一株抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生細(xì)菌的分離及鑒定

1、一株抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生細(xì)菌的別離及鑒定摘要：從根際土壤別離到一株細(xì)菌CY04，通過(guò)電鏡觀察和16S rDNA 序列分析，發(fā)現(xiàn)該菌株同菌枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的相似度最高，為99%， 初步認(rèn)定為枯草芽孢桿菌。抑菌試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，該菌株對(duì)金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus有一定的抑菌活性，對(duì)大腸桿菌Escherichia coli和枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑菌活性。培養(yǎng)48 h左右是其產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的最正確時(shí)期。關(guān)鍵詞：根際土壤;枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis;鑒定;抑菌活性Isolation and Identification of One

2、Strain Producing Antimicrobial Active SubstanceYIN Jie，WANG MENG，ZENG Xiao-bo，MA Zhi-yong，CHENG Guo-junCollege of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， ChinaAbstract：A bacterium strain， designated as CY04， was isolated from the rhizosphere soil. The strain CY04 had

3、the highest sequence identity with Bacillus subtilis 99%. Based on morphological characteristics and analysis of the 16S rDNA sequence， the strain CY04 was identified as Bacillus subtilis. The antagonistic effects showed that CY04 had antimicrobial activity on Staphylococcus aureus， but had little i

4、nhibition on Escherichia coli and Bacillus subtilis. The optimal time for the resistant bacteria to produce antimicrobial active substance was 48h after cultivation.Key words： rhizosphere soil;Bacillus subtilis;identification;antimicrobial activity目前枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括細(xì)菌素、脂肽類抗生素以及酶類、蛋白類抑菌物質(zhì)等3。從枯草芽孢桿

5、菌中別離的Fengycin可以抑制多種重要植物病原真菌的生長(zhǎng)4。本研究從根際土壤樣品中別離到一株能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的細(xì)菌CY04，并根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA基因序列對(duì)其進(jìn)展了鑒定，初步認(rèn)定其為枯草芽孢桿菌，同時(shí)對(duì)它的拮抗情況及產(chǎn)生原因進(jìn)展了討論。1 材料與方法1.1 抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌種的挑選在LB平板上觀察菌落形態(tài)，利用革蘭氏染色法在油鏡下觀察菌體形態(tài)。將菌株用戊二醛固定，PBS洗滌和梯度乙醇脫水，真空冷凍枯燥機(jī)枯燥1.3 CY04細(xì)菌16S rDNA基因序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析以大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌為指示菌，采用牛津杯內(nèi)徑6 mm，外徑8

6、 mm法測(cè)定菌株CY04對(duì)不同指示菌拮抗才能7。取已活化的指示菌菌液接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 、20 r/min培養(yǎng)24 h。倒牛肉膏蛋白胨平板，在每個(gè)平板的中央置一個(gè)已滅菌的牛津杯，汲取指示菌菌懸液在平板上均勻涂布，待平板晾干后進(jìn)展抑菌試驗(yàn)。將CY04菌株培養(yǎng)液離心，取上清液參加到牛津杯中，37 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察生長(zhǎng)情況并測(cè)量抑菌圈直徑。將活化后的菌株CY04按2%的接種量接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，每隔6 h取菌液離心，將上清液參加到牛津杯中，測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑，確定產(chǎn)生活性物質(zhì)的最正確時(shí)期。1.5 菌株CY04的抗性測(cè)定以抗生素卡那霉素Km、氨芐青霉素

7、Ap、鏈霉素Str、四環(huán)素Tc、慶大霉素Gm、氯霉素Cm、壯觀霉素Spe為抗生活性物質(zhì)，測(cè)定菌株CY04對(duì)抗生活性物質(zhì)的抗性。將菌株CY04接種到LB培養(yǎng)液中，37 搖床培養(yǎng)過(guò)夜。按2%的接種量將菌株接種于含不同濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定含各種不同濃度抗生活性物質(zhì)菌液的吸光度，分析菌株CY04生長(zhǎng)情況。2 結(jié)果與分析2.1 菌株CY04挑選及形態(tài)觀察進(jìn)展細(xì)菌單株別離、挑選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株CY04對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的拮抗作用。菌株CY04革蘭氏染色為陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢，其形態(tài)特征見圖1。細(xì)菌大小為0.30.5 m1.53.0 m。2.2 菌株CY0

8、4的16S rDNA測(cè)序結(jié)果以菌株CY04的DNA為模板進(jìn)展擴(kuò)增，獲得1.5 kb左右的特異性片段，將測(cè)序結(jié)果和GenBank已登錄的序列進(jìn)展同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Bacillus中多個(gè)種的序列具有高度同源性;與Bacillus subtilis同源性最高，到達(dá)99%。2.3 菌株CY04的系統(tǒng)進(jìn)化樹2.3 菌株CY04的抑菌活性2.4 菌株CY04代謝活性物質(zhì)產(chǎn)生時(shí)期的測(cè)定每隔6 h取樣進(jìn)展抑菌圈測(cè)定發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48 h左右培養(yǎng)液產(chǎn)生的抑菌圈最大，進(jìn)而可以推斷菌株CY04在48 h左右產(chǎn)生的活性物質(zhì)最多，其產(chǎn)生活性物質(zhì)的時(shí)間在其生長(zhǎng)穩(wěn)定后期，這與已有的報(bào)道一致1。2.5 菌株CY04的抗性3 小結(jié)

9、與討論微生物殺菌劑具有高效、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，因此有廣闊的應(yīng)用前景?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)已有相關(guān)報(bào)道8-10。本研究從根際土壤中別離到的細(xì)菌菌株CY04根據(jù)形態(tài)學(xué)特征以及16S rDNA序列比較鑒定為枯草芽孢桿菌。菌株CY04對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較明顯，說(shuō)明CY04產(chǎn)生的抗生活性物質(zhì)具有選擇性毒力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CY04對(duì)除壯觀霉素外的其他幾種抗生素的抗性均較低，說(shuō)明CY04菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，是其可以在環(huán)境中生存的有效防衛(wèi)機(jī)制。參考文獻(xiàn)2 STEIN T. Bacillus subtilis antibiotics： Struc

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