(xué)電離、電噴霧等。2022/10/1259 1.2，質(zhì)量分析器 質(zhì)量分析器位于離子源和檢測器之間，依據(jù)不同方式將樣品離子按質(zhì)荷比 m/z 分開。主要類型有：磁分析器、四極濾質(zhì)器、飛行時間分析器等。 Animat