生物系統(tǒng)中目標(biāo)蛋白分子的分離與純化課件

1、生物系統(tǒng)中目標(biāo)蛋白分子的分離與純化1生物系統(tǒng)中目標(biāo)蛋白分子的分離與純化1生物系統(tǒng)中目標(biāo)蛋白分子的分離與純化三個關(guān)鍵問題:目標(biāo)蛋白分子病理條件下的大小可能變化。保護措施到位，避免目標(biāo)蛋白分子的技術(shù)性降解（ -70C條件下保存， 實驗操作通常在冰浴下進行， 充分使用蛋白酶抑制劑）。選擇合適的分離與純化方案。2生物系統(tǒng)中目標(biāo)蛋白分子的分離與純化三個關(guān)鍵問題:2分離純化目標(biāo)蛋白分子的來源:一個最基本的原則是方便大量得到。牛、豬、馬、兔和鼠等動物的肝臟或其他臟器組織?；颊叩氖中g(shù)組織標(biāo)本。培養(yǎng)的人或其他哺乳動物細(xì)胞。細(xì)菌或酵母菌?；蚩寺”磉_(dá)。3分離純化目標(biāo)蛋白分子的來源:3分離純化目標(biāo)蛋白分子的方法:鹽

2、析法。有機溶劑沉淀法。等電點沉淀法。吸附法。結(jié)晶法。電泳法。超速離心法。柱層析法。4分離純化目標(biāo)蛋白分子的方法:4鹽析法分離純化目標(biāo)蛋白分子的原理:蛋白質(zhì)的溶解度，在低鹽濃度范圍隨著鹽濃度的升高而逐漸升高。此過程叫做鹽溶(salting-in)。當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定程度后，再增加鹽濃度，此時蛋白質(zhì)的溶解度不是隨著鹽濃度的升高而升高，而是逐漸降低，在溶液中出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀析出。此過程叫做鹽析(salting-out)。不同蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析時的鹽濃度是不同的。這是蛋白質(zhì)分子的一種特點。利用這一特點可對目標(biāo)蛋白分子實施分離純化。這種方法叫做鹽析法。5鹽析法分離純化目標(biāo)蛋白分子的原理:5-0.60.40.20

3、.0-0.2| | | | 等電點pH時，中性鹽對碳氧血紅蛋白溶解度的影響離子強度（）lg蛋白質(zhì)溶解度1.0 2.0離子強度 （ionic strength）計算公式： C nZn2/2。C：各種離子的摩爾濃度，Z：各種離子的所帶電荷數(shù)。 0.5MK2SO4的離子強度(1 12+0.5 22)/2=1.5。1MNaCl的離子強度(1 12+1 12)/2=1。6-0.6| OHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH

4、OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_蛋白質(zhì)鹽溶過程示意圖OHHOHHOHHOHH蛋白質(zhì)分子正負(fù)鹽離子7OHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHOOHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH_OHHOHH_蛋白質(zhì)鹽析過程示意圖8OHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHO蛋白質(zhì)鹽析實驗用鹽（

5、中性鹽）及其優(yōu)缺點鹽優(yōu)點缺點硫酸銨1）溶解度大，2）溶解度變化溫度系數(shù)小，3）廉價易得，4）不易引起蛋白質(zhì)變性，5）分段效果較好。1）對蛋白氮的測定有干擾，2）緩沖能力較差。硫酸鈉1）對蛋白氮的測定無干擾，2）廉價易得，3）鹽析免疫球蛋白效果不錯。1）30C一下溶解度低， 2）溶解度變化溫度系數(shù)大。磷酸鈉1）效果有時優(yōu)于硫酸銨，2）對蛋白氮的測定無干擾，3）廉價易得。1）溶解度低，2）溶解度變化溫度系數(shù)大。氯化鈉1）對蛋白氮的測定無干擾，2）廉價易得。1）溶解度較低，2）溶解度變化溫度系數(shù)大。硫酸鎂1）對蛋白氮的測定無干擾，2）廉價易得。1）溶解度較低，2）溶解度變化溫度系數(shù)大。9蛋白質(zhì)鹽析實

6、驗用鹽（中性鹽）及其優(yōu)缺點鹽優(yōu)點缺點硫酸銨1）溶蛋白質(zhì)鹽析實驗需要注意的幾個問題鹽的使用濃度：不同蛋白質(zhì)的鹽析所要求的鹽濃度不同。分離混合組分蛋白質(zhì)時，鹽的濃度由低到高漸次增大。每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)的沉淀時，則進行離心或過濾，分離所沉淀蛋白質(zhì)，再繼續(xù)增加鹽的濃度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀。一個例子：用鹽析分離血漿中蛋白質(zhì)，1)硫酸銨濃度20時纖維蛋白原析出；2)硫酸銨濃度2833時，優(yōu)球蛋白析出；3)硫酸銨濃度3350時，擬球蛋白析出；4)硫酸銨濃度50以上時，白蛋白析出。10蛋白質(zhì)鹽析實驗需要注意的幾個問題10蛋白質(zhì)鹽析實驗需要注意的幾個問題pH值：通常選擇目標(biāo)蛋白的等電點。蛋白質(zhì)濃度：在相同鹽析條件

7、下，蛋白質(zhì)濃度越大越容易沉淀析出，但蛋白質(zhì)濃度過大容易引起其他雜蛋白的共沉淀析出。溫度：濃鹽對蛋白質(zhì)有一定的保護作用，因此蛋白質(zhì)鹽析操作通常在室溫下進行。至于那些對熱敏感的酶，則宜維持在低溫4C條件下進行鹽析。脫鹽：透析法。11蛋白質(zhì)鹽析實驗需要注意的幾個問題11透析缸透析液（蒸餾水或緩沖液，加入防腐劑）透析袋（半透膜）蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)透析脫鹽，4C下12透析缸透析液（蒸餾水或緩沖液，加入防腐劑）透析袋（半透膜）蛋蛋白質(zhì)超過濾脫鹽，4C或0C下蛋白質(zhì)溶液半透膜支持柵板離心管13蛋白質(zhì)超過濾脫鹽，4C或0C下蛋白質(zhì)溶液半透膜支持柵板離柱層析法 (Column chromatographic me

8、thod) 離子交換柱層析（Ion-exchange column chromatography）分子篩柱層析（Molecular sieve column chromatography）反向柱層析（Reverse-phase column chromatography）疏水柱層析（Hydrophobic interaction column chromatography）親和柱層析（Affinity column chromatography）14柱層析法 (Column chromatographic m大分子小分子凝膠顆粒裝載小分子的凝膠顆粒分子篩柱層析（Molecular sieve

9、column chromatography)凝膠過濾層析（Gel filtration column chromatography)凝膠滲透層析（Gel permeation column chromatography)15大分子小分子凝膠顆粒裝載小分子的凝膠顆粒分子篩柱層析（Mol+Affinity chromatographyTarget proteins Other proteinsAgarose Ligand 1234516+Affinity chromatographyTargetDNA affinity chromatography-1 ACGT TGCAACGT TGCAACGT 1 Sepharose 4B-dsDNA2 Target proteins3 Other proteins17DNA affinity chromatography-1 ACGT TGCADNA affinity chromatography-2