蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)總論課件

1、蛋白質(zhì)分離純化2009-3-28蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定pH的溶液中都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量范圍可達(dá)1萬(wàn)至100萬(wàn)之間，其分子的直徑在1100 nm，為膠粒范圍之內(nèi)。 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷（雙電層）水化膜蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加蛋白制品的純度或比活1.前處理(pret

2、reatment)：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異2.粗分級(jí)分離(rough fractionation)：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.細(xì)分級(jí)分離(fine frationation)：采用凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶：分離純化的最后步驟蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差異分離透析和超濾根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差異分離沉淀、鹽析等根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷差異分離電泳、離子交換等根據(jù)蛋白質(zhì)與某些物質(zhì)的吸附差異吸附分離利用生物分子專一性結(jié)合的特性親和層析超過(guò)濾（ultrafiltration）加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液原理:是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其

3、他小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在半透膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的鹽析(salt precipitation) 原理：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析(NH4)2SO4等電點(diǎn)沉淀和pH控制 不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。這樣沉淀出的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。 有機(jī)溶劑分級(jí)分離丙酮、甲醇、乙醇等沉淀: 能使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度將低。低溫（零下40-60度）進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積

4、。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。 層析也稱色譜，基本原理是待分離蛋白質(zhì)溶液在流動(dòng)相的帶動(dòng)下經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。 層析因固相介質(zhì)不同又分為離子交換層析、凝膠層析和吸附層析等。層析(chromatography)技術(shù)層析的主要設(shè)備常見(jiàn)色譜柱自動(dòng)分步收集器 將作為固相成分的不溶性基質(zhì)，例如葡聚糖凝膠、纖維素、樹脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 然后加樣品，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摗?樣品中各種成分通過(guò)柱子取決于與固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫出來(lái)

5、，達(dá)到將各個(gè)成分分離的目的。 凝膠層析亦稱凝膠過(guò)濾、排阻色譜或分子篩層析等。其機(jī)理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質(zhì)，凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸脹后裝入色譜柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。因此，混合樣品如同“過(guò)篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。凝膠（gel chromatography ）層析凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖優(yōu) 點(diǎn)1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以凝膠本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 2.凝膠層析的操作條件較溫和，不易引起生物物質(zhì)的變性，即使用來(lái)分

6、離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞。 3.樣品得率高，重復(fù)性好。如果按比例擴(kuò)大柱的體積和高度，可進(jìn)行大量樣品的分離純化。缺 點(diǎn)1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限，所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)某些溶質(zhì)分子具有吸附作用，如芳香族化合物與脂蛋白等。凝膠的結(jié)構(gòu)與性能 凝膠也稱分子篩，是具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。根據(jù)網(wǎng)孔不同可制成不同規(guī)格。常用分子篩：1、葡聚糖凝膠（Sephadex） 型號(hào)：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分離大蛋白質(zhì) 小蛋白質(zhì) 除鹽 2、瓊脂糖凝膠（瑞典Se

7、pharose、美國(guó)Bio-GelA） 孔徑大，用于分離大分子物質(zhì) 3、聚丙烯酰胺凝膠（ Bio-GelP）結(jié)構(gòu)：葡聚糖用交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過(guò)醚鍵(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OH葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex） Sephadex的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度，交聯(lián)度的大小可在合成Sephadex時(shí)控制加入交聯(lián)劑的百分比決定。交聯(lián)劑的百分比高，交聯(lián)度大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈緊密，孔隙愈小，吸水后膨脹也愈小，機(jī)械強(qiáng)度高，分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低，分離物質(zhì)的分子量大。G類Sephadex的型號(hào)表示每克干凝膠吸

8、水量，如G-50表示每克干凝膠吸水量為5ml。 Sephadex的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水、鹽、弱酸和堿，耐熱耐堿不耐酸。葡聚糖凝膠特點(diǎn) 它是一種大孔凝膠，其工作范圍的下限幾乎是Sephadex的上限，可分離MW40萬(wàn)以上的物質(zhì)，因此可用來(lái)分離核酸及病毒。 瓊脂糖凝膠不帶電荷，不受微生物作用而降解，但對(duì)熱不穩(wěn)定，易受pH影響(只在pH4.5-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose) 使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似，但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定，可在pH 2-11范圍內(nèi)使用. 聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P（Bio-Gel P），由美國(guó)Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號(hào)很多，從P-2至P-3

9、00共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。 聚丙烯酰胺凝膠 選擇何種凝膠以及它的型號(hào)，這需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，溶質(zhì)的分子量大小和分離工作的目的而定，每種型號(hào)凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍，選擇的型號(hào)凝膠要能滿足實(shí)驗(yàn)要求。凝膠的選擇凝膠的排阻極限排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時(shí)被最先洗脫出來(lái)。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到有效分離。例如Sephadex G-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000

10、的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來(lái)。2003年中科院考研題今有a、b、c、d四種蛋白質(zhì)，其分子體積由大到小的順序是abcd，在凝膠過(guò)濾柱層析中，最先洗脫出來(lái)的蛋白質(zhì)一般應(yīng)該是（ ）A、aB、bC、cD、d2000年中科院考研題2003年上海師范大學(xué)考研題指出從分子排阻層析柱上洗脫下來(lái)下列蛋白質(zhì)時(shí)的洗脫順序，為什么？分離蛋白質(zhì)的范圍是5,000-400,000。肌紅蛋白（馬心?。?16900過(guò)氧化氫酶（馬肝） 247500細(xì)胞色素c（牛心肌） 13370肌球蛋白（鱈魚?。?524800糜蛋白酶原（牛胰） 23240血清清蛋白（人） 68500 如果被分離的蛋白質(zhì)樣品中各個(gè)成分受溶液pH的影響

11、，或帶正電荷或帶負(fù)電荷，因此可利用離子交換層析法進(jìn)行分離。 離子交換層析的固相是離子交換體，包括離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。 帶有SO3或COO基團(tuán)，通常以SO3Na 或COOH形式出現(xiàn)的叫做陽(yáng)離子交換基； 帶有N(C2H5)基團(tuán)通常以N(C2H5) Cl出現(xiàn)的叫做陰離子交換基。離子交換層析(ion exchange chromatography)陽(yáng)離子交換基強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂陰離子交換基強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素陽(yáng)離子交換層析過(guò)程離子交換樹脂蛋白質(zhì)高離子強(qiáng)度洗脫液洗高離子強(qiáng)度洗脫液洗加樣平衡液洗收集19

12、98年上海交大考研題有一蛋白水解物，在pH6時(shí)，用陽(yáng)離子交換柱層析，第一個(gè)被洗脫出來(lái)的氨基酸是：Val (pI=5.96), Lys (pI=9.74)Asp (pI=2.77), Arg (pI=10.76)Tyr (pI=5.66)是一種吸附層析，依賴于蛋白質(zhì)和它的配體（ligand）之間的相互作用來(lái)分離的。配體通常指的是能與另一個(gè)分子或原子結(jié)合（一般是非共價(jià)結(jié)合）的分子、基團(tuán)、離子、或原子。但在親和層析中，配體是通過(guò)共價(jià)鍵先與基質(zhì)結(jié)合，配體可以是酶結(jié)合的一個(gè)反應(yīng)物或產(chǎn)物，或是一種可以識(shí)別靶蛋白的抗體。親和層析(Affinity chromatography) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過(guò)裝有連接了

13、配體的基質(zhì)的親和層析柱時(shí)，只有靶蛋白可以特異地與基質(zhì)結(jié)合，而其它沒(méi)有結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。特異結(jié)合在基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自由配體的溶劑洗下。所以有時(shí)只用親和層析就可使蛋白質(zhì)的純化提高1000至10000倍。原 理親和層析過(guò)程吸附本質(zhì)：非共價(jià)連接常用吸附劑：結(jié)晶磷酸鈣、硅膠等脫附（洗脫）方式： 1、改變蛋白質(zhì)帶電狀態(tài)； 2、改變環(huán)境溶液的pH、離子強(qiáng)度等。含配體溶液收集目的蛋白 洗下未結(jié)合的蛋白混合蛋白樣品平衡液帶有配體的樹脂珠（或膠粒）優(yōu) 點(diǎn) 親和層析純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，且分離效率高。對(duì)分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必須針對(duì)某一分離對(duì)象，制備專一的配基和尋求

14、層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。分配層析柱層析紙層析薄層層析氣相色譜(gas chromatograph, GC)是利用樣品中個(gè)組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配系數(shù)不同達(dá)到分離的目的。當(dāng)汽化后的樣品被載氣帶入色譜柱中運(yùn)行時(shí)，組分就在其中的兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配（吸附脫附放出）由于固定相對(duì)各種組分的吸附能力不同，各組份在色譜柱中的運(yùn)行速度就不同，經(jīng)過(guò)一定的柱長(zhǎng)后，便彼此分離，按順序離開色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，產(chǎn)生的離子流信號(hào)經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。氣相色譜分類GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相

15、色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。當(dāng)層析系統(tǒng)的流動(dòng)相為氣體如氫、氦、氮，固相為涂漬在固體顆粒表面的液體時(shí)，此層析技術(shù)稱為氣液層析或氣液色譜氣相色譜法的特點(diǎn)應(yīng)用范圍廣：氣象色譜法可以分析氣體和易揮發(fā)的物質(zhì)高效：可以分析沸點(diǎn)十分相近的組分，和極為復(fù)雜的多組份混合物。例如，用毛細(xì)管，可以分析輕油中150個(gè)組份。高選擇性：是指固定相對(duì)性質(zhì)極為相似的組份，如同位素，烴類的異構(gòu)體等有較強(qiáng)的分離能力。主要通過(guò)選用高選擇性的固定液。高靈敏度：指用高靈敏度的檢測(cè)器可檢測(cè)出10-1110-13克的物質(zhì)。因此可用于痕量分析。高速：一般分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。某些快速分析中，一秒鐘可以分析若干

16、份。色譜法易于自動(dòng)化操作與處理都自動(dòng)化，速度很快。液相色譜 (liquid chromatograph, LC)LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動(dòng)相（常用CO2），因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)也稱高壓液相層析（high pressure liquid chromatography）。這是近二十年內(nèi)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)快速、靈敏、高效的分離

17、技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)了氣相層析的理論，利用高壓輸送流動(dòng)相，擁有高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器，具有氣相層析的全部?jī)?yōu)點(diǎn)。 原 理 混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相之間會(huì)發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離高效液相色譜的主要類型按分離機(jī)制的不同分為四類：液液分配色譜法（partition chromatography）液固吸附色譜法（adsorption chromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10m流動(dòng)相：有機(jī)溶劑適用于分離分子量200-1

18、000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。各組分的出峰順序 極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。 極性較大組分滯留作用大，后流出。 飽和烴 烯 芳烴 醚 醛酮 pI 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，電泳中向正極移動(dòng)pHpI 蛋白質(zhì)帶正電荷，電泳中向負(fù)極移動(dòng)pH=pI 蛋白質(zhì)凈電荷為零，電泳中不動(dòng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 支持物:單體丙稀酰胺(Acr) 交聯(lián)劑:甲叉(or亞甲)雙丙稀酰胺(Bis) 聚合 1、光聚合:核黃素為催化劑(陽(yáng)光,日光) 制大孔膠 2、化學(xué)聚合: 過(guò)硫酸銨(NH4)2S2O3，縮寫為APS為催化劑 N,N,N,N,-四甲基乙二胺 縮寫為TEMED是加速劑用來(lái)制

19、小孔膠聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠網(wǎng)孔大?。?聚合鏈長(zhǎng)度:由Acr濃度決定 交聯(lián)程度:由Acr與Bis相對(duì)比例決定Bis的濃度低，孔徑大，可在聚合前調(diào)節(jié)單體與Bis的濃度比如: Acr Bis T(%) 小孔 28.0g 0.735g 7% 大孔 10.0g 2.5g 2.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS）：常用于蛋白質(zhì)分 子量的測(cè)定。SDS （十二烷基磺酸鈉）SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約1 1.4比例結(jié)合。每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)?/p>

20、結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。作業(yè)：1997年清華大學(xué)考研題有兩個(gè)純的蛋白質(zhì)a和b，相對(duì)分子質(zhì)量都是100000的近似球形的蛋白質(zhì)。其中，蛋白質(zhì)a：由2個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為40000的亞基和2個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為10000的亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI=6.0。蛋白質(zhì)b：由相對(duì)分子質(zhì)量為25000的單一亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)也是pI=6.0。試預(yù)測(cè)這兩種蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的電泳結(jié)果。等電

21、聚焦電泳（isoelectric focusing electrophoresis, IEFE） 利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點(diǎn)電不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。pH梯度是以兩性電解質(zhì)在外電場(chǎng)作用下自然形成。原 理等電聚焦就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c(diǎn)位置上，也就是說(shuō)被聚焦于一個(gè)狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點(diǎn)聚焦也稱為聚焦電泳。pH梯度的建立 用多種兩性電解質(zhì)混合物建立穩(wěn)定良好的pH梯度 本質(zhì)：一系列脂肪族多氨基、多羧酸同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的

22、pI值。 pH范圍：pH310pH梯度的形成 載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物，在通電后，它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度。所有的載體兩性電解質(zhì)分子都帶電荷，只是溶液中正電荷和負(fù)電荷的基團(tuán)數(shù)目相等，凈電荷為零。沒(méi)通電時(shí)的變化引入電場(chǎng)時(shí)的變化 載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽(yáng)極遷移，等電點(diǎn)最低的分子（負(fù)電荷最多的）將最快地向陽(yáng)極遷移。當(dāng)它達(dá)到凈電荷是零的位置時(shí)才停止。 其次一些低pI的載體兩性電解質(zhì)分子（負(fù)電荷比較多的）也將向陽(yáng)極移動(dòng)，直到它的凈電荷被減少到零才停止。電泳結(jié)束后的變化所有的載體兩性電解質(zhì)分子以增加pI級(jí)數(shù)的辦法將分別在陽(yáng)、陰極之間到達(dá)它們自己的位置而給

23、出一個(gè)pI梯度。載體兩性電解質(zhì)（ampholyte，商品名為ampholine） 早期的IFE方法用的是載體兩性電解質(zhì)pH梯度聚丙烯酰胺管狀膠。載體兩性電解質(zhì)是兩性小分子，當(dāng)電壓通過(guò)含有這些分子的混合物時(shí)，載體兩性電解質(zhì)按照其pI排成一線，可使凝膠形成連續(xù)的pH梯度。理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，保證pH梯度的穩(wěn)定和允許一定的電流通過(guò)。 載體兩性電解質(zhì)的局限性1、不是明確定義上的分子混合物。在生產(chǎn)加工方面，不同批次之間產(chǎn)品有很大變化，影響分離的重復(fù)性。2、pH梯度不穩(wěn)定，隨時(shí)間的推移有向陰極漂移的趨勢(shì)。過(guò)酸過(guò)堿的蛋白質(zhì)較難分離。3、軟的丙烯酰胺管膠的操作非常困難，因?yàn)槟z

24、容易被伸長(zhǎng)或斷裂，引起分離結(jié)果之間的變化。IEFE的改進(jìn)1982年，Bjellqvist等提出了固相化pH梯度（immobilized pH gradients, IPG）方法：通過(guò)在灌膠時(shí)將丙烯酰胺緩沖液中加到聚丙烯酰胺凝膠中來(lái)產(chǎn)生pH梯度。在聚合過(guò)程中，緩沖液中的丙烯酰胺部分和丙烯酰胺及亞甲基雙丙烯酰胺單體一起共聚合形成聚丙烯酰胺凝膠。固相化pH梯度凝膠(IPG)的優(yōu)點(diǎn)1、避免陰極漂移：因pH梯度是共價(jià)固定于凝膠內(nèi)部的，具有更寬的pH分離范圍，使過(guò)酸過(guò)堿的蛋白質(zhì)得到分離2、具有更高的負(fù)載蛋白質(zhì)的能力3、生產(chǎn)上重復(fù)性好雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,

25、 2DE)最早是由Smithies和Poulik提出，蛋白質(zhì)第一向根據(jù)其自由遷移率，在濾紙條上進(jìn)行的；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進(jìn)行。 隨著聚丙烯酰胺凝膠的發(fā)明，雙向電泳支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠，即雙向凝膠電泳。 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳是一種由任意兩個(gè)單向凝膠電泳組合而成的，即在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)行第二向電泳。該技術(shù)結(jié)合了根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行分離的等電聚焦技術(shù)以及根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進(jìn)行分離的SDS電泳技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合形成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。 2DE儀器系統(tǒng)恒溫水浴垂直板電泳儀（第二向）電源等電聚焦儀（第一向）目前，第一向等電

26、聚焦電泳普遍采用預(yù)制的固定pH梯度膠條(immobilized pH gradient strips, IPG strips)。商品化的IPG strips可以從Amersham Pharmacia公司或BioRad公司購(gòu)買。圖像分析在用雙向電泳進(jìn)行差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析時(shí)，需要利用軟件對(duì)產(chǎn)生的2D膠進(jìn)行差別分析，以尋找差別表達(dá)蛋白。常用的軟件如安瑪西亞公司的Image Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析軟件。圖像分析在用雙向電泳進(jìn)行差別表達(dá)蛋白質(zhì)組分析時(shí)，需要利用軟件對(duì)產(chǎn)生的2D膠進(jìn)行差別分析，以尋找差別表達(dá)蛋白。常用的軟件如安瑪西亞公司的Ima

27、ge Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析軟件。離心技術(shù)離心是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于該旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其他顆粒分離之目的。離心機(jī)的種類繁多，用途各異。 離心技術(shù)的原理將處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等稱為“顆?！?。每個(gè)顆粒都有一定大小、形狀、密度和質(zhì)量。當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)這些顆粒在介質(zhì)中發(fā)生沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒上的力的大小和力的方向有關(guān)。 沉降系數(shù)沉降系數(shù)為顆粒在單位離心力場(chǎng)作用下的沉降速度，是1924年Svedberg提出的。沉降系數(shù)的物理意義是顆粒

28、在離心力作用下從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所經(jīng)過(guò)的時(shí)間。沉降系數(shù)的單位用Svedberg表示，單位為秒，1 Svedberg10-13秒，簡(jiǎn)稱S。S常用來(lái)近似描述生物大分子的大小，蛋白質(zhì)、核酸、核糖體和病毒的沉降系數(shù)介于110-13到20010-13S范圍，如人的Hb沉降系數(shù)為4.46S，即為4.4610-13S。 相對(duì)離心力相對(duì)離心力(RCF)是指在離心力場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù)。一般情況下，低速離心時(shí)常以rpm來(lái)表示，超速離心則以g表示。計(jì)算顆粒的相對(duì)離心力時(shí)，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)中心的距離R。由于轉(zhuǎn)子的形狀及設(shè)計(jì)差異，離心管的口部和底部到旋轉(zhuǎn)軸中心距離差異很大。如：離心管口R

29、4.8厘米，管底R(shí)8.0厘米，rpm12000離心機(jī)的分類目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的離心機(jī)種類很多，按其離心轉(zhuǎn)子能達(dá)到最高轉(zhuǎn)速分：低速離心機(jī)(在6,000 rpm以下)高速離心機(jī)(在25,000 rpm以下)超速離心機(jī)(在30,000 rpm以上) 離心分離技術(shù)的種類差速離心法是指通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同離心時(shí)間下分批離心方法。差速離心法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。主要用于分離細(xì)胞器和病毒。 差速離心法(differential centrifugation) 密度梯度離心法亦稱平衡密度梯度離心法。密度梯度離心法包括速度區(qū)帶和等密度離心二種方法

30、。后者又可分為預(yù)制梯度等密度及自形成梯度等密度兩種方法。 速度區(qū)帶離心法在離心前離心管內(nèi)預(yù)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一起離心。由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。 蔗糖密度梯度離心等密度離心法某些密度梯度介質(zhì)經(jīng)過(guò)離心后會(huì)自身形成梯度，如細(xì)胞分離液Percoll。待分離樣品可和梯度介質(zhì)先均勻混合，梯度介質(zhì)由于離心力的作用逐漸形成管底部

31、濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來(lái)分布均勻的顆粒也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于顆粒的密度時(shí)，顆粒上浮；當(dāng)管頂介質(zhì)的密度小于顆粒的密度時(shí)，則顆粒沉降；最后顆粒進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置，顆粒不再移動(dòng)，形成穩(wěn)定的區(qū)帶。 CsCl密度梯度離心超速離心超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來(lái)分離純化蛋白質(zhì)，也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。超速：50000-120000rpm蛋白質(zhì)純度的鑒定1、各種細(xì)分級(jí)的方法都可以用于純度鑒定 常用各種電泳法，比較權(quán)威的有：等速電泳、梯度電泳、等電聚焦電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。2、沉降分析和擴(kuò)散分析 測(cè)定沉降系數(shù)和擴(kuò)散系數(shù)。3、溶解度恒定法

32、加入樣品量為橫坐標(biāo)，樣品溶解量為縱坐標(biāo)，作圖。如只有一個(gè)拐點(diǎn)則說(shuō)明樣品純。蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定1、最小分子量測(cè)定法：如Mb含F(xiàn)e為0.335%，則M=55.8/0.335%=16700。這就是最小分子量。其實(shí)，真實(shí)分子量是最小分子量的n倍，n指Fe的數(shù)目，Mb的n=1，所以M=16700；而Hb用其他方法測(cè)得分子量為68000，則說(shuō)Hb含4個(gè)Fe原子。2、滲透壓法3、超離心法4、凝膠過(guò)濾法5、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 1、凱氏定氮法 2、雙縮脲反應(yīng) 3、Folin-酚試劑反應(yīng) 4、紫外吸收法 5、考馬斯亮藍(lán)法凱氏定氮法是一種檢測(cè)物質(zhì)中“含氮總量”的方法。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱，分解出碳、氫、氮形成二氧化碳、水及氨，產(chǎn)生的氨能夠與硫酸結(jié)合，生成硫酸銨，此過(guò)程稱為“消化”。這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行的很慢，可加入硫酸鉀或硫酸鈉提高消化液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅為催化劑。消化后，在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解，放出氨。用水蒸汽蒸餾法，將氨蒸入過(guò)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸（硼酸）溶液中，然后用