熒光光譜在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用

1、熒光光譜在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用李強(qiáng) 0710219黃雄 0710209李承珉 0710214蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究方法 1.測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象。如核磁共振法,圓二色譜法, 激光拉曼光譜法, 熒光光譜法。 2測(cè)定晶體蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。如X射線衍射分析法。 兩者的共同之處是可以用蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行測(cè)量，而且不破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。熒光光譜法的優(yōu)點(diǎn) 熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種有效方法。它能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù), 這些參數(shù)從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過(guò)對(duì)這些參數(shù)的測(cè)定, 不但可以做一般的定量分析, 而且還可以推斷蛋白質(zhì)分子在各

2、種環(huán)境下的構(gòu)象變化, 從而闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。同時(shí), 熒光光譜法還具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。所以, 該方法在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象研究中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。熒光光譜的測(cè)量原理光是一種電磁波。它的頻率與波長(zhǎng)的關(guān)系為： =c/ (1) 式中為頻率、為波長(zhǎng)、c為光速。熒光光譜的測(cè)量原理當(dāng)光進(jìn)入某種物質(zhì)以后，可以有兩種情況發(fā)生：一種是進(jìn)入物質(zhì)后，能量幾乎不被吸收；另一種是能量被全部吸收或被部分吸收。 在后一種情況下，在吸收光的過(guò)程中，光能被轉(zhuǎn)移給分子。但是吸收本身是一種高度專一的現(xiàn)象，即一定結(jié)構(gòu)的分子只能吸收一定能量的輻射。根據(jù)量子理論，分子從光波中吸收能量必定是以不連續(xù)

3、的、整份單位的形式發(fā)生，這些不連續(xù)的微小能量單位稱為量子。熒光光譜的測(cè)量原理也就是說(shuō)頻率為的單色光的能量必定是h的整數(shù)倍。每個(gè)量子能量為： E=h=h c/ =hcw (2) h為普朗克常數(shù)、w為波數(shù)。可見，能量E與波長(zhǎng)成反比，波長(zhǎng)越長(zhǎng)，能量越小熒光光譜的測(cè)量原理吸收光譜和熒光光譜能級(jí)躍遷示意圖熒光光譜的測(cè)量原理光照射物質(zhì)時(shí)，光子打到分子上，大約在10-15秒內(nèi)被吸收，原來(lái)處于基態(tài)的電子被激發(fā)到較高的能級(jí)，從而使分子處在激發(fā)態(tài)。此后，激發(fā)態(tài)分子通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換過(guò)程把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍分子，使較高激發(fā)態(tài)的電子很快回到最低激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)亦稱第一單線態(tài)。處在第一單線態(tài)的分子的平均壽命是10-8秒左右

4、。如果這種分子通過(guò)發(fā)射出相應(yīng)的光子而回到基態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)，即可產(chǎn)生熒光，根據(jù)回到的振動(dòng)能級(jí)的不同，熒光的波長(zhǎng)就不同，從而形成熒光發(fā)射帶光譜。由于發(fā)射熒光前已有一部分能量被消耗，所以發(fā)射熒光所相應(yīng)的能量要比物質(zhì)吸收的光能量小，故而熒光的發(fā)射特征波長(zhǎng)總比激發(fā)特征波長(zhǎng)長(zhǎng)。熒光光譜的相關(guān)概念1、激發(fā)光譜2、發(fā)射光譜3、熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率4、熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系1、激發(fā)光譜 激發(fā)光譜是指引起熒光的激發(fā)輻射在不同波長(zhǎng)的相對(duì)效率。把熒光樣品放入光路之后，選擇合適的發(fā)射波長(zhǎng)與狹縫寬度，并使之固定不變，然后令激發(fā)單色器掃描，即可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜的形狀與選擇的發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，但其相對(duì)強(qiáng)度與所選

5、擇的發(fā)射波長(zhǎng)有關(guān)。發(fā)射波長(zhǎng)固定在它的峰位時(shí)，所得的激發(fā)光譜最大。2、發(fā)射光譜 與激發(fā)光譜密切相關(guān)的是發(fā)射光譜。它是由于分子吸收輻射后再發(fā)射的結(jié)果。把樣品放入光路中后，選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)和狹縫，使之固定不變，然后掃描發(fā)射波長(zhǎng)，即可得到發(fā)射光譜。 一般來(lái)說(shuō)，發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)的形狀無(wú)關(guān)。但當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)選在遠(yuǎn)離激發(fā)峰的地方，發(fā)射強(qiáng)度就小。除此之外，發(fā)射波長(zhǎng)總是比激發(fā)波長(zhǎng)要長(zhǎng)，且發(fā)射光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。3、熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率 熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率是熒光物質(zhì)的重要發(fā)光參數(shù)。熒光壽命定義為當(dāng)激發(fā)光切斷后熒光強(qiáng)度衰減至原強(qiáng)度的1/e所經(jīng)歷的時(shí)間。它表示了熒光分子的S1激發(fā)態(tài)的平均壽命。

6、=1/(kf+K) 式中：kf 表示熒光發(fā)射的速率常數(shù)； K代表各種分子內(nèi)的非輻射衰變過(guò)程的速率常數(shù)的總和。 沒有非輻射衰變過(guò)程存在的情況下，熒光分子的壽命稱為內(nèi)在壽命，用0 表示。 0 =1/kf 熒光強(qiáng)度的衰變，通常遵循以下方程式： lnI0-lnIt=t/ 式中：I0 和It分別表示t=0和t=t時(shí)刻的熒光強(qiáng)度。3、熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率 熒光量子產(chǎn)率Yf定義為熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值。 Yf=kf /(kf+ K) 可見熒光量子產(chǎn)率的大小取決與熒光發(fā)射過(guò)程與非輻射躍遷過(guò)程的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果。 假如非輻射躍遷的速率遠(yuǎn)小與輻射躍遷的速率即Kkf ，那么Yf的

7、數(shù)值便接近于1。 通常情況下Yf 的數(shù)值總是小于1， Yf 的數(shù)值越大，化合物的熒光越強(qiáng)。熒光量子產(chǎn)率的大小，主要取決與化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，同時(shí)也與化合物所處環(huán)境有關(guān)。3、熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率 除常用的熒光量子產(chǎn)率外，在過(guò)去的論文或著作中也出現(xiàn)過(guò)“熒光的能量產(chǎn)率和“熒光的量子效率的術(shù)語(yǔ)。其分別表示熒光所發(fā)射的能量與所吸收的能量的比值以及處于發(fā)射熒光的激發(fā)電子態(tài)的分子百分?jǐn)?shù)。 對(duì)這些概念應(yīng)該有一定的了解。3、熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率 有分析應(yīng)用價(jià)值的熒光化合物，其熒光量子產(chǎn)率的數(shù)值一般通常處于0.11之間。 任何能影響激發(fā)態(tài)分子的光物理過(guò)程的速率常數(shù)的因素，都將使熒光的壽命和量子產(chǎn)率發(fā)生變化。如

8、：隨著溫度的升高，由于增大非躍遷過(guò)程的速率常數(shù)，從而使熒光的壽命和熒光量子產(chǎn)率下降。4、熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 熒光既然是物質(zhì)在吸光之后發(fā)射的輻射，因而溶液的熒光強(qiáng)度If應(yīng)與該溶液吸收的光強(qiáng)度Ia及該物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率Yf有關(guān)： If = Yf * Ia 而吸收的光強(qiáng)度等于入射的光強(qiáng)度減去統(tǒng)攝的光強(qiáng)度，于是可得： If = Yf *I0 It 從比爾-朗伯定律可知： It/ I0=e-abc ,因此 If = Yf *I01 e-abc 當(dāng)abc很小時(shí)，e-abc 近似為1-abc，這時(shí)： If = Yf *I0*abc; 當(dāng)用摩爾吸光系數(shù)代替a時(shí)： If = f *I0*bc4、熒光強(qiáng)度與

9、溶液濃度的關(guān)系由上式可知對(duì)與某種熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定的頻率及強(qiáng)度的激發(fā)光照射下，當(dāng)溶液的濃度足夠小使得對(duì)激發(fā)光的吸收度很低時(shí)，所測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度才與該熒光物質(zhì)的濃度成正比。當(dāng)時(shí)，那么熒光強(qiáng)度和溶液的濃度不成線性關(guān)系，此時(shí)應(yīng)考慮二次方或三次方項(xiàng)的影響。4、熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 隨著溶液濃度的進(jìn)一步增大，將會(huì)出現(xiàn)熒光濃度不僅不隨溶液濃度線性增加，甚至隨著濃度的增大而下降的現(xiàn)象，這是由于濃度效應(yīng)而導(dǎo)致的。第一方面原因是內(nèi)濾效應(yīng)。當(dāng)溶液濃度過(guò)高時(shí)，溶液中雜質(zhì)對(duì)入射光的吸收作用增大，相當(dāng)于降低了激發(fā)光的強(qiáng)度。另一個(gè)方面，濃度過(guò)高時(shí)，入射光被溶液池前部的熒光物質(zhì)強(qiáng)烈吸收，處于中、后部的熒光物質(zhì)，那

10、么因受到的入射光大大減弱而使熒光強(qiáng)度下降，而儀器的探測(cè)窗口通常是對(duì)準(zhǔn)液池中部的，從而導(dǎo)致了所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度的大大下降。其次，在較高濃度的溶液中，可能發(fā)生溶質(zhì)間的相互作用，產(chǎn)生熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子與其基態(tài)分子的二聚物或與其他溶質(zhì)分子的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光光譜的改變和熒光強(qiáng)度的下降。如果熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜與其吸收光譜呈現(xiàn)重疊，就可能發(fā)生所發(fā)射的熒光被部分再吸收的現(xiàn)象導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的下降。溶液的濃度加大時(shí)會(huì)促使再吸收的現(xiàn)象加劇。熒光光譜法蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用1.濃度測(cè)定2.構(gòu)象變化研究3.相互作用研究注： Trp為色氨酸、Tyr為酪氨酸 以及Phe 為 苯丙氨酸蛋白質(zhì)中的紫外吸收1.肽鍵在250 nm

11、的遠(yuǎn)紫外區(qū)有較大吸收2 .二硫鍵在250 nm附近有弱吸收3.色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸在280nm附近的吸收4 .蛋白質(zhì)溶液中一些雜質(zhì)的吸收蛋白質(zhì)中含苯基側(cè)鏈的氨基酸的紫外吸收光譜總結(jié)T rp、Tyr 以及Phe 由于其側(cè)鏈生色基團(tuán)的不同而有不同的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。其中T rp 的熒光強(qiáng)度最大, Tyr 次之, Phe 最小。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的熒光通常在280 nm 或更長(zhǎng)的波長(zhǎng)被激發(fā),Phe 在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件下不被激發(fā), 所以很少能觀察到Phe 的發(fā)射。這樣蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來(lái)自T rp 和Tyr 殘基。T rp 殘基對(duì)微環(huán)境的變化很敏感, 并且大多數(shù)蛋白質(zhì)中都含有幾個(gè)不同種類的T rp 殘基, 而且在Trp存在的條件下，Tyr吸收的能量常常不是自己通過(guò)熒光發(fā)射釋放出來(lái)，而是傳遞給Trp，由Trp發(fā)出熒光。因而常將Trp作為內(nèi)源熒光探針來(lái)研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的構(gòu)象。對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的一些影響因子環(huán)境溶劑溫度pH環(huán)境極性的影響光譜在極性溶劑中藍(lán)移Tyr的吸收在極性溶劑中更加微弱溶劑的吸收溫度熒光一般隨溫度上升而減弱，所以熒光實(shí)驗(yàn)需要恒溫Tyr的吸收譜與pH有關(guān)沒有考慮Tyr在蛋白質(zhì)的外部還是內(nèi)部與環(huán)境的極性有關(guān)主要