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文檔簡介
1、特應(yīng)性過敏原(中國組合)檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程1方法歐蒙印跡法2原理用于體外半定量檢測人血清或血漿中吸入性和食物性過敏 原特異性IgE抗體。試劑盒中的檢測膜條上平行包被了 21種不同的吸入性和食 物性過敏原。經(jīng)緩沖液預(yù)處理的檢測膜條與患者樣本進(jìn)行第一步 溫育。如果樣本陽性,IgE類特異性抗體與相應(yīng)的過敏原結(jié)合。 為檢測結(jié)合的抗體,加入酶標(biāo)單克隆的抗人IgE抗體(酶結(jié)合物) 進(jìn)行第二步溫育,然后加入酶底物,發(fā)生顏色反應(yīng)。3試劑品牌、編號(hào)、代號(hào)、包裝、規(guī)格(表1)表1德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司試劑訂貨號(hào)靶抗原Ig類別基質(zhì)規(guī)格DP 3713-1601 E吸入性和食物過 敏原IgE包被有過敏原的 檢
2、測膜條16 01(16)4試劑成分4.1 包被過敏原的檢測膜條:ts20, w1, w6, ds1, h1, e1, e2, i6, ms1,u80, fl, f2, f13, f14,f27,f88, fs33, fs34, f23, f234,CCD。酶結(jié)合物:堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE (小鼠),直接使用。4.色原/底物液:四唑硝基苯胺蘭/5-澳-4-氯啶-3-吲哚-磷酸鹽 (NBT/BCIP),直接使用。1/8通用緩沖液:10倍濃縮。5儀器品牌、型號(hào) 搖床、掃描儀6檢測時(shí)間 根據(jù)樣本稀釋度與加樣量不同檢測時(shí)間略有不同。7標(biāo)本要求 待測樣本在2-8可以穩(wěn)定14天,已稀釋的樣本應(yīng) 在同一個(gè)
3、工作日內(nèi)檢測。8試劑準(zhǔn)備 同一批號(hào)試劑盒中各個(gè)組分互相匹配,不能與其它 批號(hào)試劑盒中的組份混用。所有試劑均應(yīng)在室溫(18-25)平 衡30分鐘后方可使用;液體試劑使用前應(yīng)充分混勻。從第一次 使用起,試劑盒如保存在2-8,并且在沒有污染的情況下,可 穩(wěn)定至所標(biāo)示的有效期。9操作步驟預(yù)處理:當(dāng)膜條平衡到室溫后打開包裝,取出所需的膜后應(yīng) 立即密封好原包裝并將其保存于2-8。先將10倍濃縮的通用緩 沖液充分混勻,如需溫育一條檢測膜條,可取5ml濃縮緩沖液加 入到45ml蒸餾水或去離子水中進(jìn)行稀釋。稀釋后的緩沖液應(yīng)在 同一個(gè)工作日用完。將模條上有編碼的一面朝上放入溫育槽中, 用移液槍吸取1ml的稀釋好的
4、通用緩沖液加入到溫育槽中,于室 溫條件下在搖擺搖床上溫育5分鐘。溫育結(jié)束后吸去溫育槽中的 液體。血清溫育:手動(dòng)第一次A (省時(shí)):在溫育槽中分別加入1ml未稀釋的患者樣本,2/8 室溫條件下(18-25 )在搖擺搖床上溫育60分鐘。B (省血清量):用已稀釋的通用緩沖液按照1:11的比例稀 釋血清或血漿樣本,取100ul血清加入到1ml已稀釋的通用緩沖 液中,并用漩渦混勻器充分混勻。在溫育槽中分別加入1ml已稀 釋的患者樣本,室溫條件下(18-25)在搖擺搖床上溫育過夜 (至少12小時(shí))溫育時(shí)需要加蓋以防止樣本液體揮發(fā)。C (兼具省時(shí)和省血清量):用移液槍吸取400”未稀釋的 患者樣本加入到特
5、殊定溫育槽(ZD 9897-0130)中,室溫條件下 (18-25 )在搖擺搖床上溫育60分鐘。自動(dòng):方案B中,用已稀釋的通用緩沖液按照1:11的比例稀釋血清或 血漿樣本,取150ul血清加入到1.5ml已稀釋的通用緩沖液中, 并用漩渦混勻器充分混勻。反應(yīng)液體的量為1.65ml,進(jìn)行過夜溫 育。清洗:動(dòng):吸去溫育槽內(nèi)液體,再槽內(nèi)加入1ml的稀釋好的通用緩沖液,在 搖擺搖床上清洗膜條5分鐘,然后將吸去通用緩沖液。重復(fù)以上 步驟兩次。自動(dòng):1:11稀釋樣本過夜溫育的方案b中,第一步清洗時(shí)緩沖液的量為1750ul。3/8酶結(jié)合物溫育第二次:將1ml的酶結(jié)合物(堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgE, 單克隆)加
6、入到溫育槽中,于室溫(18-25)在搖擺搖床上溫 育60分鐘。清洗:吸去槽內(nèi)液體,再槽內(nèi)加入1ml稀釋好的通用緩沖液, 在搖擺搖床上清洗膜條5分鐘,然后將吸去通用緩沖液。重復(fù)以 上步驟兩次。色原/底物溫育第三次:在溫育槽中分別加入1ml色原/底物液,在溫育槽上 放置一個(gè)遮擋物,于室溫條件下(18-25 )在搖擺搖床上溫育 10分鐘。終止:吸去槽內(nèi)液體,用蒸餾水清洗膜條3次,每次1分鐘。風(fēng)干膜條:將濕潤的檢測膜條放置在結(jié)果判定模板中的塑料 膜上,并與標(biāo)志對(duì)齊,用吸水紙小心吸去水分,風(fēng)干至少30分 鐘后,膜條完全干燥并粘附于塑料膜上。在歐蒙印跡法自動(dòng)操作儀(EUROBlotMaster)中使用該產(chǎn)
7、品時(shí), 請(qǐng)選擇方法列表中的EURO11 ALLERG EL60 (方案a與c)或 者 EURO12 ALLERG 16h (方案 b).10質(zhì)量控制10.1檢測膜條的下端有一條指示帶,如果這條指示帶出現(xiàn)清洗可 見的顏色反應(yīng)說明實(shí)驗(yàn)操作正確。11結(jié)果判斷4/8完全干透的檢測膜條上出現(xiàn)的清晰可見的膜條記錄于結(jié)果判 讀模板上。膜條包被抗原的位置出現(xiàn)的白色條帶應(yīng)判為陰性。如采用EUROLineScan評(píng)價(jià)結(jié)果,則按照上說方法將檢測膜 條放置在相應(yīng)的綠色工作紙上,進(jìn)入EUROLineScan軟件,輸入 相應(yīng)的Test代碼。如需長期保存檢測膜條,可用粘性塑料膜密封。 在判斷結(jié)果時(shí)必須考慮到條帶的位置和顏色
8、強(qiáng)度。通過比較結(jié)果 判斷模板和已溫育的檢測膜條可確定抗相應(yīng)過敏原IgE抗體。條 帶的顏色強(qiáng)度可分為4類:類別結(jié)果條帶特性0陰性;無臨床意義未出現(xiàn)條帶+低濃度抗過敏原IgE抗體;部分臨床意義弱條帶+中等濃度抗過敏原IgE抗體;通常具有臨床意義清晰的條帶+高濃度抗過敏原IgE抗體;許多病例出現(xiàn)臨床癥狀染色很深的條帶當(dāng)采用“EUROLineScan ”軟件判斷結(jié)果時(shí),條帶顏色的深 淺用 EAST 類別 0-6 表示。EAST 為 Enzyme-Allergen-Sorbent Test(酶過敏原吸附試驗(yàn))的縮寫,其采用的濃度等級(jí)等同于過敏 原診斷公認(rèn)的RAST(放射過敏原吸附試驗(yàn))系統(tǒng)。5/8根據(jù)濃
9、度進(jìn)行的分類見下表:類別濃度kU/l結(jié)果0 100 kU/l特異性抗體滴度很高。12臨床意義過敏反應(yīng)是一種對(duì)異物的超敏反應(yīng)。這些異物通常無害,但 在過敏反應(yīng)患者中,則產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)。除了遺傳易感性,其他 非遺傳因素,像過敏原接觸,營養(yǎng)狀況,慢性疾病或病毒急性感 染也在過敏反應(yīng)具有一定的作用。特應(yīng)性過敏反應(yīng)是一種遺傳性 疾病。最常見的過敏反應(yīng)為I型過敏反應(yīng),其特征是形成特異性 IgE抗體。一旦跟過敏原接觸很快就會(huì)產(chǎn)生諸如發(fā)紅,水腫以及 瘙癢等癥狀。在工業(yè)化國家,超過15%的人患有立即過敏性反應(yīng)。典型的過敏反應(yīng)有鼻炎、通常所說的花粉熱、結(jié)膜炎和哮喘。 接觸過敏原的次數(shù)越多,過敏反應(yīng)就會(huì)越嚴(yán)重。如果
10、發(fā)生系統(tǒng)性 過敏反應(yīng),可能會(huì)出現(xiàn)危及生命的嚴(yán)重反應(yīng)(全身性過敏反應(yīng))。 吸入性過敏反應(yīng)可由季節(jié)性過敏原(樹、草或種子的花粉)引起, 也可由常年性過敏原(塵螨、霉菌抱子、寵物的唾液和皮屑)引 起。除了空氣傳播的過敏原(如花粉、灰塵和霉菌)可引起過敏 反應(yīng)外,還有食物也可引起過敏反應(yīng)。最常見的食物過敏原有花6/8 生、大豆、小麥、貝類、魚、牛奶、蛋類和堅(jiān)果。食物過敏反應(yīng)是IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng),在攝入食物后的幾 個(gè)小時(shí)內(nèi)可出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀??赡艿陌Y狀為唇、舌、喉部灼痛或 瘙癢、惡心、腹部痙攣、腹瀉和紅斑,甚至可出現(xiàn)哮喘、氣短、 心跳加速、恐慌和精神錯(cuò)亂。有時(shí)堅(jiān)果、貝類、魚和花生甚至能 引起全身型過敏性反應(yīng)或者致死性過敏反應(yīng)。由于保守的植物性過敏原引發(fā)的IgE抗體和相關(guān)植物制作 的食物或者非食物類過敏原發(fā)生交叉反應(yīng)。如對(duì)于白樺樹花粉過 敏的患者可能對(duì)蘋果、胡蘿卜、芹菜、榛果、馬鈴薯或者獼猴桃 過敏。許多過敏原是含有低聚糖側(cè)鏈的糖蛋白類,這些側(cè)鏈結(jié)合在 過敏原的蛋白骨架上。有時(shí),患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)這種糖類結(jié)構(gòu) 的抗體。CCD是“引起交叉反應(yīng)的糖類抗原決定簇”的簡寫。CCD普遍存在于大量植物或動(dòng)物類過敏原中。由于它們結(jié) 構(gòu)的相似性,CCD可引起很強(qiáng)的交叉反因。盡管,目前對(duì)抗CCD 類I
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