結(jié)核分枝桿菌課件

1、結(jié) 核 分 枝 桿 菌(Mycobacterium tuberculosis)侯馬市人民醫(yī)院 王珍麗分枝桿菌屬的分類結(jié) 核 病結(jié)核病為各類傳染病之首，全球1/3人感染，每年新發(fā)結(jié)核病例800萬(wàn)，70%在亞洲。每年有200-300萬(wàn)人死于結(jié)核病，其中兒童占10萬(wàn)，我國(guó)每年死于結(jié)核病 25萬(wàn)人。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道結(jié)核病在許多國(guó)家出現(xiàn)回升現(xiàn)象。 1980年后，結(jié)核發(fā)病率不斷上升，若不加緊防治，到2020年將會(huì)有10億人感染，2億人患病。 形態(tài)與染色細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲，細(xì)胞壁脂質(zhì)含量較高抗酸染色陽(yáng)性，又稱抗酸桿菌(acid-fast bacilli)有莢膜L型-莫赫(Much)顆粒，抗酸陰性，G+結(jié)核桿菌抗

2、酸染色培養(yǎng)特性專性需氧偏酸 最適PH6.56.8營(yíng)養(yǎng)要求高 羅氏培養(yǎng)基(Lowenstein)生長(zhǎng)緩慢 1824小時(shí)/代結(jié)核桿菌培養(yǎng)生化反應(yīng)不發(fā)酵糖類熱觸酶試驗(yàn)(68加H2O2)對(duì)區(qū)別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌有重要意義結(jié)核分枝桿菌大多數(shù)觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，而熱觸酶試驗(yàn)陰性非結(jié)核分枝桿菌則大多數(shù)兩種試驗(yàn)均陽(yáng)性抵抗力（四強(qiáng)）對(duì)干燥的抵抗力特別強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌對(duì)酸（3% HCl或6% H2SO4) 或堿（4% NaOH) 有抵抗力，15min不受影響對(duì)堿性染料有抵抗力對(duì)青霉素等抗生素耐藥抵抗力（四弱）對(duì)乙醇敏感對(duì)濕熱敏感對(duì)紫外線敏感對(duì)鏈霉素、異煙肼、利福平、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、對(duì)氨基水楊酸等抗

3、癆藥物敏感，但長(zhǎng)期用藥容易出現(xiàn)耐藥性變 異 性結(jié)核分枝桿菌可發(fā)生形態(tài)、菌落、毒力、免疫原性和耐藥性等變異卡介苗（BCG）結(jié)核分枝桿菌易發(fā)生耐藥結(jié)核分枝桿菌可發(fā)生L型變異 結(jié)核分枝桿菌在一定條件下能形成L型，可以自發(fā)或人工誘導(dǎo)產(chǎn)生。結(jié)核菌在患者機(jī)體內(nèi)也可因機(jī)體免疫因素或抗菌藥物的影響而形成。在臨床患者中?？赏瑫r(shí)看到結(jié)核菌細(xì)菌型和L型，治療后往往細(xì)菌型消失而L型持續(xù)存在。有報(bào)道胸片見(jiàn)有殘留結(jié)核病灶而痰結(jié)核細(xì)菌型陰性者，46.6%74%分離出結(jié)核菌L型。因此，無(wú)論在結(jié)核病的診斷和治療中除細(xì)菌型外，也應(yīng)考慮到結(jié)核菌L型的存在。結(jié)核分枝桿菌的L型變異一、結(jié)核菌L型的生成1、自發(fā)形成 L型是細(xì)菌細(xì)胞壁的缺

4、陷型，大多細(xì)菌在一定條件下都能形成L型，但分枝桿菌特別容易自發(fā)形成L型。有人提出分枝桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中L型有類似真菌的雙相性。以恥垢分枝桿菌涂抹于無(wú)菌蓋玻片上，待干后將蓋玻片置液體培養(yǎng)基中培育，經(jīng)不同時(shí)間取出作抗酸染色鏡檢。見(jiàn)玻片上典型抗酸陽(yáng)性菌逐漸減少，而圓球形、絲狀形、顆粒形等逐漸出現(xiàn)。有的甚至變?yōu)榭顾彡幮?。玻片上圓球形脫落至液體中后，又逐漸回復(fù)成典型分枝桿菌。說(shuō)明在分枝桿菌中細(xì)菌型與L型在自發(fā)的循環(huán)不息。 結(jié)核桿菌在宿主體內(nèi)也可見(jiàn)有類似的變化。有人以結(jié)核菌對(duì)豚鼠作滴鼻感染，而后經(jīng)不同時(shí)間取鼠肺培養(yǎng)，檢測(cè)菌數(shù)。感染后2周內(nèi)見(jiàn)細(xì)菌型菌數(shù)明顯降低。第3周開(kāi)始增高，至第4周達(dá)高峰。此后逐漸下降，而

5、L型數(shù)逐漸上升，至第8周達(dá)高峰。以結(jié)核菌感染腹腔，也見(jiàn)有類似情況。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明細(xì)菌型與L型二者之間能相互變換，呈反比關(guān)系，并說(shuō)明L型也是結(jié)核病感染過(guò)程中持續(xù)存在的一種形式 。2、人工體內(nèi)外誘導(dǎo) 在適合于分枝桿菌L型的培養(yǎng)基中加入抗癆藥物、酶以及某些氨基酸等誘導(dǎo)劑一起培養(yǎng)可誘導(dǎo)分枝桿菌變?yōu)長(zhǎng)型。有人用芐青霉素10004000u/ml和環(huán)絲氨酸25100ug/ml誘導(dǎo)結(jié)核桿菌H37Ra，牛型結(jié)核菌57天形成L型。 還有人用鼠腹腔巨噬細(xì)胞置玻璃片上培養(yǎng)制成單層細(xì)胞培養(yǎng)，爾后接種恥垢桿菌?？梢?jiàn)被呑噬的細(xì)菌已變?yōu)長(zhǎng)型，形態(tài)不規(guī)則，有的變?yōu)榭顾彡?yáng)性顆粒有的甚至變成抗酸陰性L型。二、結(jié)核菌L型的形態(tài)結(jié)構(gòu)1、多形

6、性：結(jié)核菌失去堅(jiān)硬的細(xì)胞壁變?yōu)長(zhǎng)型后有高度的可塑性。在臨床標(biāo)本中經(jīng)?？梢钥吹降慕Y(jié)核菌形態(tài)很不典型，有的粗短、有的細(xì)長(zhǎng)成絲狀、有的成大小不等的顆粒，分散或成串排列，與典型結(jié)核菌形態(tài)相差甚遠(yuǎn)。2、染色性改變：大多為抗酸陽(yáng)性，有的甚至能變?yōu)榭顾彡幮?。如在結(jié)核冷膿瘍中見(jiàn)有微小的革蘭陽(yáng)性抗酸陰性的人即稱之為Much顆粒。有人對(duì)23份結(jié)核痰標(biāo)本涂片檢查發(fā)現(xiàn)單有典型抗酸菌者僅21.7%，而單有L型者占34.8%，二者均有者占52.2%。說(shuō)明在結(jié)核患者中，L型常比細(xì)菌型還多見(jiàn)。這是結(jié)核菌L型的特點(diǎn)，在臨床診斷中應(yīng)于重視。 結(jié)核菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，在細(xì)胞膜外有兩層結(jié)構(gòu)，里層緊貼在細(xì)胞膜外為較厚的肽聚糖層，外

7、層為分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖8。肽聚糖比較堅(jiān)硬決定細(xì)菌的形態(tài)，其不同程度的缺失是造成L型形態(tài)多變的原因。外層為分枝菌酸，決定結(jié)核菌的抗酸性。分枝菌酸層的缺失可使結(jié)核菌L型失去原有的抗酸特性，變?yōu)榭顾彡幮?。結(jié)核菌L型由于兩層細(xì)胞壁可有不同程度不同的缺失，是造成結(jié)核菌形態(tài)多樣（可呈圓球體、大小顆粒、粗細(xì)桿狀或長(zhǎng)絲體）和染色多變（抗酸陽(yáng)性或陰性）的原因。 在分枝菌酸層上尚連接著大量糖脂，有的有決定結(jié)核菌抗原特性的作用，隨上層的缺損，脂多糖的減少，抗原性減弱。有的結(jié)核菌脂質(zhì)為海藻糖-66-二分枝菌酸，又稱束狀因子，使結(jié)核菌呈平行排成長(zhǎng)束。結(jié)核菌L型常見(jiàn)有的抗酸顆粒呈串珠狀或長(zhǎng)絲糾纏成團(tuán)，可能與之有關(guān)。

8、 結(jié)核菌變?yōu)長(zhǎng)型后，隨細(xì)胞壁的缺失，細(xì)胞膜能代償性增厚，在透射電鏡照片中可見(jiàn)結(jié)核菌L型細(xì)胞壁消失，而有厚厚的一層細(xì)胞膜圍繞在細(xì)胞周圍。用計(jì)算機(jī)處理，50個(gè)L型的細(xì)胞膜平均厚度為34.84nm。L型細(xì)胞膜的厚度可比細(xì)菌型細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的厚度還大(P0.001)9。這可能與結(jié)核菌L型抵抗力較大、耐藥性增強(qiáng)的原因之一。在作PCR檢測(cè)時(shí)一般裂解方法不易提取DNA，可造成假陰性。 致 病 性一、致病物質(zhì)莢膜脂質(zhì)蛋白質(zhì)1、莢 膜成分多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)有助于粘附與入侵可降解宿主組織中的大分子物質(zhì)，為細(xì)菌繁殖提供營(yíng)養(yǎng)防止宿主的有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌可抑制吞噬體與溶酶體的融合2、脂 質(zhì)索狀因子磷脂硫酸腦苷脂蠟質(zhì)D(1

9、) 索狀因子由分枝菌酸和海藻糖結(jié)合的一種糖脂能使細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中呈蜿蜒索狀排列是重要的致病物質(zhì)，若將其從細(xì)菌中提出，則細(xì)菌喪失毒力能破壞細(xì)胞線粒體膜，影響細(xì)胞呼吸抑制白細(xì)胞游走和引起慢性肉芽腫(2) 磷 脂促使單核細(xì)胞增生與結(jié)核結(jié)節(jié)的形成有關(guān)(3) 硫酸腦苷脂抑制吞噬細(xì)胞中吞噬體與溶酶體的結(jié)合使細(xì)菌能在吞噬細(xì)胞中長(zhǎng)期存活(4) 蠟質(zhì)D肽糖脂和分枝菌酸的復(fù)合物具有佐劑作用，可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)3、蛋白質(zhì)有抗原性，和蠟質(zhì)D結(jié)合后能使機(jī)體發(fā)生超敏反應(yīng)在形成結(jié)核結(jié)節(jié)中發(fā)揮一定作用二、所致疾病感染方式呼吸道、消化道或皮膚損傷等多途徑侵入機(jī)體所致疾病疾病種類多樣化以肺結(jié)核最為常見(jiàn)1、肺部感染原發(fā)

10、感染多發(fā)生于兒童原發(fā)綜合征形成結(jié)核結(jié)節(jié)（即結(jié)核肉芽腫）轉(zhuǎn)歸原發(fā)后感染 (繼發(fā)性結(jié)核)2、肺外感染部分患者結(jié)核分枝桿菌可進(jìn)入血液循環(huán)引起肺內(nèi)、外播散，如腦、腎結(jié)核痰菌被咽入消化道或食入了消毒不嚴(yán)格的牛奶也可引起腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎等大多與結(jié)核分枝桿菌L型有關(guān)免疫機(jī)制屬胞內(nèi)感染菌，其免疫主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫結(jié)核的免疫屬于感染免疫(infection immunity)，又稱有菌免疫三、免 疫 性免疫與超敏反應(yīng)細(xì)胞免疫為主,遲發(fā)型超敏反應(yīng)同時(shí)存在郭霍現(xiàn)象再感染時(shí)潰瘍淺、易愈合、不擴(kuò)散，表明機(jī)體已有一定免疫力但再感染時(shí)潰瘍發(fā)生快，說(shuō)明在產(chǎn)生免疫的同時(shí)有超敏反應(yīng)的參與結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫

11、和超敏反應(yīng)的物質(zhì)：免疫反應(yīng)是由結(jié)核菌核糖體的rRNA刺激引起; 超敏反應(yīng)則由結(jié)核菌素蛋白和脂質(zhì)D刺激引起。結(jié)核菌素試驗(yàn)是應(yīng)用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)來(lái)測(cè)定機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌是否能引起遲發(fā)性超敏反應(yīng)（型變態(tài)反應(yīng)）的一種試驗(yàn)結(jié)核菌素試劑舊結(jié)核菌素（old tuberculin，OT)每0.1ml含5單位純蛋白衍化物(purified protein derivative，PPD)人結(jié)核分枝桿菌制成的PPD-C卡介苗制成的BCG-PPD每0.1ml含5單位試驗(yàn)方法與意義2種PPD各5個(gè)單位兩前臂皮內(nèi)注射4872h后紅腫硬結(jié)超過(guò)5mm者為陽(yáng)性15mm為強(qiáng)陽(yáng)性，對(duì)臨床診斷有意義陰性反應(yīng)應(yīng) 用選擇卡介苗接種對(duì)

12、象和測(cè)定卡介苗接種后的免疫效果，結(jié)核菌素試驗(yàn)陰性者應(yīng)接種或補(bǔ)種卡介苗。在未接種卡介苗的人群中作結(jié)核桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查,了解人群自然感染率作為嬰幼兒(尚未接種過(guò)卡介苗者)結(jié)核病的輔助診斷測(cè)定腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能四、結(jié)核菌L型的致病性1、結(jié)核菌L型的致病機(jī)制： 一般認(rèn)為結(jié)核菌轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)型后致病性減弱，引起癥狀與病理變化很不典型，在臨床上容易引起誤診。 結(jié)核菌L型仍有致病性。動(dòng)物解剖見(jiàn)有淋巴結(jié)腫大。組織切片見(jiàn)各臟器均有L型引起的典型間質(zhì)性炎癥，血管高度擴(kuò)張，周圍有淋巴細(xì)胞增生形成濾泡。淋巴結(jié)內(nèi)有大片干酪樣壞死，但無(wú)上皮樣細(xì)胞和Langhans巨細(xì)胞形成的典型結(jié)核結(jié)節(jié)。動(dòng)物OT試驗(yàn)始終陰性。 結(jié)核

13、感染引起的免疫反應(yīng)是由結(jié)核菌核糖體的rRNA刺激引起；超敏反應(yīng)則由結(jié)核菌素蛋白和脂質(zhì)D刺激引起。結(jié)核菌L型細(xì)胞壁表面脂質(zhì)缺失，故感染后OT試驗(yàn)可始終陰性。 L型失去細(xì)胞壁脂質(zhì)，不能引起典型病變，因無(wú)典型結(jié)核結(jié)節(jié)故常被診斷為慢性淋巴結(jié)炎。若不加做結(jié)核菌L型檢查可引起大量漏診與誤診。 2、結(jié)核菌L型感染的臨床特點(diǎn) (1) 起病緩慢，病程長(zhǎng)，延誤診斷多 病程越長(zhǎng)痰菌L型陽(yáng)性率越高。有些病例癥狀輕微，甚至表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)性結(jié)核病。唐神潔等對(duì)臨床肺結(jié)核患者痰作L型檢測(cè)，病程越長(zhǎng)陽(yáng)性率越高，病程1年者陽(yáng)性率71.74%。有空洞組L型陽(yáng)性率（71.19%）高于無(wú)空洞組（50.77%）。敏感組L型陽(yáng)性率46.15

14、%，耐藥組72.55%，多耐組81.82%13。Insanova報(bào)道結(jié)核性腦膜炎患兒腦脊液中若找到的是結(jié)核菌細(xì)菌型，往往發(fā)病急，但療效較好。若找到僅有L型，則發(fā)病緩慢，逐漸加重，療效較差。 (2) X光檢查常表現(xiàn)有局部間質(zhì)性炎癥，浸潤(rùn)和播散性病灶較少見(jiàn)。 (3)涂片抗酸染色鏡檢和結(jié)核菌常規(guī)培養(yǎng)常為陰性，給臨床診治帶來(lái)很大困難。 (4) 復(fù)治和難治病例50%L型培養(yǎng)陽(yáng)性 給臨床治療增加難度的原因：耐藥患者L型培養(yǎng)陽(yáng)性率顯著高于敏感患者(P0.05)，如異煙肼作用于細(xì)胞壁的分枝菌酸故可誘導(dǎo)多種分枝桿形成L型而導(dǎo)致耐藥，且耐藥組和多耐組L型檢出率比非耐藥組高。L型大多寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)，抵抗藥物的治療

15、。L型細(xì)胞壁缺失，抗原物質(zhì)減少，容易逃避機(jī)體免疫的攻擊。 (5)結(jié)核菌L型感染與體質(zhì)遺傳有關(guān)。 Prospelov等對(duì)150例浸潤(rùn)性結(jié)核病患者與150例健康人作HLA定型比較?；颊咧蠥11、B12、CW2、DR2、DR5明顯高于對(duì)照，進(jìn)行性與播散性結(jié)核患者中DR2較多，而有L型患者則以DR5較多。遺傳是通過(guò)什么機(jī)制有利于結(jié)核菌在體內(nèi)變?yōu)長(zhǎng)型的尚有待研究。但HLA與致病的關(guān)系和人的種族有關(guān)，各種族的人對(duì)疾病敏感的HLA并不相同。中國(guó)人對(duì)結(jié)核菌L型感染敏感的HLA是否也與DR5有關(guān)，當(dāng)進(jìn)一步研究。 標(biāo)本取材標(biāo)本的選擇根據(jù)感染部位四、微生物學(xué)檢查法直接涂片鏡檢標(biāo)本直接涂片或集菌后涂片，抗酸染色若找到

16、抗酸陽(yáng)性菌即可初步診斷先集菌后檢查，可提高檢出率腦脊液和胸、腹水可直接離心沉淀集菌痰、支氣管灌洗液、尿、糞等污染標(biāo)本需經(jīng)4% NaOH處理后離心沉淀濃 縮 集 菌結(jié)核桿菌L型的培養(yǎng)： 結(jié)核菌變L型后形態(tài)染色多變，常需培養(yǎng)作最后確診。但一般常用的羅氏（Lowenstein-Jensen）培養(yǎng)基不適合于L型的生長(zhǎng)。有人曾對(duì)23例疑診為結(jié)核患者的痰作涂片抗酸染色鏡檢，包括細(xì)菌型與L型陽(yáng)性率為52.2%，而在羅氏培養(yǎng)基上僅7.7%。莊玉輝等1984根據(jù)Takahashi的方法制備出改良TSA-L培養(yǎng)基，在國(guó)內(nèi)首先誘導(dǎo)和培養(yǎng)出結(jié)核菌L型。分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，一般需24周長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的落菌 蚌埠

17、醫(yī)學(xué)院1992也制備出92-3TBL培養(yǎng)基。這是一種液體培養(yǎng)基，結(jié)核菌與L型均可生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)1-2周即可見(jiàn)管底有絮狀或顆粒生長(zhǎng)，吸取沉淀涂片染色鏡檢即可。結(jié)核菌與L型在液體培養(yǎng)基中可能由于接觸營(yíng)養(yǎng)面較廣所以生長(zhǎng)迅速。戴云海等以此培養(yǎng)基對(duì)766份標(biāo)本（痰516份、尿62份、胸水88份、腹水26份、腦脊液29份、支氣管灌洗液45份）進(jìn)行分離，并作涂片比較。涂片抗酸染色細(xì)菌型、L型和總陽(yáng)性率分別為21.27%、23.1%和37.6%。用92-3TBL培養(yǎng)結(jié)果為36.1%、44.1%和51.8%，陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于羅氏培養(yǎng)基。 結(jié)核菌L型鑒別培養(yǎng) 應(yīng)用硝基苯甲酸（PNB）與2-羧酸肼（T2H）

18、分別制備的培養(yǎng)基可鑒別人型、牛型和非結(jié)核分枝桿菌，但此培養(yǎng)基不適合于L型生長(zhǎng)。調(diào)整藥物濃度分別加于92-3TBL培養(yǎng)基中使其適合于細(xì)菌型與L型二者的生長(zhǎng)。PNB可抑制人型與牛型結(jié)核菌，T2H可抑制牛型結(jié)核菌，而在純92-3TBL中則人、牛與非結(jié)核分枝桿菌均可生長(zhǎng)。將標(biāo)本分別種入三種培養(yǎng)基即可用以鑒定型別。戴云海用此培養(yǎng)基對(duì)48份標(biāo)本進(jìn)行鑒定，結(jié)果分出人型8.3%、牛型4.17%、非結(jié)核分枝桿菌12.5%40。將集菌后的材料注射于豚鼠腹股溝皮下，34周后若局部淋巴結(jié)腫大，結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)，即可進(jìn)行解剖觀察肺、肝、淋巴結(jié)等器官有無(wú)結(jié)核病變，并作形態(tài)、培養(yǎng)等檢查動(dòng)物試驗(yàn)快速診斷多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌DNA鑒定，每ml中只需含幾個(gè)細(xì)菌即可獲得陽(yáng)性，且12d得出結(jié)果操作中需注意實(shí)驗(yàn)器材的污染問(wèn)題，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)核菌變?yōu)長(zhǎng)型后，隨細(xì)胞壁的缺失，細(xì)胞膜能代償性增厚，在作PCR檢測(cè)時(shí)一般裂解方法不易提取DNA，可造成假陰性。 預(yù) 防近